一种三疣梭子蟹几丁质酶基因及其重组表达蛋白和应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种三疣梭子蟹几丁质酶基因及其重组表达蛋白和应用。

背景技术：

三疣梭子蟹(portunustrituberculatus)隶属于节肢动物门、甲壳纲、十足目、梭子蟹科、梭子蟹属，是我国重要的海水养殖品种，具有生长快、肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富等优点，是经济价值高的重要海产品。但随着养殖环境的不断恶化增加了蟹患病的可能性，很大程度上制约了蟹的发展，为减少外源药物的使用，实现生态养殖和追求利益最大化，三疣梭子蟹自身免疫防御能力的提高和有效的新型药物的研究就显得尤为重要。

几丁质酶(chitinase)是一种广泛存在于节肢动物，可通过裂解病原菌细胞壁中几丁质(chitin)从而发挥免疫功能的关键酶类。通过研究几丁质酶ptcht4基因的结构与功能，进而实现重组蛋白的体外抑菌。目前尚未见三疣梭子蟹几丁质酶基因体外抑菌的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种三疣梭子蟹几丁质酶基因的重组表达蛋白及其在体外抑菌中的应用，所述ptcht4基因的重组蛋白具有显著的抗菌作用，为增强三疣梭子蟹对病原菌的抵御能力提供了实验支持。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种三疣梭子蟹几丁质酶ptcht4基因，其核苷酸序列表如seqidno：1所示。

本发明还提供了所述的三疣梭子蟹几丁质酶ptcht4基因翻译产生的几丁质酶，其氨基酸序列如seqidno：2所示。

本发明提供了所述的三疣梭子蟹几丁质酶ptcht4基因产生的重组表达蛋白，它的制备方法包括以下步骤：

(1)克隆几丁质酶基因；

(2)重组表达载体的构建：对几丁质酶基因进行开放阅读框的扩增，对pcr产物和pet-28a质粒进行双酶切，并进行pcr扩增，回收纯化产物，将连接体系和感受态细胞混合，加入培养基，涂板培养，以t7、t7teminator引物筛选目的菌株；

(3)重组蛋白的诱导表达：将目的菌株接种于培养基培养，转移到感受态细胞，将得到的菌株进行诱导表达；

(4)重组蛋白的分离纯化：将诱导表达成功后的菌株扩大培养，将得到的菌体加入裂解液，超声破碎后离心，得到以包涵体的形式在表达菌株中存在的目的蛋白，将包涵体洗涤、纯化；

(5)重组蛋白的复性：将纯化后的重组蛋白装入透析袋，依次用透析液透析，最后离心、取上清，得到重组表达蛋白。

进一步的：所述步骤(2)中双酶切采用分步酶切，使用的限制性内切酶为bamhi和noti。

进一步的：所述步骤(2)中所述分步酶切的方法为：首先将含有bamhi的pcr扩增体系在pcr仪中30℃反应10min，再向反应液中加入2ul的noti，混匀离心后，在pcr仪中37℃反应10min。

进一步的：所述pcr扩增体系为：10×quickcutbuffer，10μl；纯化pcr产物/pet-28a，10μl/45μl；quickcutbamhi，2μl；补灭菌ddh2o至100μl。

进一步的：所述步骤(2)中t7，t7teminator引物为：

t7：5′-taatacgactcactataggg-3′；

t7teminator：5′-gctagttattgctcagcgg-3′。

进一步的：所述步骤(3)中诱导条件为添加终浓度为1.0mm的iptg于37℃下诱导6h。

本发明还提供了所述的三疣梭子蟹几丁质酶基因的重组表达蛋白在制备抑菌剂中的应用。

进一步的：所述抑菌剂中重组表达蛋白的浓度为5mg/ml-25mg/ml，所述抑菌剂用于抑制副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果为：本发明通过进行三疣梭子蟹几丁质酶ptcht4基因克隆，利用ptcht4基因编码蛋白的核苷酸序列构建原核表达载体，筛选出一种能够高效表达三疣梭子蟹ptcht4基因重组蛋白的表达体系，通过蛋白纯化与复性获得能够正确折叠且具有活性的重组蛋白。

本发明将重组蛋白用于体外抑菌，不断摸索和优化抑菌条件，最终确定不同浓度的ptcht4重组蛋白对不同菌的抑制效果，ptcht4基因属于三疣梭子蟹的内源基因，由此表达产出的蛋白制成的药物使机体不会产生排斥反应，且能够激发机体的非特异性免疫系统，降低细菌的耐药性，体外抑菌技术的实现可为蟹类新型药物的研究提供了理论基础和实验支持。

附图说明

图1为ptcht4原核表达重组蛋白及纯化结果，a.未诱导对照；b.诱导的实验组；c.破碎后的重组蛋白；d.破碎后上清；e.破碎后沉淀(包涵体)；f.包涵体溶解后未纯化的重组蛋白；g.纯化后的重组蛋白；

图2为不同浓度的ptcht4重组蛋白复性液对不同细菌抑菌率。

具体实施方法

下面通过具体实施例和结果图对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1

一、三疣梭子蟹几丁质酶ptcht4基因的克隆

根据三疣梭子蟹转录组数据库中几丁质酶基因的est序列，利用primerpremier5.0软件设计3′和5′race特异性引物和通用引物upm/nup，使用race技术克隆ptcht4基因。本实施例用到的引物信息见表1。

表1引物信息

ptcht4基因的cdna自5′端至3′端序列为(如seqidno：1所示)：

序列特征：ptcht4基因由1549个核苷酸组成，为双链cdna分子，线性拓扑结构。

ptcht4基因的核苷酸序列编码的氨基酸序列为(如seqidno：2所示)：

序列特征：ptcht4基因的cdna共编码462个氨基酸，理论pi值为5.03，分子量mw51.171da。

二、三疣梭子蟹几丁质酶ptcht4基因的重组蛋白的制备

1、重组表达载体的构建

1)开放阅读框的扩增

根据ptcht4基因编码蛋白的核苷酸序列，综合考虑pet-28a表达载体的多克隆位点和基因的限制性内切酶位点(bamhi、noti)，利用primerpremier5.0软件设计引物，在上游引物和下游引物的5′端引入酶切位点和保护碱基，合成引物

pcr扩增目的基因开放阅读框(orf)。利用紫外分光光度计和1％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物的质量和浓度，切胶回收。

2)双酶切

用限制性内切酶bamhi和noti对pcr产物和pet-28a质粒进行双酶切，采用分步酶切，进行pcr扩增，体系见表2。

表2pcr扩增体系

pcr仪中30℃反应10min。反应结束后，向反应液中加入2ul的noti，短暂离心后，pcr仪，37℃，反应10min。1％的琼脂糖凝胶电泳切胶回收，紫外分光光度计检测酶切后pcr产物和pet-28a质粒浓度分别为74.5ng/μl、57.3ng/μl。

3)回收产物连接，连接体系见表3，混匀，短暂离心，pcr仪22℃反应20min。

表3pcr产物连接体系

4)将20μl连接产物与100μldh5α感受态细胞混合，冰上静置30min，42℃金属浴热激90s后，冰浴2min，向离心管中加入900ul无菌无抗的lb培养基，37℃180rpm振荡培养1h，使质粒上相关的抗性标记基因表达，菌体复苏。涂板于含100μg/ml卡那霉素的lb平板上，37℃，过夜培养。挑取阳性单克隆，以t7，t7teminator引物进行菌落pcr鉴定后筛选目的菌液进行测序。

t7：5′-taatacgactcactataggg-3′(seqidno：12)；

t7teminator：5′-gctagttattgctcagcgg-3′(seqidno：13)。

2、重组蛋白的诱导表达

1)表达菌株的构建

对测序正确的构建好的质粒菌株按1：100接种于含有100μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，37℃培养12h后提取质粒并按照上述方法将重组质粒转移至rosetta(de3)感受态细胞中，并挑选出阳性克隆进行测序，得到的测序正确的菌种作为种子菌保存。

2)重组菌株的诱导表达

种子菌1∶100接种于含有100μg/ml卡那霉素的100mllb液体培养基中，37℃，200rpm进行培养至od600＝0.5～0.6，将菌悬液平均分到10ml离心管中，分别加入终浓度0.1mm、0.5mm、0.8mm、1.0mmiptg诱导剂，分别于37℃、25℃、20℃、16℃，200rpm继续培养，在诱导后的0h、2h、4h、6h、12h、24h各时间点各取1ml菌液，4℃12000rpm离心20min收集菌体沉淀，并用预冷的pbs(0.1m，ph7.4)重悬菌体。按照4∶1的比例混合菌体和4×蛋白上样缓冲液，沸水煮10min后，sds-page聚丙烯酰胺凝胶检测诱导情况从而确定最佳的诱导条件为：添加终浓度为1.0mm的iptg于37℃下诱导6h。

3、分离纯化

1)菌液的分离破碎

将诱导表达成功后的菌株扩大培养至100ml，od600＝0.5～0.6，添加终浓度为1.0mm的iptg于37℃下诱导6h后，6000rpm离心10min，收集菌体，根据菌体重量，每1g菌体加入10ml裂解液(20mmna3po4，0.5mnacl，20mm咪唑，10udnasei，50mmpmsf，0.3mg/ml溶菌酶)，重悬菌体。4℃放置1h后于-80℃冰箱反复冻融3次，在冰浴条件下进行超声破碎，超声功率为200w，8s超声，8s间歇，破碎时间为40min。将破碎后的液体12000rpm，4℃离心10min，分别收集上清和沉淀，sds-page聚丙烯酰胺凝胶检测确定ptcht4目的蛋白以包涵体的形式在表达菌株中存在。

将收集的包涵体分别用缓冲液a(50mmtris-hcl，100mmnacl，0.5mmedta-na2，2murea，1％tritonx-100)和缓冲液b(50mmtris-hcl，100mmnacl，0.5mmedta-na2，2murea)分别洗涤2次，12000rpm，4℃离心20min，收集沉淀后加入20ml溶解液(100mmtris-hcl，500mmnacl，8murea，10mm咪唑)，冰浴搅拌至包涵体溶解，12000rpm，4℃离心30min，去除未溶解的沉淀，上清液用0.22um滤膜抽滤除菌后即为待纯化的ptcht4蛋白溶液。

2)蛋白纯化

向proteinisotmni-ntaresin柱体中加入3倍柱体体积的ddh2o冲洗，待柱内ddh2o流干后，加入bindingbuffer(100mmtris，500mmnacl，8murea，10mm咪唑，ph7.4，用时加入0.3mg/ml溶菌酶和2％triton-x100)以平衡树脂的ph；将待纯化的目的蛋白溶液样品缓慢加到柱子中，分别用bindingbuffer和washbuffer(100mmtris，500mmnacl，8murea，20mm咪唑，ph7.4)清洗柱子，去除杂质；加入elutionbuffer(100mmtris，500mmnacl，8murea，250mm咪唑，ph7.4)后室温放置20min后收集洗脱液。sds-page聚丙烯酰胺凝胶检测纯化效果，如图1所示。

4、重组蛋白的复性

将透析袋在处理液(10mmnahco3，1mmedta)中煮沸约20min，再用ddh2o洗涤3次，于1mmedta溶液中4℃保存。将纯化后的重组蛋白装入处理好的透析袋中，依次用透析液i(25mmtris，200mmnacl，1mmedta，5mmdtt，6murea，ph7.4)、ii(25mmtris，50mmnacl，1mmedta，4murea，用时加入1mmgssg和1mmgsh，ph7.4)和iii(25mmtris，20mmnacl，1mmedta，2murea，用时加入1mmgssg和1mmgsh，ph7.4)各在4℃下搅拌透析12h，之后依次用透析液iv(25mmtris，10mmnacl，1mmedta，1murea，1mmdtt，1％甘氨酸，用时加入1mmgssg和1mmgsh，ph7.4)、v(25mmtris，10mmnacl，1mmedta，0.5murea，1mmdtt，1％甘氨酸，用时加入1mmgssg和1mmgsh，ph7.4)和vi(25mmtris，10mmnacl，5％甘油，ph7.4)各在4℃下搅拌透析3h，将透析后的液体转到新的离心管中，4℃，12000rpm，离心20min，取上清，即为复性后的重组蛋白。利用bca法测定复性后目的蛋白浓度为52mg/ml。

实施例2

1、三疣梭子蟹几丁质酶ptcht4基因重组蛋白的体外抑菌

待测菌株革兰氏阴性菌副溶血弧菌(vibrioparahaemolyticus)和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)分别于28℃和37℃过夜培养后，接种到新鲜的2216e液体培养基中，180rpm/min培养5-6h至od600≈1。将ptcht4重组蛋白复性液稀释成5、10、15、20、25mg/ml，取50ul10³-10⁴cfu/ml细菌悬液与等量的各浓度的ptcht4重组蛋白复性液混合均匀，对照组加入相同体积无菌的1×pbs，充分摇匀，分别于28℃和37℃培养2-3h，均匀涂布于2216e固体培养基上，过夜培养，记录平板菌体数目，计算抑菌率。

表4不同浓度的ptcht4复性蛋白对不同细菌抑菌率

如表4和图2所示，5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/mlptcht4重组蛋白复性液对副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为0.236842、0.479757、0.552632、0.61336、0.710526和0.19039、0.286491、0.349048、0.43699、0.478694。说明所述的ptcht4重组蛋白对上述病原菌的增殖有显著的抑制效果，随着蛋白浓度的增高，抑菌率显著增加，且相同浓度的蛋白对副溶血弧菌的抑制率显著高于金黄色葡萄球菌。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110>中国水产科学研究院黄海水产研究所

<120>一种三疣梭子蟹几丁质酶基因及其重组表达蛋白和应用

<160>13

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1549

<212>dna

<213>三疣梭子蟹(portunustrituberculatus)

<400>1

acatgtggccacatacacgtcagtttggcttgaaacatggtaggggctgttgcgcacatt60

gtcacgctctccctcagcctcgctcttgctggcggggctgcagctcagcactcccaggag120

gtcgtctgttaccttggctcctgggctatatacagaccttcaaatggcaaattcagtata180

gagaacattgatcctacattatgtactactttaatctatgcctttgtaggcattgacaac240

accacctacactatgcagtcccttgatccagagtacgactacaataagaaagctctacaa300

aggtttgtcaacttgaagagtctcaatcctcggctgaaggtgctgttggcagtgggaggt360

tggacagaaggttccaccaagtactctgccatggctgcaacggctgccaccaggaaggct420

ttcattgactcatccattaagttcattcaggatcatggttttgatgggcttgacctggac480

tgggagtatcctgccaataggggtggcaaaccagaagataaggaaaattttgttgctctt540

gttaaggaacttcgaagagaatttgtgagatatggctggatgttgacagctgctctggct600

gcaggaaaggcaacaattgagacagcatatgacatcgatgacttggcacaagacctggat660

ttcatgcatatcatggcatatgactaccatgggaaatgggatggtcgtactgggcacaat720

gctccactttacccacgtgaggatgagccagaggaggagaaatccctgaatgtggatgcc780

tctgttaagttatacctagactctggtgctccgcctcacaagttggtgctaggccttggt840

ctgtatggtcgcactttcctactccgagatgcatccaatccaggaatcagtgctccatct900

cactctactgcctttgctggaccatacacaagagaagatggtttccttggttacaatgag960

atctgtgaaaagcaaaccactgaggaaggactttggcaaatagtatggcagaaagctcac1020

caagttccttacatgttcagagacaacatgtgggttggctatgatgatgacatctcactt1080

agcctgaaagcagcctatgcccagaggctgggtcttggtggagtcatgatttggtctatt1140

gacacagatgacttcacgggtgcatgttctcagaatggaatcaagtttccaatgctgcgt1200

gccattaaccatgcactcagtcaacatgctaacaagagaccatcacctcccactcctgaa1260

cccaaaccagatattgacttggatgtggataatgatttggatgataaccgctatgatgta1320

gatgacacaaggacttctcgtgtggactctggtgctgccttagtttcctacccagtactc1380

aacattgctcttggattagcacttgtagttaaactagtttactaaattgttttaaaaatt1440

atgtatacatcttcctgataaggaatgttcataaaaaaaacaatcaaaatctgtagaatt1500

tttcaaccattggaagttttcattaattaatatatataaaaaaaaaaaa1549

<210>2

<211>462

<212>prt

<213>三疣梭子蟹(portunustrituberculatus)

<400>2

metvalglyalavalalahisilevalthrleuserleuserleuala

151015

leualaglyglyalaalaalaglnhisserglngluvalvalcystyr

202530

leuglysertrpalailetyrargproserasnglylyspheserile

354045

gluasnileaspprothrleucysthrthrleuiletyralapheval

505560

glyileaspasnthrthrtyrthrmetglnserleuaspproglutyr

65707580

asptyrasnlyslysalaleuglnargphevalasnleulysserleu

859095

asnproargleulysvalleuleualavalglyglytrpthrglugly

100105110

serthrlystyrseralametalaalathralaalathrarglysala

115120125

pheileaspserserilelyspheileglnasphisglypheaspgly

130135140

leuaspleuasptrpglutyrproalaasnargglyglylysproglu

145150155160

asplysgluasnphevalalaleuvallysgluleuargarggluphe

165170175

valargtyrglytrpmetleuthralaalaleualaalaglylysala

180185190

thrilegluthralatyraspileaspaspleualaglnaspleuasp

195200205

phemethisilemetalatyrasptyrhisglylystrpaspglyarg

210215220

thrglyhisasnalaproleutyrproarggluaspgluprogluglu

225230235240

glulysserleuasnvalaspalaservallysleutyrleuaspser

245250255

glyalaproprohislysleuvalleuglyleuglyleutyrglyarg

260265270

thrpheleuleuargaspalaserasnproglyileseralaproser

275280285

hisserthralaphealaglyprotyrthrarggluaspglypheleu

290295300

glytyrasngluilecysglulysglnthrthrglugluglyleutrp

305310315320

glnilevaltrpglnlysalahisglnvalprotyrmetpheargasp

325330335

asnmettrpvalglytyraspaspaspileserleuserleulysala

340345350

alatyralaglnargleuglyleuglyglyvalmetiletrpserile

355360365

aspthraspaspphethrglyalacysserglnasnglyilelysphe

370375380

prometleuargalaileasnhisalaleuserglnhisalaasnlys

385390395400

argproserproprothrprogluprolysproaspileaspleuasp

405410415

valaspasnaspleuaspaspasnargtyraspvalaspaspthrarg

420425430

thrserargvalaspserglyalaalaleuvalsertyrprovalleu

435440445

asnilealaleuglyleualaleuvalvallysleuvaltyr

450455460

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cccactcctgaacccaaacc20

<210>4

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

caaggacttctcgtgtggactct23

<210>5

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

gcaccaacttgtgaggcggagc22

<210>6

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

gccaacagcaccttcagccga21

<210>7

<211>45

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagt45

<210>8

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

ctaatacgactcactatagggc22

<210>9

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

aagcagtggtatcaacgcagagt23

<210>10

<211>31

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

cgcggatcccagcactcccaggaggtcgtct31

<210>11

<211>41

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

ataagaaatgcggccgcttagtaaactagtttaactacaag41

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

taatacgactcactataggg20

<210>13

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

gctagttattgctcagcgg19