玉米核雄性不育基因ms1-alb在广泛遗传背景下的不育稳定性分析方法及应用与流程

文档序号：17158928发布日期：2019-03-20 00:22阅读：480来源：国知局

一般地，本发明属于作物遗传育种、分子育种和种子工程领域。具体涉及一种玉米隐性核雄性不育基因ms1-alb在广泛遗传背景下的不育稳定性分析方法及应用。

背景技术：

植物雄性不育(malesterility,ms)是高等植物中普遍存在的现象，其雄性生殖器官发育异常，无法产生有功能的雄配子(花粉)，但雌性生殖器官发育正常，能接受正常雄配子而受精结实，并能将该不育性状遗传给后代。

玉米是重要的粮食和经济作物，其雄性不育突变材料对于花药发育机理解析以及杂交种生产均具有重要意义。根据遗传方式的差异，现有的玉米雄性不育材料可分为两类：核质互作雄性不育(cytoplasmicmalesterility,cms)和细胞核雄性不育(genicmalesterility,gms)。cms的败育一般由线粒体毒性蛋白引起，部分种质的细胞核中存在恢复基因，可解除毒性蛋白对育性的影响；因恢复基因仅存在于部分种质资源中，且不育程度易受遗传背景影响，cms的该类特征大大降低了种质资源利用效率；此外，cms育成品种细胞质单一化，易受专一病源小种的侵染，大面积推广存在风险。gms是由单一的细胞核基因突变引起的雄性不育，理论上所有的可育种质材料均可作为恢复系恢复其后代育性，该特征极大地增加了种植资源利用效率；且该类基因非母性遗传，不会导致细胞质单一化，降低了杂种后代潜在的风险，可作为杂交制种的理想母本材料。

相较于cms，gms具有恢复基因广泛存在、不会引起细胞质单一化等优点，但该类基因在不同遗传背景下的所导致雄花彻底败育的稳定性并不明晰，因此将该突变基因导入不同细胞核及细胞质遗传背景下，并对后代分离群体的基因型进行鉴定，以判断该类突变基因在不同的遗传背景下所导致不育表型的稳定性具有重要意义。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种检测玉米细胞核雄性不育突变基因在不同的遗传背景下所导致雄性不育表型的稳定性分析方法。所提供的方法具体为，通过杂交技术及分子标记辅助选择，将玉米隐性核雄性不育基因导入不同的细胞核及细胞质遗传背景下，通过育性分析及基因型检测，判断玉米细胞核雄性不育基因在不同遗传背景下的所导致雄花不育表型的稳定性，为后续杂交育种和制种不育母本材料的选择提供参考。

本发明的目的之一，在于提供一种鉴定玉米隐性核雄性不育基因在不同的遗传背景下导致雄花不育的稳定性分析方法。

本发明的目的之二，在于提供300份不同遗传背景下ms1-alb基因纯合突变的种质材料，用于玉米雄性不育杂交育种和制种。

附图说明

图1为玉米野生型（a、c、e）和ms1-alb突变体（b、d、f）的雄穗、花药及花粉粒碘-碘化钾染色的对比图。图e、f中标尺为200μm。

图2为300份广泛遗传背景的玉米自交系系统进化分析结果。基于3072个snp标记的芯片分析，发现这300份玉米自交系分为四大类群，遗传多样性丰富，在杂交玉米育种和制种中具有很好的利用价值；同时也说明该群体用于测试ms1-alb不育基因的不育稳定性具有代表性和可靠性。

图3为ms1-alb突变基因在300份不同玉米种质遗传背景下所导致雄花不育性状稳定性分析的操作流程图。

图4为f1代植株基因型鉴定所用引物示意图及鉴定结果电泳图。利用突变体基因ms1-alb的功能型标记ms1-in1和ms1-in2对f1代植株进行基因型鉴定。ms1-in1和ms1-in2可特异性检测突变基因ms1-alb位点，分别扩增得到602bp和945bp大小的条带，而在zmms1/zmms1纯合型材料中，无法扩增得到条带。

图5为代表性f2群体中可育植株与不育植株分离比的统计数值及分离比的分布。根据可育单株与不育单株的真实比值，将300份材料分为三类，第一类包含29个系，其可育植株与不育植株的比值介于0.7和2.0之间，p值介于0.01和0.56之间；第二类包含207个系，其可育植株与不育植株的比值介于2.0和4.6之间，p值介于0.27和1.00之间；第三类包含64个系，其可育单株与不育单株的比值大于4.6，p值介于0.06和0.64之间。

图6为3个代表性f2偏分离株系基因型鉴定电泳图。利用ms1-alb功能标记ms1-1和ms1-in1对3个f2偏分离株系单株进行基因型鉴定，ms1-1可特异性检测野生型基因zmms1位点，因此可以在zmms1/zmms1纯合野生型以及zmms1/ms1-alb杂合型中扩增得到763bp大小的条带；ms1-in1可特异性检测突变基因ms1-alb位点，因此可以在zmms1/ms1-alb杂合型以及ms1-alb/ms1-alb纯合突变型中扩增得到602bp大小的条带。检测结果显示，3个f2株系中所有的可育单株基因型均为zmms1/zmms1或zmms1/ms1-alb，不育单株的基因型均为ms1-alb/ms1-alb，基因型与表型完全一致。

图7为野生型、突变体及2个f2代表性株系中不育单株雄穗表型及花粉粒碘-碘化钾染色结果对比图。图中标尺为200μm。

具体实施方式

下述实施例用来说明本发明，但不限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。如无特殊说明，实施例中所用引物及基因的合成和测序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。其他生化试剂非特别注明外均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：获得玉米雄性不育突变材料及300份玉米自交系

本发明的供试材料是玉米正常可育自交系的zmms1基因突变获得的不育株，表现为完全雄性不育，如图1所示，其表现具体为：散粉期花药不外露，花药变小、无花粉粒产生。该不育系材料命名为ms1-alb。

300份供试母本玉米自交系来源于本实验室1400份玉米自交系中随机选取，材料名称仍沿用原始编号。

实施例2：300份玉米自交系群体结构鉴定

首先利用包含3072个位点的illuminagoldengatesnpgenotyping检测芯片对300份自交系材料进行分析，然后通过phylipdnadist程序计算不同材料之间的遗传距离(0-1.15)，根据遗传距离计算结果，利用phylipneighbor软件构建系统发育树，对300份自交系材料进行分类。如图2所示，300份玉米自交系可分为4个类群，代表了较好的多态性。

实施例3：ms1-alb突变杂合植株作为父本与300份自交系杂交获得f1代种子

玉米隐性细胞核雄性不育突变体只能通过姊妹交，即纯合突变体与杂合突变体杂交的方式保存，理论上得到的后代可育植株均为杂合体(zmms1/ms1-alb)，不育植株均为纯合体(ms1-alb/ms1-alb)，因而可通过表型判断基因型。本发明利用ms1-alb姊妹交群体中的可育单株(zmms1/ms1-alb)给300份自交系授粉，得到f1代种子。

实施例4：f1代群体中杂合基因型zmms1/ms1-alb植株的筛选及自交

所有300份自交系中zmms1基因位点均为zmms1/zmms1，因此实施例3中杂交得到的f1代中，野生型zmms1/zmms1与杂合型zmms1/ms1-alb基因型分离比理论上应为1：1。在苗期，取f1代植株的叶片提取dna，并利用ms1-alb功能标记ms1-in1和ms1-in2进行基因型鉴定，图4展示了部分株系基因型鉴定结果，杂合基因型判断的标准为ms1-in1和ms1-in2分别扩增得到602bp、945bp的条带；对得到的杂合体植株挂牌标记，待散粉期，进行自交授粉。

其中，玉米叶片dna提取方法如下：1）剪取适量叶片并剪碎，放入事先写好编号的2.0ml离心管中，加入一颗钢珠。2）按顺序将已放入叶片和钢珠的离心管摆放在打样仪专用的离心管架（8×5）上，整体浸泡在盛有液氮的保鲜盒中1-2分钟（注：液氮以刚没过离心管架少许为宜）。3）将冷冻好的离心管架放入打样仪（thmorgancellkillerck-1000）的卡槽中，拧紧，关盖，1200转/分钟的速度打样20秒。4）用吸铁石吸出离心管中的钢珠。5）加入700μlctab提取液（65℃预热），65℃水浴30分钟，中间取出颠倒1-2次。6）加入700μl氯仿：异戊醇（24:1）萃取液，盖紧盖子，上下颠倒混匀，小心标记不要被擦掉（注：氯仿为腐蚀性试剂，需要带pe一次性手套在通风橱中操作）。7）12000转/分钟离心5分钟至清晰分相。吸取上清液400μl，转入新的1.5ml微量离心管中（预先加入800μl预冷的无水乙醇），弃枪头，盖紧盖子，写好编号并检查无误，上下颠倒混匀。-20℃冰箱中放置30分钟。8）12000转/分钟离心10分钟至沉淀附于离心管底部，弃上清液。9）70％乙醇洗涤沉淀2遍，将1.5ml微量离心管倒置于平铺于桌上的纸上，自然干燥。10）加入100-200μl的1×te缓冲液或ddh2o溶解沉淀。11）样品置于-20℃冰箱中保存备用。

利用设计的引物对所获得的dna进行pcr扩增，方法和程序如下：1）先打开制冰机的水源开关，再打开制冰机的电源开关，制冰。2）将下列试剂从-20℃冰箱中取出解冻：pcr缓冲液、dntp溶液、正反向引物溶液以及模板dna（注：当某一试剂完全解冻，即放置于冰上。经常用的ddh2o、引物工作液、模板dna以及少量pcr缓冲液、dntp溶液可放于4℃冰箱中）。3）所有试剂解冻完毕后，8000转/分钟离心数秒，放回冰上待用。4）配制pcr反应的混合液，按照下表依次加入各试剂（反应体系为10μl）。下表1同时列出了1个反应（1r´）、10个反应（10r´）、50个反应（50r´）、100个反应（100r´）的混合液配方。配好后将所有试剂放回4℃或-20℃冰箱（注：taq聚合酶需小心操作，临用前从-20℃冰箱中取出，用时需置于冰上，用完后立即放回-20℃冰箱中）。5）混匀，8000转/分钟离心数秒。6）将混合液分装至200μlpcr反应管中，再加入1μl模板dna，做好标记（注：如果不使用热盖功能，为防止样品蒸干，需最后加入约20μl石蜡油或盖上pcr管盖）。7）将pcr反应板（管）插入pcr扩增仪的200μl孔中，合上热盖，旋紧。8）打开pcr扩增仪电源开关，选择预设的反应程序（如表2），开始扩增。9）扩增完后，退出反应程序，回到主菜单，关闭电源开关。打开热盖，取出pcr反应管，置于pcr管架上，放入4℃冰箱中，待用。

实施例5：f2代群体中可育植株与不育植株分离比统计

将来源于不同母本的f2子代分行种植，在散粉期对可育植株与不育植株分离比进行统计，并对比值进行卡方检测，计算p值，以判断可育植株与不育植株分离比是否符合3：1。结果显示，除a141杂交后代（p=0.01）以外，299份f2代植株的育性分离比均符合3：1，p值介于0.06与1.00之间。图5（下）为部分材料的育性分离比统计数值及卡方检验结果。为验证f2群体中基因型与表型的一致性，利用野生型基因zmms1的功能标记ms1-1以及突变基因ms1-alb的功能标记ms1-in1，对a141杂交f2后代以及另外2个偏分离的f2群体（a160和a440）的所有单株进行基因型检测，结果如图6所示，所有可育单株的基因型都为zmms1/zmms1或zmms1/ms1-alb，不育单株的基因型都为ms1-alb/ms1-alb，基因型与表型保持一致。

实施例6：f2代群体不育植株穗型及花粉粒染色检测

在不同母本来源的f2代不育植株雄穗中，均未观察到花药外露现象，这意味着ms1-alb突变基因导致的雄花不育现象在不同的遗传背景下是稳定的；为进一步验证不育的稳定性，在每个亲本的f2后代中随机选取3棵不育单株，于散粉期取其花药，利用1%浓度的碘-碘化钾溶液染色，所有f2代不育单株的花粉粒均无法着色，与ms1-alb突变体花粉粒体现出相同的形态特征；两个代表性f2代不育单株雄穗及花粉粒染色结果如图7所示。

实施例7：300份不同遗传背景下ms1-alb突变体在创制雄性不育制种母本中的应用

300份不同遗传背景下的ms1-alb突变体可以作为基础材料，与相应的母本材料进行4-5轮回交，每一轮回交前均利用ms1-in1或ms1-in2选择带有ms1-alb突变基因的植株进行回交，最终可获得既带有ms1-alb突变基因同时又具有轮回亲本遗传背景的新材料(zmms1/ms1-alb)，再经过一轮自交，即可获得新的遗传背景下的ms1-alb玉米细胞核雄性不育新材料，作为杂交制种的母本材料用于杂交种生产。

总之，本发明利用杂交及自交的方式，辅助以分子标记辅助选择，建立了一套检测玉米隐性细胞核雄性不育基因在不同的遗传背景下所导致雄花不育稳定性检测的方法；第一步杂交利用杂合突变体为父本，300份自交系作为母本，保证了杂交后细胞质的多样性，因此同时检测了不同的胞质对突变基因作用的影响。该方法为玉米隐性细胞核雄性不育突变基因用于不育制种提供了更充分的理论依据。