检测冬生疫霉菌的LAMP引物对及其扩增方法和用途与流程

本发明涉及使用lamp技术检测植物及植物产品中冬生疫霉菌的方法，属于植物病原真菌检测领域。

背景技术：

疫霉属真菌常多种病菌复合侵染同株果树，为害植株的根、颈、叶、果实等，寄主植物出现脚腐(footrot)、根腐(rootrot)、冠腐(crownrot)、果腐(brownrotoffruit)和叶疫(leafblight)等多种症状，具有流行性和毁灭性，可导致植物大量减产，甚至绝产、死亡，给多种农业经济作物生产带来巨大损失。

冬生疫霉是重要的检疫性真菌，主要通过感病寄主、土壤和雨水进行传播扩散。冬生疫霉侵染植株的不同部位引起果腐、叶腐、枯梢等，危害严重，其中，柑橘果实更可高达75％的损失。冬生疫霉不仅可以单独侵染植株，还可与其他疫霉真菌发生复合侵染，如热带美洲的脚腐病是由樟疫霉、柑橘生疫霉、柑橘褐腐疫霉、冬生疫霉、棕榈疫霉和寄生疫霉6种疫霉菌引起的。冬生疫霉是我国植物检疫病原菌，随着我国综合国力的提升，水果及其种苗的大量进口增大了疫霉菌入侵的风险，应加大对进境水果及其种苗的口岸检疫力度，保护我国国门生物安全。

目前疫霉菌常规生物学检测方法是植物带菌检测，经过分离培养可通过肉眼直接观察菌落、孢子囊、卵孢子等形态特征来进行鉴定。病原菌菌株培养时间需达20天左右才能诱激产生孢子囊，此种情况不仅耗时费力，疫霉病原菌的形态特征、培养性状及生理特性等极为相似，很难根据菌落形态、孢子囊的形态和脱落性、有性器官的产生和形态、厚垣孢子的有无、菌丝的生长温度等特性来准确、快速有效地鉴定出冬生疫霉，分子生物学方法如elisa(mohan.evaluationofantiseraraisedagainstphytophthorafragariaefordetectingtheredcorediseaseofstrawberriesbyenzyme-linkedimmunosorbentassay(elisa).plantpathology1988,37:206-216)、单克隆抗体(burnsetal.theuseofmonoclonalantibodiesforthedetectionoffungi.bulletinoepp/eppobulletin.1995,25:31-38)等已有应用，但是只能检测到疫霉属的水平。目前的检测方法不能满足口岸检测“快验快放”的要求，易导致病害在我国传播。因此，加强对口岸进境植物产品携带疫霉的快速、准确的检测鉴定显得极为重要。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)是日本学者notomi等于2000年开发的一种新型恒温核酸扩增方法。该技术有灵敏度高、特异性强、方便简捷、检测周期短、仪器设备要求低等优点，大大降低了投入成本，具有较高的应用价值，目前已广泛应用于临床、食品安全、农业等领域。在植物病毒、细菌方面的应用也已相当成熟，如fukuta等应用lamp先后检测番茄黄化曲叶病毒(tylcv)和番茄斑萎病毒(tswv)，okuda等建立了黄龙病的lamp检测方法等。但还没有将lamp技术应用于冬生疫霉检测的报道。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是：设计冬生疫霉的lamp引物，建立冬生疫霉的lamp检测方法。

为了解决该问题，本发明的解决方案是，设计冬生疫霉的特异lamp引物，并建立特异lamp方法。冬生疫霉的lamp特异引物，序列如下：

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ph-fip：acacttttcaggttgtggtacacct-ttggtgccacgagctt

ph-bip：ttaagggtaggtatggtttggacg–agcgtttgcctggatgtt

反应结束后，可通过肉眼观察反应液是否为白色浑浊(白色浑浊为阳性，否则为阴性)来判断扩增结果；也可在扩增产物中加入sybrgreeni荧光染料观察颜色变化，反应液颜色由橙色变成绿色为阳性，否则颜色保持不变，用于冬生疫霉基因组dna特异性检测。

一种检测冬生疫霉菌的lamp引物对及其扩增方法和用途，包括下述的扩增体系和扩增程序：

(1)扩增体系建立25μl的扩增体系为，总体积为25μl，包括10×thermopolbuffer2.5μl(200mmol/ltris-hcl、100mmol/lkcl、20mmol/lmgso4、100mmol/l(nh4)2so4、1.0％tritonx-100)、2.5mmol/ldntps2.5μl、100mmol/lmgso41μl、权利要求1所述的引物，10mmol/lph-f30.2μl、10mmol/lph-b30.2μl、10mmol/lph-fip1.6μl、10mmol/lph-bip1.6μl、8u/μlbstdnapolymerase1μl、dna模板1μl，余量为双蒸水；

(2)反应程序

63℃水浴锅中反应70min，之后在85℃下灭活5min结束反应。

一种检测冬生疫霉菌的lamp引物对及其扩增方法的用途。

本发明的有益效果是：建立了方法简便的冬生疫霉的lamp特异性引物，能将冬生疫霉与其它疫霉区别开来。简化和方便了对该疫霉的检测，节约了检测时间，该方法快速、可靠，可有效在口岸检测中推广应用。

附图说明

图1是冬生疫霉的lamp特异引物的扩增

具体实施方式

本发明的冬生疫霉lamp特异性引物，实现了冬生疫霉的快速检测。

设计冬生疫霉的特异lamp引物，序列如下：

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反应结束后，可通过肉眼观察反应液是否为白色浑浊(白色浑浊为阳性，否则为阴性)来判断扩增结果；也可在扩增产物中加入sybrgreeni荧光染料观察颜色变化，反应液颜色由橙色变成绿色为阳性，否则颜色保持不变，用于冬生疫霉基因组dna特异性检测。

本发明建立一种检测冬生疫霉菌的lamp引物对及其扩增方法，包括扩增体系的建立和扩增程序设立：

(1)扩增体系建立25μl的扩增体系为，总体积为25μl，包括10×thermopolbuffer2.5μl(200mmol/ltris-hcl、100mmol/lkcl、20mmol/lmgso4、100mmol/l(nh4)2so4、1.0％tritonx-100)、2.5mmol/ldntps2.5μl、100mmol/lmgso41μl、权利要求1所述的引物，10mmol/lph-f30.2μl、10mmol/lph-b30.2μl、10mmol/lph-fip1.6μl、10mmol/lph-bip1.6μl、8u/μlbstdnapolymerase1μl、dna模板1μl，余量为双蒸水；

(2)反应程序

63℃水浴锅中反应70min，之后在85℃下灭活5min结束反应。

本发明设计合成冬生疫霉的lamp特异性引物，对所有实验材料菌丝dna进行质量检测，避免假阴性。

所述检测冬生疫霉菌的lamp引物对及其扩增方法的应用。

本发明建立了简便快速、特异性强、灵敏度高、准确可靠的冬生疫霉菌lamp检测方法，能将冬生疫霉与其他疫霉区别开来。该方法的建立为冬生疫霉的快速检测提供了特异可行的方法，节约了世界和时间，检测快速、可靠，整个过程在一个工作日内完成，可有效在口岸检测中推广应用。

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

实施例1：实验材料菌丝的培养本实验疫霉属真菌菌株源于天津出入境检验检疫局动植食中心植检实验室。共计15种，相关信息见表2。

实施例2：菌丝基因组dna的提取将菌丝挑于1.5ml离心管，液氮研磨，再按照qiagen公司生产的dna提取试剂盒提取dna，并将dna溶于100μl1×te缓冲液中，置于-20℃保存。

pcr扩增相关试剂为大连宝生物(takara)工程公司产品。

3.1反应混合液的配置建立25μl的扩增体系为，包括10×thermopolbuffer2.5μl(200mmol/ltris-hcl、100mmol/lkcl、20mmol/lmgso4、100mmol/l(nh4)2so4、1.0％tritonx-100)、2.5mmol/ldntps2.5μl、100mmol/lmgso41μl、权利要求1所述的引物，10mmol/lph-f30.2μl、10mmol/lph-b30.2μl、10mmol/lph-fip1.6μl、10mmol/lph-bip1.6μl、8u/μlbstdnapolymerase1μl、dna模板1μl，余量为双蒸水。以冬生疫霉的菌丝为阳性对照，无菌水为阴性对照；3.2pcr反应程序

63℃水浴锅中反应70min，之后在85℃下灭活5min结束反应。2％琼脂糖凝胶电泳，eb染色及成像观察目的条带，并在离心管中，加入1000×sybrgreeni显色液，观察结果

3.3结果分析

实验结果表明，lamp产物采用瞬间离心观察焦磷酸镁白色沉淀和添加sybrgreeni荧光染料显色，判定结果均与电泳鉴定一致。

以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所做的同等变化和修饰，仍落在本发明的专利范围内。

序列表

<110>天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心

<120>检测冬生疫霉菌的lamp引物对及其扩增方法和用途

<141>2018-08-07

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

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<212>dna

<213>冬生疫霉(p.hibernaliscarne)

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<213>冬生疫霉(p.hibernaliscarne)

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