一种高密度遗传连锁图谱的快速构建方法与流程

本发明涉及一种基于杂交f1代作图群体的高密度遗传连锁图谱快速构建方法，属于分子遗传学领域。

背景技术：

杨梅(myricarubrasieb.andzucc.)是原产于我国南方的特色果树，其种质资源丰富，有2000多年的栽培历史，果实富含花色素苷，具有较高的营养价值，鲜食与加工兼宜，市场潜力巨大。据全国杨梅科研、生产协作组等有关单位的调查和整理的结果表明，我国杨梅共有305个品种，单系120个，现已定名的品种共268份(庄卫东，2001)。尽管我国有着丰富的杨梅种质资源，但是新品种的来源还仅限于自然产生的优良变异类型，通过人工杂交方式选育新品种还未见报道。究其原因，主要是由于杨梅作为多年生林木，生长发育周期较长，从种子发芽到结果通常需要8-10年时间；再者，杨梅种子具有休眠性，生理后熟机制较为复杂；在自然状态下，通常栽培品种种子发芽率比实生树的种子发芽率低很多，例如杨梅著名品种‘荸荠’和‘东魁’的种子发芽率仅为5％-27％；即便是使用低温层积、硝酸钾、硫酸、赤霉素、双氧水、热水浸种等各种处理之后，其作用效果也非常有限；另外，有些杨梅品种即使经过不同催芽处理，其种子在采收当年也基本不能萌发，要持续2-3年后部分种子才可以萌发；总之，上述原因是杨梅进行杂交育种与杂交群体构建工作进程中的重要障碍。

遗传连锁图谱以遗传标记间的重组率为基础对染色体上的遗传标记或者已知基因进行相对定位，也是进行资源研究的理论基础和依据，因此，构建遗传连锁图谱可为控制重要农艺性状基因、数量性状的位点进行定位及检测和分析服务。早期形态标记是构建遗传连锁图谱主要方法，随着分子生物学特别是分子标记技术的发展，rapd、aflp、ssr、snp等分子标记方法被广泛应用于遗传连锁图谱的构建中。其中，snp(singlenucleotidepolymorphism)具有数量多、分布广泛、稳定性好等优点，利用snp标记进行多年生果树高密度遗传连锁图谱的构建已被广泛使用(wangetal.,2011)。然而，遗传图谱构建的基础是分离群体，适合的亲本和适当的群体是成功和高效作图的关键。果树多数为多年生异交植物，多数自交不亲和，基因型高度复杂，有性时代太长，因而很难通过杂交获得纯系，因此，利用近交系或其他高世代群体进行遗传构图是非常困难的。近年来在林木图谱构建中发展出来拟测交策略，其原理是将两个杂合体双亲均看作回交一代群体，并将对方作为测交隐性亲本，即以亲缘关系相对较远的杂合亲本交配所得的fl为作图群体，因亲本杂合，由于亲本杂交得到f1代群体遗传位点已经产生分离重组，可以直接选取在亲本中呈多态且在f1中以1∶1分离的位点来模拟近交系中的测交位点作图。针对杨梅而言，其在分子遗传尤其是育种领域的研究仅处于起步阶段，基础较为薄弱。就杨梅而言，由于杂交种子生理后熟机制复杂，萌发困难，耗时较长，即使利用低世代(f1代)杂交群体及拟测交策略构建遗传图谱，从亲本杂交授粉、种子收集与播种到种子萌发然后采集叶片进而提取dna通常也需要2-3年时间，严重限制了杨梅的遗传图谱构建及其他分子遗传学相关研究工作的开展。因此，探索利用较为快捷的技术方法进行杨梅遗传图谱的构建是克服现有技术方法不足的有效途径之一。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种快速的基于杂交f1作图群体的高密度遗传连锁图谱的构建方法。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

(1)杨梅栽培品种杂交授粉：

选择农艺性状、果实品质具有一定差异的杨梅栽培品种作为亲本开展杂交授粉，myrical.首先在(母本)杨梅雌花始花期前10天，使用硫酸纸袋将着生雌花的枝条进行套袋隔离，套袋的花序总数量需>100个；然后，在雄花盛花期收集(父本)杨梅雄花的花粉，置于4℃保存备用；待(母本)杨梅雌花盛花期时，拆开套袋一角，用毛笔蘸取少量(父本)杨梅雄花的花粉进行人工点授，授粉后将袋子上的孔用胶带再次密封隔离；最后，待果实进入膨大期将硫酸纸袋拆掉换成纱网袋并挂牌标记，可防止果实落果造成的损失；待果实完熟后直接收集所有纱网袋中杂交果实，将去除果肉后种子阴干后置于4℃冰箱保存。其中选择杨梅杂交亲本的具体条件为：1、两个亲本均为杨梅属(myrical.)杨梅种(myricarubra)内栽培品种，两者果实成熟期早晚差异大于10d以上，同时果实平均单果重差异大于8g以上；2、由于杨梅为雌雄异株植物，两个亲本中必须至少有一个可以产生花粉(作为父本)才可以形成有效杂交授粉组合。以上两个条件均需满足。

(2)杂交f1种子处理与样品收集：

种子直接使用坚果破壳器将每粒种子的硬质外壳压碎后去除；然后使用手术刀和镊子在超净工作台上小心翼翼的撕开核仁的黄褐色外皮，同时只刮取少量种子子叶部分样品(>50mg)置于2ml圆底具塞离心管内，每份子叶样品均单独存放，每份样品采集处理前后手术刀、镊子等都要用医用酒精擦拭后火焰灼烧以防止交叉污染；

(3)子叶中微量dna的提取与纯化：

①在每份装有子叶样品的离心管内加入一粒钢珠，用液氮浸泡后置于fastprep-96高通量样品制备仪上进行充分研磨(亲本可直接采集少许嫩叶同步进行研磨及相关dna提取)；然后，直接加入1ml65℃预热的ctab提取液后混匀(提取液的配方为：ctab，4g；nacl，16.34g，1mtris·hcl(ph8.0)，20ml；0.5medta，8ml；3％pvp，2g；定容于200ml，调整ph至8.0，灭菌后即可使用)，置于65℃金属浴上保持45min后加入等体积抽提混合液(氯仿：乙醇：异戊醇＝20：4：1，体积比)，震荡混匀；

②12000rpm离心10min，小心吸取上层水相于干净离心管中，加入等体积抽提混合液后震荡混匀，12000rpm离心10min，再次小心吸取上层水相于干净离心管中；然后加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置40min，12000rpm离心10min，去上清液，加入500μl70％乙醇，涡旋震荡，12000rpm离心10min，去上清液，吸取残留液体并晾干dna沉淀，加入50μlte溶液溶解(te溶液的配方为：10mmol/ltris·cl，1mmol/ledta，ph8.0)；

③使用微量dna纯化试剂盒microdnaclean-upkit(omega)纯化上述dna粗提液；具体操作步骤如下：dna粗提液加0.5倍体积的bufferp3和等体积无水乙醇，室温下充分混匀；混合液在10000rpm离心1min条件下通过dna吸附柱；弃去过滤液，将吸附柱放回原管，加入700μlspw后10000rpm离心1min，弃过滤液后再次加入700μlspw清洗吸附柱；将吸附柱放回原管，13000rpm离心2min以彻底去除各种残留液体；最后将吸附柱套入1.5ml离心管中加入20μlddh2o，13000rpm离心2min洗脱吸附柱中dna，重复洗脱1次；取2～5μl在1.0％的琼脂糖凝胶上检测，置于-80℃冰箱保存备用；

(4)微量dna多重置换扩增：

①样品加热变性及引物与质粒退火反应：ddh2o4.4μl，10×phi29dna聚合酶缓冲液1.0μl，随机引物(100μm)2.5μl(序列为：nnnnnn，经硫代磷酸化修饰)，dna模板样品(1μg/ml)1.0μl，95℃加热3分钟，然后置于冰上15分钟。

②扩增反应：在上述反应液中加入dntp(10mm)0.5μl，100xbsa0.1μl，phi29dna聚合酶(10u/μl)0.5μl，最终反应体系为：10.0μl，30℃温育过夜。

③热失活phi29dna聚合酶：65℃，10分钟。

④经多重置换扩增后的dna样品分别取2μl在1.0％的琼脂糖凝胶上检测其质量及浓度；

(5)真假杂种鉴定：

上述扩增后的dna分别取20ng并使用2×transstartfastpfuflypcrsupermix(-dye)试剂盒进行pcr扩增，引物为mru155(f：gatctgatggtctagaacgcac；r：gtttgaaagcttctttccctggtg)和my0972(f：ggaatcatcgaagccagaaaa；r：taaacaaagaaatgccagaggaaag)，均已添加荧光标识；反应程序为94℃预变性5min，94℃(30s)/58℃(30s)/72℃(30s)35个循环，最后72℃延伸10min；pcr扩增结果在abi3730或abi3130遗传分析仪上鉴定其片段大小(bp)，最后对父、母本及杂交群体进行对比分析，若后代群体扩增出条带大小与父母本完全一致即为真杂种，扩增出其他片段大小的后代均为假杂种，可直接剔除。

(6)dna的简化基因组测序与数据处理：

将通过鉴定后的真杂种dna委托生物技术公司使用二代测序平台illuminahiseq2500上机测序，测序模式为paired-end，2*150bp；采用简化基因组测序方法，即dd-rad(doubledigestrestrictionassociateddna)；测序数据量要求每个子代个体>600m，亲本个体>6g。然后，将测序获得的原始序列数据使用stacks软件子程序process_radtags进行样本划分与质控，然后分别使用子程序ustacks及cstacks将子代个体与两个亲本中所出现的stacks综合编入,形成一个含有双亲中所有基因座位的目录；再由子sstacks程序对子代个体中出现的基因座位与双亲中出现的基因座位进行一对一搜索和概率计算,定义出每一个基因座位上的等位基因，最后由子genotypes对每个位点的基因型进行分型矩阵构建，并输出cp类型的joinmap可识别的文件*.loc。

(7)高密度遗传连锁图谱绘制：

将stacks软件最后生成的*.loc矩阵文件直接导入joinmap5.0，设定lod最大值为10，最小值为2，用kosambi函数将重组率转化为遗传距离(cm)，检测水平为1.0％，图谱使用joinmap5.0内置mapchart插件进行展示。

本发明首次直接使用杨梅杂交种子子叶开展遗传图谱的构建，克服了杨梅杂交种子萌发困难和生长周期长的障碍，减少了杂交子代材料培育的工作量及时间，进而简化了遗传图谱构建流程。此外，以杂交f1为作图群体按“拟测交”的策略建图，符合多年生异交植物本身生长特性；再者，直接提取种子子叶中微量dna并进行多重置换扩增，即可满足常规简化基因组测序技术样品量需求，不必借助于成本较高的微量dna简化基因组测序技术，从而降低了样品的测序成本。应用本发明方法从杨梅杂交授粉到群体种子收集及构建图谱，仅需要4个月的时间。该方法特别适用于多年生雌雄异株林木遗传图谱的构建。因而该方法在多年生林木分子育种领域具有良好的应用前景。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明仅需要收集杂交群体种子即可开始构建遗传连锁图谱，有效克服了多年生林木杂交后代生长周期长的缺陷，可在较短时间内完成高密度遗传连锁图谱构建，效果可靠；另外，本发明可最大限度利用杂交群体资源，省去了后期杂交后代栽培养护；同时，针对亲本亲和力较低、杂交困难以及子代萌发困难的树种，可避免后期子代相关栽培技术措施不当导致的杂交群体个体数量损失。本方法可广泛用于今后的多年生异交植物遗传连锁图谱构建等相关研究。

(2)本发明将直接提取杂交群体种子子叶中微量dna进行多重置换扩增，借以提升dna总量；其主要扩增环节依赖phi29dna聚合酶，该酶对于模板有很强的模板结合能力，能连续扩增100kb的dna模板而不从模板上解离，同时这种酶具有3’-5’外切酶活性，可以保证扩增的高保真性，扩增效果稳定可靠。种子子叶中微量dna经多重置换扩增后可完全满足常规简化基因组测序技术样品量需求，不必借助于高成本的微量dna简化基因组测序技术，从而较大幅度降低了基因组测序成本。

附图说明

图1为部分样品微量dna多重置换扩增琼脂糖凝胶电泳效果图(a，多重置换扩增前的原始dna电泳效果；b，经过多重置换扩增后的dna电泳效果；图a和图b同一泳道内均为同一样品dna)。

图2为采用本方法构建得到的杨梅高密度遗传图谱lgl-lg11号连锁群。

下面结合附图对本发明的实施方式做进一步说明。

具体实施方式

实施例1

杨梅高密度遗传连锁图谱构建快速构建的应用，其步骤包括：

(1)杨梅品种间杂交授粉：

选择农艺性状、果实品质具有较大差异的杨梅栽培品种早熟优株‘bqcx’(♀)和晚熟大果型品种‘东魁’(♂)作为亲本开展杂交授粉；首先，在早熟优株‘bqcx’上选择花序进行套袋(硫酸纸袋)隔离(2016年3月1)，花序数量为102个；在2016年3月11日，在东魁杨梅园采集雄性突变花序并收集其花粉；然后在3月13日对早熟优株‘bqcx’进行点授杂交；4月30日，将所有果实套袋全部更换为网纱袋，以利于通风透光；6月4日果实成熟时收集所有套袋内的杂交果实，共计162颗果实；待果实果肉部分完熟后将其剔除，保留种核阴干后置于4℃冰箱保存。

(2)杂交f1种子处理与样品收集：

将种子直接使用坚果破壳器将每粒种子的硬质外壳压碎后去除，然后使用手术刀和镊子在超净工作台上小心翼翼的撕开核仁的黄褐色外皮，同时只刮取少量种子子叶部分样品约150mg置于2ml圆底具塞离心管内，每份子叶样品均单独存放，并标注名称；由于部分种子内部已发生败育或发霉，可直接丢弃；最终，可顺利采集子叶样品的种子共计122粒；每份样品采集处理前后手术刀、镊子等都要用医用酒精擦拭后火焰灼烧以防止交叉污染；

(3)子叶中微量dna的提取与纯化：

①在每份装有子叶样品的离心管内加入一粒钢珠，用液氮浸泡后置于fastprep-96高通量样品制备仪上进行充分研磨；然后，直接加入1ml65℃预热的ctab提取液后混匀(提取液的配方为：ctab，4g；nacl，16.34g，1mtris·hcl(ph8.0)，20ml；0.5medta，8ml；3％pvp，2g；定容于200ml，调整ph至8.0，灭菌后即可使用)，置于65℃金属浴上保持45min后加入等体积抽提混合液(氯仿：乙醇：异戊醇＝20：4：1，体积比)，震荡混匀；

②12000rpm离心10min，小心吸取上层水相于干净离心管中，加入等体积抽提混合液后震荡混匀，12000rpm离心10min，再次小心吸取上层水相于干净离心管中；然后加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置40min，12000rpm离心10min，去上清液，加入500μl70％乙醇，涡旋震荡，12000rpm离心10min，去上清液，吸取残留液体并晾干dna沉淀，加入50μlte溶液溶解(te溶液的配方为：10mmol/ltris·cl，1mmol/ledta，ph8.0)；

③使用微量dna纯化试剂盒microdnaclean-upkit(omega)纯化上述dna粗提液；具体操作步骤如下：每份子叶dna粗提液加0.5倍体积的bufferp3和等体积无水乙醇，室温下充分混匀；混合液在10000rpm离心1min条件下通过dna吸附柱；弃去过滤液，将吸附柱放回原管，加入700μlspw后10000rpm离心1min，弃过滤液后再次加入700μlspw清洗吸附柱；将吸附柱放回原管，13000rpm离心2min以彻底去除各种残留液体；最后将吸附柱套入1.5ml离心管中加入20μlddh2o，13000rpm离心2min洗脱吸附柱中dna，重复洗脱1次；

另外，直接采集亲本‘bqcx’(♀)和‘东魁’(♂)植株嫩叶300mg按照上述①-③同步进行相关处理即可。

分别取上述样品dna提取液2μl在1.0％的琼脂糖凝胶上检测dna提取和纯化效果，最后置于-80℃冰箱保存备用；

(4)微量dna多重置换扩增：

①样品加热变性及引物与质粒退火反应：ddh2o4.4μl，10×phi29dna聚合酶缓冲液1.0μl，随机引物(100μm)2.5μl(序列为：nnnnnn，经硫代磷酸化修饰)，子叶dna模板样品(1μg/ml)2.0μl，95℃加热3分钟，然后置于冰上15分钟。

②扩增反应：在上述反应液中加入dntp(10mm)0.5μl，100xbsa0.1μl，phi29dna聚合酶(10u/μl)0.5μl，最终反应体系为：10.0μl，30℃温育过夜。

③热失活phi29dna聚合酶：65℃，10分钟。

④经多重置换扩增后的dna样品分别取2μl在1.0％的琼脂糖凝胶上检测其质量及浓度，如图1所示；

(5)真假杂种鉴定：

上述扩增后的子叶dna样品分别取20ng并使用2×transstartfastpfuflypcrsupermix(-dye)试剂盒进行pcr扩增，引物为mru155(f：gatctgatggtctagaacgcac；r：gtttgaaagcttctttccctggtg)和my0972(f：ggaatcatcgaagccagaaaa；r：taaacaaagaaatgccagaggaaag)，上述引物分别添加fam和hex荧光标识；反应程序为94℃预变性5min，94℃(30s)/58℃(30s)/72℃(30s)35个循环，最后72℃延伸10min；pcr扩增结果在abi3730遗传分析仪上鉴定其片段大小(bp)，结果见表1(“√”表示为真杂种f1，“x”则表示为假杂种f1，)。

1使用ssr分子标记扩增鉴定杨梅f1真假杂种

由表1可知，在mru11位点，‘bqcx’的基因型为110/116，‘东魁’的基因型为116/116；而在my0972位点，‘bqcx’的基因型为204/216，‘东魁’的基因型为234/234；若杂种f1扩增出与亲本‘bqcx’和‘东魁’不一致的片段均为假杂种，例如no.5、no.8和no.10等共计41个，将其直接剔除，其余81个则为真杂交f1。

(6)dna的简化基因组测序与数据处理：

将通过鉴定后的真杂种dna原液(平均每份总量约为500ng)委托生物技术公司使用二代测序平台illuminahiseq2500上机测序，测序模式为paired-end，2*150bp；采用简化基因组测序方法，即dd-rad(doubledigestrestrictionassociateddna)；测序数据量平均每个子代个体>1.5g，亲本个体>6.5g；获得测序数据后进行如下操作：

将测序获得的原始序列数据使用stacks1.47软件子程序process_radtags进行样本划分与质控，然后分别使用子程序ustacks及cstacks将子代个体与两个亲本中所出现的stacks综合编入，形成一个含有双亲中所有基因座位的目录；再由子sstacks程序对子代个体中出现的基因座位与双亲中出现的基因座位进行一对一搜索和概率计算，定义出每一个基因座位上的等位基因，最后由子genotypes对每个位点的基因型进行分型矩阵构建，并输出cp类型的joinmap可识别的文件*.loc。

①基于linux平台的centos7.5操作系统环境，使用软件stacks1.47(http://catchenlab.life.illinois.edu/stacks/)子程序process_radtags进行样本分离与质控(碱基质量值为q30)；

②分别使用子程序ustacks和cstacks进行处理，前者根据序列相似性找出snp变异位点，后者将变异位点进行汇总(主要参数：-m3，-m3)；

③通过genotype程序将变异位点整理，最终获得含有18，264个位点的基因分型矩阵，并导出为loc文件；

(7)高密度遗传连锁图谱绘制：

将stacks软件最后生成的*.loc矩阵文件直接导入joinmap5.0，设定lod最大值为10，最小值为2，根据最大似然法计算重组率，用kosambi函数将重组率转化为遗传距离(cm)，图谱使用joinmap5.0内置mapchart插件进行展示。共1,543个snp标记上图，获得了11条杨梅连锁群，总图距为4551.462cm，平均图距2.95cm。

从以上实施例可以看出，使用f1群体可以快速构建杨梅高密度遗传连锁图谱，该技术在林木分子育种领域将具有良好的应用价值和推广前景。