一株米曲霉ZA184及其应用的制作方法

文档序号：17695656发布日期：2019-05-17 21:29阅读：404来源：国知局

本发明涉及食品加工及微生物发酵技术领域。具体而言，本发明涉及一株米曲霉，以及其在酱油酿造中的应用。

背景技术：

酱油属于传统发酵调味食品，菌种是酱油发酵的基础，其性能对酱油产量和质量影响至关重要。有研究表明，米曲霉在酱油制曲阶段分泌的多种酶系对酱醪发酵成熟的快慢、原料利用率的高低、成品色泽的浓淡以及味道的鲜美程度都有着直接的关系。获得优秀的酱油曲霉菌种是决定酱油企业原料成本和市场竞争力的关键因素之一，也是酱油企业长期以来的奋斗目标。

酱油酿造是将大豆(或脱脂大豆)、小麦、麸皮等原料经过米曲霉菌接种制曲，拌入一定量的盐水，装入发酵容器中，利用微生物所产生的各种酶，将酱醪中原来无味的复杂有机物质(蛋白质、淀粉质等)分解成简单的呈味物质。整个发酵过程起主要作用的酶类有水解酶和合成酶类。水解酶类使原料中的高分子物质水解成为低分子物质，然后再由合成酶类和其它的化学作用而形成酱油的色、香、味、体。可以说，水解酶类是酿造酱油的“主力军”。水解酶类主要由曲霉菌产生，菌种含有水解酶的种类愈多，活力愈强，原料被分解的就愈彻底、原料的蛋白质利用率也就越高。能提高原料蛋白水解率的技术主要一个是原料处理方法的改进，另一个就是发酵用菌种的改良。因为大部分酱油原料的分解要依靠曲霉菌所生成的酶，所以曲霉性能优劣与酱油制品的产量和质量关系极大。

酱油发酵的过程就是各种酶促反应的过程。ph值对酶促反应的影响包括两个方面：(1)影响酶的稳定性；(2)影响酶与底物的结合以及酶催化底物转化成产物。在一定的条件下，各种酶都有其特定的最适ph值。偏离这个值，酶的活性都会降低，甚至会引起酶蛋白质的变性而失去活性。

曲的ph是制曲中一个很重要的管控点，因为它对发酵酱醪中酶的作用和其他微生物影响很大。不同菌株制曲成曲ph有很大变化。出曲的ph高，平均菌体量的酶量多，蛋白酶、亮氨酸氨肽酶、脂肪酶等生成量高，促使蛋白质水解速度加快且蛋白分解率提高。

目前，酱油行业普遍使用的生产菌种是沪酿3.042系列菌株(中科as3.951)，该系列菌种的特性是生长旺盛、产孢能力强、遗传稳定性好、酶系较全、发酵后酱油风味纯正，是一支非常优良的生产用菌种，故自1958年该菌株被研发出来后一直被各大酱油生产企业所使用。然而该系列菌种所获得的成曲的ph值普遍低于6.5以下，而分解蛋白质原料的主要酶类碱性蛋白酶、中性蛋白酶、氨肽酶、谷氨酰胺酶、脂肪酶等酶类的最适ph都在7.0以上，这些酶在发酵酱醪中的活性只有30％不到，极大降低对原料的分解速度，从而造成蛋白质原料利用率低。针对这一点，日本在酱油酿造的发酵前期采用较低的温度15℃(左右)控制乳酸菌的生长繁殖，使酱醅ph值不致于下降过快，而有利于中性蛋白酶和碱性蛋白酶对原料中蛋白质的分解。我国在酱油酿造中采用的低盐固态发酵工艺，发酵温度较高(一般控制在40-50℃)，酱醅ph值较低，故发酵出来的酱油质量不高。常常通过添加酶制剂或延长发酵周期来提高酱油品质，从而增大企业生产成本，而且添加外源酶制剂客观上也存在不可控制的风险。

因此，寻找新的发酵菌来提升酱油品质并缩短发酵周期是十分必要的。

技术实现要素：

为了实现上述目的，本发明提供一种米曲霉，通过其能够获得出曲ph值高、蛋白酶活力高的成曲；应用该菌株酿造酱油等调味品，不仅能够提高氨基氮、全氮及谷氨酸含量，提高酱油风味，并且能够显著缩短发酵周期，经济效益显著。

本领域已知在酱油等调味品的发酵过程中，蛋白质原料在蛋白酶的作用下分解为多肽等物质，后在肽酶的作用下进一步分解为氨基酸等成分，进而形成酱油的色、香、味、体。由此可见，蛋白酶对于酱油酿造具有重要作用。蛋白酶主要由曲霉菌产生，包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶，这三种不同蛋白酶的最适ph分别为9.5、7.2和3.5。肽酶包括亮氨酸氨肽酶，其最适ph为8。中性蛋白酶和碱性蛋白酶对蛋白质的初步分解具有显著作用，肽酶则可将多肽进一步分解为氨基酸。因此，碱性蛋白酶、中性蛋白酶和亮氨酸氨肽酶与原料蛋白质利用率密切相关，酶活越高，利用率越高，酱油风味也越佳。

此外，酱油曲的ph对酶的作用、酱醪中的微生物有很大的影响。例如，碱性蛋白酶、中性蛋白酶、亮氨酸氨肽酶等的最适ph都在7.0以上，由此可见，制曲ph高，碱性蛋白酶、亮氨酸氨肽酶和谷氨酰胺酶等单位菌体量的酶量生成高，酶活也高，并且发酵前期酱醪ph值高也有利于乳酸菌的生长，有利于发酵出优质风味的酱油。

基于此，本申请的发明人尝试以目前普遍使用的生产菌种为出发菌株，通过诱变选育来获得能够提高成曲ph、增强蛋白酶活力的米曲霉菌株。具体的，本发明所采用的诱变选育方法如下所示。

1、以米曲霉as3.951为出发菌株，采用公知诱变方法对出发菌株进行诱变获得突变菌落。交叉使用ph指示剂变色平板培养基和豆汁平板培养基对突变菌落进行筛选，即，在ph指示剂变色平板上挑选菌落周边没有从红色变成黄色的菌株，得到成曲ph值高的新菌株；在豆汁平板上面挑选菌丝生长旺盛且周期长、菌丝体含量多、菌落产孢子略少的菌株。挑选同时满足双平板筛选条件的新菌株转接豆汁斜面，培养成熟后进行常规保藏并进行初步筛选。其中，所述ph指示剂平板培养基的配方为：1000ml米曲汁(9～10°be’)，150mm柠檬酸，2.5ml曲拉通x-100，1g苯酚红，调节ph7.0，20g琼脂粉，0.1mpa、121℃灭菌20min。豆汁平板培养基采用豆汁斜面生产配方。

2、初筛方法为保藏菌种由豆汁斜面活化后转接三角瓶培养，观察米曲霉生长情况。挑选菌丝生长旺盛和孢子着生正常的突变菌株，采用常规方法检测成曲的发芽率和孢子数，优选发芽率高的菌株进行复筛。

3、复筛方法为按照常规酱油生产方法进行小规模的制曲，检测制曲成曲孢子数、原料消耗率、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、亮氨酸氨肽酶、和谷氨酰胺酶活力，优选综合酶活力高的菌株进行生产试用。

4、生产试用为按照常规酱油生产方法进行酱油生产，检测制曲成曲指标和发酵酱油质量。

通过以上方法，获得了本发明的诱变菌株米曲霉(aspergillusoryzae)za184：

1、本发明的米曲霉za184于2018年8月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为gdmcc.no：60429。

2、本发明的米曲霉za184的菌落特征如下：豆汁平板培养基培养72h，菌落直径在52mm左右，菌落鲜绿色，孢子粗细正常，菌落表面生长较平整，边缘菌丝略长、菌丝层厚薄一般；ph指示剂平板培养基培养96h，菌落直径在20mm左右，菌落周边培养基色泽红色无变色，菌落边缘菌丝稀薄不明显，中间孢子密集、色泽绿色。

3、本发明的米曲霉za184的创新之处至少在于：

3.1利用本发明的米曲霉za184制曲可以获得出曲ph值高、平均菌体量的酶量多的成曲；制曲成曲中性蛋白酶活力、碱性蛋白酶活力、亮氨酸氨肽酶活力和谷氨酰胺酶活力高；发酵原油总酸低、氨基氮高、全氮高。

3.2本发明的米曲霉za184具有制曲蛋白水解速度快、能够显著缩短发酵周期。制曲成曲ph值高，使得单位菌体量生成的碱性蛋白酶、亮氨酸氨肽酶和谷氨酰胺酶等酶量高；并且添加盐水后发酵酱醪中的初始ph值高，各种酶的有效酶活力高，水解作用强且快速，可以缩短发酵周期。

因此，在一个方面，本发明提供了一种米曲霉(aspergillusoryzae)za184，其于2018年8月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为gdmcc.no：60429，保藏地址为中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

在另一个方面，提供了本发明的米曲霉za184在制曲中的用途。在某些实施方案中，所述制曲获得的成曲用于制备酱油。

在另一个方面，提供了本发明的米曲霉za184在制备酱油中的用途。

在另一个方面，提供了本发明的米曲霉za184用于提高成曲ph、增强成曲酶活力的用途。在某些实施方案中，所述成曲酶选自中性蛋白酶、碱性蛋白酶、亮氨酸氨肽酶、谷氨酰胺酶及其任意组合。

在另一个方面，本发明提供了一种成曲，其由本发明的米曲霉za184制备获得。

在另一个方面，本发明提供了一种酱油，其由本发明的成曲制备获得。

本发明的酱油可以依照传统酱油酿造工艺制作。在某些实施方案中，本发明的酱油可以通过以下步骤获得：

1)选豆：所选黄豆要颗粒均匀，干燥，无皱皮，相对密度大，且无霉烂变质，无损坏；

2)泡豆：分别将黄豆去除泥砂等杂质，置于温水中浸泡至软硬适度，豆心发白；

3)煮豆：再将豆类原料于高压锅中分别蒸煮至软硬适度，易于被米曲霉利用；

4)拌料：取蒸煮后黄豆，拌入面粉，混合均匀；

5)制曲：接入本发明的米曲霉za184，混合均匀，在曲池培养至菌丝发白，曲料松散，成曲结束后，收曲备用；

6)发酵：加入盐水浸泡、发酵，压榨、过滤制备获得酱油。

在另一个方面，本发明提供了一种制备成曲的方法，其包括将本发明的米曲霉za184接种到酱油原料中并进行培养。

在某些实施方案中，所述酱油原料是豆类原料和淀粉质辅料的混合物。

在另一个方面，本发明提供了一种制备酱油的方法，其包括制曲和发酵的步骤，其中，所述制曲包括将本发明的米曲霉za184接种到酱油原料中并进行培养。

在某些实施方案中，所述酱油原料是豆类原料和淀粉质辅料的混合物。

在某些实施方案中，使用低盐固态发酵法进行所述发酵。

在某些实施方案中，所述方法包括以下步骤：制曲；将制曲获得的成曲和盐水混合制成酱醅；发酵所述酱醅。

在某些实施方案中，使用低盐固态发酵法对所述酱醅进行发酵。

在某些实施方案中，所述方法包含下列步骤中的一项或多项：

预处理豆类原料；

预处理淀粉质辅料；

将预处理后的豆类原料和淀粉质辅料混合，添加米曲霉za184并进行培养，制备成曲；

将成曲和盐水混合制成酱醅；

发酵酱醅；

发酵完成后，从发酵产物中分离发酵完成的酱汁；

对发酵完成的酱汁进行调配、杀菌、灌装或其任意组合，获得酱油。

发明的有益效果

本发明至少具有以下技术优势和积极效果：

1、本发明za184菌株的筛选方法具有普适性，可以广泛应用于丝状真菌的改造。

2、本发明提供的米曲霉za184，制曲成曲ph高，且高产具备高酶活的中性蛋白酶、碱性蛋白酶、亮氨酸氨肽酶和谷氨酰胺酶，应用该菌株酿造酱油等调味品，能够显著缩短发酵周期，尤其特别适合低盐固态酿造酱油，经济效益显著。

酱油企业可以利用本发明提供的方法来改良现用菌株，以尝试筛选出一株具备上述特性的优良米曲霉菌种；应用该菌株可以实现缩短酱油生产发酵周期，实现节能增效。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1为米曲霉za184的获得流程图。

图2为米曲霉za184在豆汁培养基上的菌落形态图。

关于生物材料保藏的说明

本发明涉及下列已在广东省微生物菌种保藏中心(中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼)进行保藏的生物材料：

米曲霉(aspergillusoryzae)za184，其具有保藏号gdmcc.no：60429，且保藏日期为2018年8月13日。

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明实施例所用培养基和试验条件为本领域常规培养基和试验条件。除非特别说明，本发明实施例所用试剂均为市购。

实施例1.米曲霉za184的获得

图1显示了本发明的米曲霉za184的获得流程图。

1、菌种诱变

取米曲霉中科as3.951菌株的成熟斜面孢子制成孢子悬液，并对孢子悬液进行artp诱变。用0.85％的无菌生理盐水将诱变后的孢子悬液逐级稀释到10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6浓度，制成孢子稀释液。

取0.2ml孢子稀释液涂布于ph指示剂平板培养基(1000ml米曲汁(9～10°be’)，150mm柠檬酸，2.5ml曲拉通x-100，1g苯酚红，调节ph至7.0，20g琼脂粉，0.1mpa、121℃灭菌20min)上，31℃避光培养96h。培养过程中观察并记录菌落周边培养基色泽有无变化、菌丝生长和产孢情况等。挑选菌落周边培养基色泽红色无变化、且生长正常的突变株。

将上述ph指示剂平板上挑选出的目标菌落继续涂布于豆汁平板培养基上，31℃培养72h。培养过程中观察并记录菌落的菌丝生长和产孢情况等。挑选菌丝生长旺盛且周期长、菌丝体含量多、菌落产孢子略少的菌落。

选取在双平板培养基(豆汁平板培养基及ph指示剂平板培养基)上面菌落周边培养基红色无变色、菌落生长好、菌丝粗壮且生长旺盛、孢子生成量略少的菌落为目标菌落，转接豆汁斜面培养，分别编号为hc180、hc181、hc182、hc183、hc184、hc185。

2、诱变菌株筛选

(1)诱变菌株的初筛

将诱变获得的上述6株目标菌种活化转接于试管豆汁斜面培养基上，培养四天。取成熟斜面分别接种于由麸皮、豆粉、面粉和水制备成的三角瓶培养基中进行扩培。挑选菌丝生长旺盛和孢子着生正常的突变菌株hc180、hc181、hc182、hc183、hc184、hc185检测成曲指标孢子数及发芽率，并以出发菌株(as3.951)为对照菌株，检测结果见表1。优选生长正常和发芽率高的菌株hc180、hc181、hc182、hc183、hc184进行复筛。

表1：经不同菌株获得的成曲质量分析结果