一种肌内脂肪沉积FASN基因及其应用的制作方法

本发明属于猪分子育种技术领域，主要涉及到猪肌内脂肪沉积fasn基因及其在猪肌内脂肪分子育种中的应用。

背景技术：

中国是第一养猪大国，也是第一猪肉消费大国，长期以来养猪业在稳定我国国民经济和提高人民生活水平中发挥着重要的作用。在过去十几年中，人们对猪的选育主要是在于猪肉产量的需求例如增加肌肉的沉积及胴体的瘦肉，但是往往会导致了脂肪储存及沉积的减少。这种选育方式也造成了肌肉中总的脂质含量逐渐降低，尤其是在一些人们倾向于选择瘦肉量沉积的品种中。例如，大白猪选育显著地降低了大理石花纹的含量，从过去1960年的2-4％降到现在的1％。当今随着消费者对猪肉品质要求的不断提高，安全优质的猪肉能够直接影响消费者购买力等。因此，如何提高猪肉质品质已成为当今畜牧遗传育种的研究热点。

肌肉内脂肪主要包括肌内脂肪和肌间脂肪，而肌内脂肪是指沉积在肌纤维之间和肌纤维束之间的脂肪。肌内脂肪是评价猪肉品质的一个重要指标，其与肉的嫩度、风味等肉品质性状有着密切的联系。肌内脂肪含量较低时，则能够导致肉变得干燥而口味不佳。然而，当肌内脂肪含量增加到大约2.5％时，肉的风味和多汁性是显著增加的。此外，肌内脂肪能够直接影响肉的风味和多汁性，而且间接的影响嫩度。因此，肌内脂肪对肉品质有着至关重要的作用。

在过去几十年，许多影响肌内脂肪的qtl、候选基因及其qtn已经被报道。然而，它们能被应用在商品猪的育种体系中的屈指可数。fasn是哺乳动物体内内源性脂肪合成的关键酶，以乙酰辅酶a为引物，丙二酰辅酶a为双碳供体及nadph为供氢体合成一种16碳的棕榈酸酯。此外，fasn基因在动物体脂生成和沉积中有着非常重要的作用。fasn基因在许多哺乳动物中完成克隆和测序，例如，小鼠的fasn基因位于17号染色体，羊的位于11号染色体，而猪的位于12号染色体。在一些动物中也检测得到，fasn基因在脂肪组织中高表达。然而，fasn基因在猪肌内脂肪的研究甚少，最近，本课题组通过rna-seq技术筛选到脂肪酸合成酶(fasn)基因可能是影响肌内脂肪含量的一个候选基因，进一步研究fasn表达水平与猪肌内脂肪含量的相关分析，能够为将来应用于分子选育奠定理论基础。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了一种肌内脂肪沉积相关的fasn基因全长克隆的方法，并建立了利用其表达量筛选猪肌内脂肪含量高或者低的个体方法，所获得的基因全长序列为将来利用该基因进行猪肌内脂肪性状的遗传改良奠定基础。

为了实现上述目的，本发明通过以下技术实现：

一种猪肌内脂肪沉积fasn基因，该基因具有如seq.id.no.2所示的cds核苷酸序列。该基因的cdna全长核苷酸序列如seq.id.no.1所示。

本发明首先根据ncbi数据库中猪fasn基因部分mrna序列(nm_001099930)，然后采用smarterrace技术对fasn基因的5’和3’utr区域进行克隆与测序，此外设计9对引物对fasn基因cds区域进行克隆与测序。将所有测序片段进行拼接后得到fasn基因cdna全长序列，其核苷酸序列特征如seq.id.no.1所示；其中cds核苷酸序列特征如seq.id.no.2所示，其所编码的氨基酸序列如seq.id.no.3所示。

上述的猪肌内脂肪沉积fasn基因在猪肌内脂肪含量遗传改良中的应用。

上述的猪肌内脂肪沉积fasn基因在筛选猪肌内脂肪含量高或者低的个体中的应用。

一种利用上述fasn基因的表达量筛选猪肌内脂肪含量高或者低的个体的方法，包括以下步骤：

(1)采集猪肌肉组织的总rna，然后以rna为模板进行rt-pcr；

(2)根据肌内脂肪沉积fasn基因的核苷酸序列设计定量引物，以步骤(1)的rt-pcr产物为模板进行实时定量pcr；

(3)统计实时定量pcr结果，对所述的fasn基因在肌肉组织中mrna表达水平进行检测与分析，根据fasn基因在肌肉组织mrna表达水平判断猪肌内脂肪含量的高低，筛选猪肌内脂肪含量高或者低的个体。

步骤(2)中所述的定量引物：

正向引物(f)：tcctccgctcgctccatcct

反向引物(r)：ccatcgtgttcgcctgcttg。

本发明采集猪的心、肝、脾、肾、肌肉及脂肪组织的总rna，然后进行rt-pcr；利用seq.id.no.1序列设计的定量引物对fasn在不同组织mrna表达水平进行检测与分析。结果显示，fasn是一个脂肪组织高丰度表达的基因。

同时，选取30个高或者低肌内脂肪个体，表型检测结果显示它们之间的肌内脂肪含量是差异极显著(p<0.01)(表1)；然后利用定量引物对其在背最长肌中的表达水平进行检测。定量结果表明，fasn基因在肌内脂肪高组个体中的表达水平极显著高于肌内脂肪低组个体，是一个可应用于高肌内脂肪猪个体选择的关键基因。

表1高低肌内脂肪含量个体的统计结果

**统计结果差异极显著，p<0.01。

本发明的有益效果：

本发明提供了从杜洛克×梅山杂交猪的背最长肌组织分离、克隆了与肌内脂肪相关的脂肪酸合成酶(fattyacidsynthase，fasn)基因，其长度为8127bp，包括7539bpcds、97bp5’utr及491bp3’utr，其核苷酸序列如seq.id.no.1；cds核苷酸序列如seq.id.no.2；编码的氨基酸序列为seq.id.no.3。此外，检测了fasn基因在心、肝、脾、肾、肌肉及脂肪组织中的mrna表达水平，结果显示它在脂肪组织中极其高表达。进一步检测了fasn基因与肌内脂肪含量的相关性，结果表明了fasn基因表达水平在高肌内脂肪个体中显著高于其在低肌内脂肪个体。本发明可以为今后猪肌内脂肪含量性状的选育提供了分子基础。同时也为将来利用该基因进行猪肌内脂肪性状的遗传改良奠定基础。

附图说明

图1：是利用本发明中扩增fasn基因cds的电泳图谱。

图中：m：dna分子量标准(dl5000:5000，3000，2000，1000，750和500)；1，2，3，4，5，6，7，8和9分别代表9对引物pcr扩增片段；

图2：是本发明中扩增fasn基因5’和3’utr片段的电泳图谱。

图中：m：dna分子量标准(dl2000:2000，1000，750，500，250和100)；5’泳道：5’utr扩增片段。3’泳道：3’utr扩增片段。

图3：是本发明中检测心、肝、脾、肾、肌肉及脂肪组织中fasn基因的表达谱结果。n＝3，**表示p<0.01。

图4：是本发明中高或低肌内脂肪个体的fasn基因表达水平的统计结果。

图中，h:高肌内脂肪组；l：低肌内脂肪组。n＝30，**表示p<0.01。

具体实施方式

实施例1:

1.fasn基因全长cdna序列克隆与测序

1)肌肉组织样品收集及总rna的提取

采集杜洛克×梅山杂交猪的背最长肌立即冻存在液氮中，然后运输回实验室后保存于-80℃，直到提取rna。利用trizol方法提取肌肉组织的总rna保存于-80℃。

2)cdna合成

以肌肉总rna为模板，利用takara公司的primescript^tmrtmastermix试剂盒进行rt-pcr反应。

反应体系：共20ul，包括4ul5×primescriptrtmastermix，1ugrna及用rnasefreedh2o补至20ul；

反应程序：37℃15min；85℃5s。

3)fasn基因cds扩增、克隆与测序

①利用primerpremier5.0设计扩增引物。用于克隆fasn基因cds区引物的序列如表2所示。以cdna为模板，利用takaralataq进行pcr扩增。

②反应体系：共20μl，包括1μlcdna,上下游引物各0.5μl，10μltakaralataq及8μlddh2o。

③反应程序：98℃10min；30个循环包括98℃10s,退火温度30s,72℃1min；72℃10min。

④扩增产物检：pcr产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后(图1)，将目的片段凝胶切下后利用凝胶回收试剂盒对目的片段进行纯化；纯化后的目的片段克隆到pmd18-t载体，并且将连接产物转化到dh5α；挑取单克隆接入1.5ml含1000μl氨苄青霉素(amp)的lb培养液中，并于37℃摇床培养约12h后送至金唯智生物科技有限公司进行测序。

表2本研究中所用的引物序列

4)fasn基因5’utr及3’utr的扩增、克隆与测序

①race-readycdna：合成以肌肉rna为模板，利用smarterrace试剂盒进行race-readycdna合成。

②反应体系：4.0μl5×first-strandbuffer，0.5μldtt(100mm)，1.0μldntps(20mm)，1.0μgrna，1.0μl5’-cdsprimeraor3’-cdsprimera，0.5μlrnaseinhibitor(40u/μl)，2.0μlsmartscribetmreversetranscriptase(100u)及用sterileh2o补至20ul。

③反应程序：42℃90min；70℃加热10min。

④5’cdna和3’cdna片段扩增。用于克隆fasn基因5’utr及3’utr的扩增序列如表2所示：

⑤反应体系1：15.5μlpcr-gradeh2o，25.0μl2×seqamptmbuffer，1.0μlseqampdnapolymerase，2.5μl5’-或3’-race-readycdna，5μl10×upm，1μl5’or3’gsp(10μm)。

⑥反应程序1：5个循环包括94℃30s，72℃3min；5个循环包括94℃30s，70℃30s，72℃3min；10min；20个循环包括94℃30s，68℃30s，72℃3min。

进一步以上面pcr反应产物为模板进行巢式pcr。

⑦反应体系2：共20μl，包括1μl5’或3’cdna,upmshort及5’或3’ngsp引物各0.5μl，10μltakaralataq及8μlddh2o。

⑧反应程序2：98℃10min；30个循环包括98℃10s，退火温度30s，72℃1min；72℃10min。

⑨扩增产物检测：pcr产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后(图2)，将目的片段凝胶切下后利用凝胶回收试剂盒对目的片段进行纯化；纯化后的目的片段克隆到pmd18-t载体，并且将连接产物转化到dh5α；挑取单克隆接入1.5ml含1000μl氨苄青霉素(amp)的lb培养液中，并于37℃摇床培养约12h后送至金唯智生物科技有限公司进行测序。

将所有测序片段进行拼接后得到fasn基因cdna全长序列，其核苷酸序列特征如seq.id.no.1；其中cds核苷酸序列特征如seq.id.no.2，氨基本序列如seq.id.no.3所示。

实施例2:fasn基因在不同组织及高低肌内脂肪组中表达水平的检测

1)样品采集

采集杜洛克×梅山杂交猪的心、肝、脾、肺、肾、背最长肌及脂肪组织；此外，从279头皮特兰×杜洛克×长白×大白四元杂交猪实验猪群中筛选出了60头高低肌内脂肪个体(30个极端高组个体与30头极端低组个体)。利用trizol方法从背最长肌中提取肌肉组织的总rna，并且将rna保存于-80℃备用。

2)cdna合成

以肌肉总rna为模板，利用takara公司的primescript^tmrtmastermix试剂盒进行rt-pcr反应。

反应体系：共20ul，包括4ul5×primescriptrtmastermix，1ugrna及用rnasefreedh2o补至20ul；

反应程序：37℃15min；85℃5s。

3)检测不同组织及高低肌内脂肪组中fasn基因mrna水平

利用real-timepcr进行fasn基因mrna表达水平的检测。

体系为20μl，包括10μlqpcrgreenmastermix(withoutrox)、0.25μl上下游引物(10μm)、2.0μl模板cdna、7.5μl灭菌蒸馏水。

反应程序包括，预变性：95℃5min；40个循环(95℃，10s；60℃，30s)；融解曲线：95℃15s；60℃1min；95℃15s。

所有样品pcr反应执行3个重复，基因相对表达水平采用△△ct方法进行计算，以gapdh基因作为内参基因进行基因相对表达水平校正。利用prism5.0或者r语言进行作图，利用独立性t检验比较不同组别之间的差异显著性。基因表达水平检测结果表明，猪fasn主要在脂肪组织中表达，而在其他组织中表达极低(图3)；此外，fasn基因mrna水平在高肌内脂肪的个体中显著高于低肌内脂肪个体中(表1；图4)。综上，fasn基因表达定量检测方法可作为筛选猪肌内脂肪含量高或者低个体的有效方法。

序列表

<110>南京农业大学

<120>一种肌内脂肪沉积fasn基因及其应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>8127

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ggagccagagagacggcagcggccgggcctcatctcctccgctcgctccatcctcgctct60

ccctccgccacccgtctccagaccagagagagcagccatggaggaggtggtgatcgccgg120

catgtccgggaagctgcccgagtcggagaacctggaggagttctgggccaacctcatcgg180

cggcgtggacatggtgacggccgacgacaggcggtggaaggcggggctgtacggcctgcc240

ccggcggatgggcaagctgaaggacctgtcccgcttcgacgcctccttcttcggggtcca300

ctccaagcaggcgaacacgatggacccccagctgcggatgctgctggaggtcacctacga360

ggccatcgtggacggaggcatcaaccctgcttcccttcgtggcacgagcaccggtgtctg420

ggtgggtgtgagcagctctgatgcctcagaggctctgagccgagaccccgagaccctcgt480

gggctacagcatgataggctgccagcgcgccatgatggccaaccgtgtctccttcttctt540

tgacttcaaggggcccagcatcaccatagacacggcctgctcctccagcctgctggctct600

gcagtccgcctaccaggccattcgcggaggggagtactctgcggccgtcgtgggcggcct660

caacgtcctgctgaagcccaactcctcgctgcaattcatgaagctgggcatgctcagcca720

ggacggcacctgcaggtccttcgatgccgaagggaccggctattgccgtgcggaggccgt780

ggtggcggtcttgctgaccaagaagtccctggcccgacgggtatacgccaccatcctcaa840

tgcgggcacgaacacagacggttccaaggagcaaggtgtgaccttcccctcgggagacgt900

gcaggagcagctcatccgctccctgtacgcgccagccgggccggaccccgagtccctgga960

gtacatcgaagcccacggcaccggcaccaaggtgggcgacccccaggagctgaacggcat1020

cgtgaatgccctgtgtgccacccgccgggagcccctgttgatcggatccaccaagtcgaa1080

catgggacacccggagcctgcctcgggggtcgcggcgctgatcaaggtgctgctgtcgtt1140

ggagcatggggtctgggccccgaatctgcactaccacaccccgaaccccgagatcccagc1200

attgcaggacgggcggctacaggtggtggaccggcccctgcccatccgtgggggcaacgt1260

gggcataaactccttcggcttcggcggctccaacgtgcacgtcatccttcagcccaactc1320

ccgccccgccccaccgcccgcccagcatgccgcgctgccccgtctgctgcaggccagcgg1380

gcgcaccctcgaggccgtgcagaccctgctggagcagggcctccggcacagtcgagacct1440

ggcctttgtgggcatgctcaacgagatcgcggctgtctccccggtcgccatgtccttccg1500

cggctacgccgtgctgggcggcgaggccggcagccaggaggtgcagcaggtgccaggcag1560

caagcgcccggtctggttcatctgctcagggatgggcgcacagtggcaggggatggggct1620

gagcctcatgcgcctggaccgcttccgcgactccatcctgcgctcggaccaggccttgaa1680

gcctctggggctgcgggtgtccgacctgctgctgagcacggacgaggccgtcctcgacga1740

catcgtctcttccttcgtgagcctcacctccatccagatcgccctcatagacctgctgac1800

ctccttgggcctgcagcctgacggcatcatcgggcactccctgggcgaggtggcctgcgg1860

ctatgccgacggctgcctgacccaggaggaggctgtgctctccagctactggaggggcta1920

ttgcatcaaggaggccaacgtcctgccaggggccatggcagccgtgggcttgtcctggga1980

agagtgtaagcagcgctgcccccctggcatcgtgcccgcctgccacaactccaaagacac2040

ggtgaccatctcgggacctcaggccgctatgtccgagttcctgcagcagctgaagcggga2100

ggacgtgtttgtcaaggaggtgcggacgggcggcatcgccttccactcctacttcatgga2160

gtccatcgcccccacgctgctgcgccagctcaggaaggtgatcctggatccgaagccccg2220

ctccaagcgctggctcagcacctccatccctgaggcccagtggcagggcagcctggcccg2280

caccttctcggccgagtacagcgtcaacaacctggtgagcccggtgctgttccaggaggc2340

gctgcagcacgtgcccgcgcacgccgtggtggtggagatcgccccgcacgccctgctgca2400

ggccgtgctgaagagaagcctcgagtccagctgcaccatcatcccgctgatgaagaagga2460

ccacagggacaacctggagttcttcctcagcaacgtgggcaggctccacctggcgggcgt2520

cagcgtcaaccccaacggtctgttcccacccgtggagttccctgctccccgggggactcc2580

cctcatctccccgcacatcaagtgggaccacagccaggcctgggatgtgccctccgcggc2640

cgacttccccagcggctccagctgctcctctgtcgccgtctataagttcgacgtcagccc2700

ggagtccccggatcactaccttgtggatcactgcatagacggccgggtccttttccctgg2760

cactggctacctgtggctgacctggaagacgctggcacgagccctgagccagaacttgga2820

ggagacgcctgtggtgtttgaggacgtgacgctgcaccaggccaccatcctgcccaagac2880

cgggaccgtgtccttggaagtgcggcttctagaggcttcccacgcctttgaggtgtctga2940

cagcaacggcagcctgatcgcaagcgggaaggtgtaccagtgggagagccctgaccccaa3000

gctctttgacacccgggccgccgtggaccccgcggactccacggctgagttccgcctgag3060

ccagggcgacgtgtacaaggatctgcggctgcggggctatgactacgggcccttcttcca3120

gctcgtcctcgagagcgacctcgaagggaacaggggccgcctgcagtggaacgacagctg3180

ggtgagcttcctggacgccatgctgcacatgtccatcctggcccccggccagctcggcct3240

gtacctgcccacgcgtttcacctccatccgcatcgaccccatcacccaccggcagaagct3300

gtacacgctgcaggacaccacccaagcggccgacgtggtggtggacaggaatctgaacac3360

agtggtggctggaggcgccctcttcttgggggcccactcctcagtggccccacggcgacc3420

ccaggagcatctcaagcctatcctggagaagttctgcttcacaccccacgtggagagcgg3480

gtgcctggccgggaacacggccctgcaggaggagctgcagctgtgcagggggctggcaca3540

ggcactgcagaccaaggtggcccagcaggggctgaagatggtggtacctgggctggacgg3600

tgcccaggccccccgggaggccccgcagcagagcctgcctcggctgctggctgccgcctg3660

ccagctgcaactcaacgggaacctgcagctggaactgggccaggtgctggcccaggagag3720

gcctctgctgtgtgatgaccccctgctcagcggcctcctcgacgccccggcactcaaggc3780

gtgcgtggacaccgccctggagaacatggccagccccaagatgaaggtggtggaggtgct3840

ggctggtgacggccaactgtactcccgcatcccggcgctgctcaacacccagcccgtgat3900

ggatctggactacacggccactgaccgcaacccgcaggccctggaggccgcccaggccaa3960

gctggagcagctccacgtgacccagggccagtgggaccccgccaacccagcccctggcag4020

cctgggcaaggctgacctcctggtgtgcaactgtgccctggccaccctcggcgacccggc4080

tgtggctgttggcaacatggcagccaccctgaaggaggggggcttcctgctgctgcacac4140

gctgctcgcaggacaccccctcggggagatggtcggcttcctcacctcccctgagcaagg4200

cggcaggcacctcctgagccaggaccagtgggagagcctgttcgctggggcgtccctgca4260

cctggtggccctgaagaggtccttctacggctccgtgctcttcctgtgccgccagcagac4320

cccacaggacagccccgtcttcctgtccgtggaagacactagcttccgttgggtcaactc4380

actgaaggacatcctggccgacgcctcctcccggccggtgtggctgatggctgttggctg4440

cagcacctcgggcgtcgtgggcatggtgaactgtctccgaaaagagcccggcggccaccg4500

cattcggtgcgtcctggtgtccaacctcagcagcacgtcgcccgcccctgagatgcaccc4560

gagctcctcggagctgcagaaggtgctgcagggggacctggtgatgaacgtctaccggga4620

cggagcctggggggccttccgccacttcccgctggagcaggaccggccagagaagcagac4680

ggagcacgccttcgtaaacgtcctcagccggggggacctctcctccatccgctgggtctg4740

ctccccgctgcactacgccctgcccgcctcctgccaggaccgcctctgcagtgtctatta4800

cacctccctcaacttccgagacgtcatgctggccacgggcaagctgtcccctgactccat4860

cccaggaaagtggctcactcgagactgcatgctgggcatggagttctccggccgagatgc4920

cagcggcaggcgcgtgatgggaatggtgcccgcggaaggcctggccacctctgttctgct4980

gcttcagcacgccacctgggaggtgccctccacctggaccctggaggaggcagcgtcggt5040

gcccatcgtctacacgacggcctactactcgctggtggtgcgagggcgcatgcagcccgg5100

ggagtcggtgctcatccactcgggctcgggcggcgtgggccaggccgccatcgccatcgc5160

cctcagccggggctgccgcgtcttcaccaccgtggggtcggccgagaagcgggcgtacct5220

ccaggccaggttcccccagctcgacgagacctgcttcgccaactcccgcgacacgtcctt5280

tgagcagcacgtgctgcggcacacggccgggaagggtgtcgacctggtcctgaactccct5340

ggcggaagagaagctgcaggccagcgtgcggtgtctggcccagcacggccgcttcctgga5400

aatcggcaaattcgacctttccaacaaccacgccctgggcatggccgtcttcctgaagaa5460

tgtgaccttccacgggatcctgctggactcgctctttgaggagggcggcgccacctggca5520

ggaggtgtcggagctgctgaaggcgggcatccaggagggcgtggtgcagccgctcaagtg5580

caccgtgttccccaggaccaaggtggaggccgccttccgctacatggcccagggcaagca5640

cataggcaaagtggtcatccaggtgcgcgaggaggagcaggggccggcgccgcgcgggct5700

gccgcccatcgcattgaccggcttgtccaagaccttctgccccccccacaagagctacgt5760

catcaccgggggcctgggcggcttcggcctgcagctggcgcagtggctccggctgcgagg5820

ggcccagaagctggtgctcacctcccgctcgggcatccgcacaggctaccaggccaggca5880

ggtccgagagtggagacgccagggcgtccaggtcctggtgtccaccagcaacgccagctc5940

gctggacggcgctcggagcctcatcactgaggccacacagcttgggcccgtgggaggcgt6000

cttcaacctggccatggtcctgagagacgccgtgctggagaaccagaccccggagttctt6060

ccaggacgtcagtaagcccaagtacagcggcaccgcgaacctggacagggtgacccggga6120

ggcgtgtcccgagctggactacttcgtgatcttctcctccgtgagctgcgggcgcggcaa6180

tgccggccaggccaactacggcttcgccaactctgccatggagcgcatctgcgagaagcg6240

ccggcacgacgggctcccaggcctcgccgtgcagtggggtgcgatcggcgacgtgggcgt6300

cgtcctggagaccatgggcaccaacgacacggtcatcggcgggacgctgccccagggcat6360

cgcctcctgcctggaggtgctggatctcttcctgagccagccccaccccgtcctgagcag6420

cttcgtcctggctgagaagaaggccgccgcccccagggacggcagcagccagaaggacct6480

ggtcaaggccgtggctcacatcctgggcatccgggacgtggcccccatcaatccggacag6540

cacgctggtggacctgggcctggactcgctcatgggcgtggaggtgcgccagatactgga6600

gcgagagcacgacctggtgctgtccatgcgggaggtgcggcagctcagcctccggaagct6660

acaggaactctcctcgaagaccagcacggacgccgacccggcgactcccacatccaacga6720

ggacagccctgtgcggcagcaggcaacgctgaacctgagcaccctgctggtgaaccccga6780

gggcccgaccttgacgcggctcaactccgtgcagagcgcagagcggcccctgttcctggt6840

ccaccccatcgagggctccatcaccgtgttccacggcctggccgccaagctcagcatccc6900

cacctacggcctgcagtgcacgggagccgccccgctggacagcatccagagcctggcctc6960

ctactacatcgagtgcatcagacaggtgcagcccgaggggccttaccgcatcgccggcta7020

ctcttacggggcctgcgtggccttcgagatgtgctcgcagctgcaggcccagcagagcgc7080

cacccccgggaaccacagcctcttcctgttcgacggctcacacaccttcgtgctggccta7140

cacgcagagcgtccgcgctaagatgacccccggctgcgaggccgaggccgaggccaaggc7200

catgtacttcttcgtgcagcagttcaccgacatggagcaaggcaaggtgctggaggcgct7260

gataccgctccagggcctggaggcgcgcgtggcggccaccgtggacctgatcacgcagag7320

ccacgcgggcctggaccgccacgccctcagcttcgccgctcgctccttctaccagaagct7380

gcgcgccgccgagaactactggccgcaggccacctaccacggcaacgtgacgctgctgcg7440

cgccaagacgggcggcgcctacggcgaggacctgggcgccgactacaacctgtcgcaggt7500

gtgcgacggcaaggtctcggtgcacgtcatcgagggcgaccaccgcacgctgctggaggg7560

cagcggcctggagtccatcctcagcatcatccacagctgcctggccgagccgcgcgtcag7620

cgtgcgggagggctaggccgccccgcagggccggcgcccgcccccgcccccgcccccggg7680

cgaggcggcgccgggtgtggggccgggacccacgccaccgccaccgctcggagacctgct7740

cggtctgtgaagagtcggcccagcctctcgcggggcggggctgcctgtcccttctccgtg7800

ggattctcctatttattgtgctgccgggaggcgccggccgggccacccaggaggccggcg7860

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acccacccctgctcccctgtgttctgtctgtcgagacacgtggctcgagtcgcggccttg7980

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