一种两栖类动物细胞解离试剂盒的制作方法

本发明涉及一种两栖类动物细胞解离试剂盒。
背景技术：
：以蝾螈为代表的诸多两栖动物具有强大的再生能力，但是由于其自身特性如细胞渗透压、生活适应温度与哺乳动物有较大差异，其细胞分离和培养方法丞待突破。现在以两栖类动物为实验对象的实验室多数以组织整体为研究对象，缺少对细胞异质性的探索，在一些科学问题上停滞不前。且对哺乳动物而言最常见的将组织或培养的细胞解离成单细胞的方法就是酶解的方法，而胰酶因为价格便宜、作用强，成为现在实验室最常用酶。现有技术中存在的问题如下：(1)若以哺乳动物各类型的细胞解离方法，则存在解离温度不适宜，无法控制酶的活性，细胞难以维持和体内相同的状态，若以此为研究对象并不能确保实验结果的真实性；(2)解离效率不高，为了达到研究要求，需要解离更多组织，增加实验成本；(3)胰酶本身作用比较强，容易造成细胞膜损伤，引起细胞凋亡，难以保证细胞活率，不利于后续研究。技术实现要素：本发明的目的是提供一种两栖类动物细胞解离试剂盒。本发明要求保护一种用于解离两栖类动物组织获得细胞的试剂盒，所述试剂盒包括以下试剂：试剂c、试剂d、试剂e和试剂f。所述试剂c含有胶原酶ⅰ和分散酶ⅱ，胶原酶ⅰ的浓度为43000-53000u/100ml,分散酶ⅱ的浓度为90-110units/100ml。所述试剂d含有胶原酶ⅰ，胶原酶ⅰ的浓度为55000-65000u/100ml。所述试剂e含有胰蛋白酶和金属离子螯合剂，胰蛋白酶的浓度为120000-180000uspu/100ml，金属离子螯合剂的浓度为0.03-0.07g/100ml。试剂f含有胶原酶ⅱ，胶原酶ⅱ的浓度为50000-55000u/100ml。所述试剂c含有胶原酶ⅰ和分散酶ⅱ，胶原酶ⅰ的浓度为48000u/100ml,分散酶ⅱ的浓度为100units/100ml。所述试剂d含有胶原酶ⅰ，胶原酶ⅰ的浓度为60000u/100ml。所述试剂e含有胰蛋白酶和金属离子螯合剂，胰蛋白酶的浓度为150000uspu/100ml，金属离子螯合剂的浓度为0.03-0.07g/100ml。试剂f含有胶原酶ⅱ，胶原酶ⅱ的浓度为52200u/100ml。所述试剂c含有胶原酶ⅰ和分散酶ⅱ，胶原酶ⅰ的浓度为0.1-0.3g/100ml,分散酶ⅱ的浓度为0.1-0.3g/100ml。所述试剂d含有胶原酶ⅰ，胶原酶ⅰ的浓度为0.2-0.3g/100ml。所述试剂e含有胰蛋白酶和金属离子螯合剂，胰蛋白酶的浓度为0.4-0.6g/100ml，金属离子螯合剂的浓度为0.03-0.07g/100ml。试剂f含有胶原酶ⅱ，胶原酶ⅱ的浓度为0.1-0.3g/100ml。所述试剂c含有胶原酶ⅰ和分散酶ⅱ，胶原酶ⅰ的浓度为0.2g/100ml,分散酶ⅱ的浓度为0.2g/100ml。所述试剂d含有胶原酶ⅰ，胶原酶ⅰ的浓度为0.25g/100ml。所述试剂e含有胰蛋白酶和金属离子螯合剂，胰蛋白酶的浓度为0.5g/100ml，金属离子螯合剂的浓度为0.05g/100ml。试剂f含有胶原酶ⅱ，胶原酶ⅱ的浓度为0.2g/100ml。所述试剂盒可用于从两栖类动物的皮肤、肌肉和骨骼中解离获得细胞。本发明还保护所述试剂盒的应用，为解离两栖类动物的器官或组织获得细胞。本发明还保护一种用于解离两栖类动物皮肤组织获得细胞的试剂盒，包括以上任一所述的试剂c。本发明还保护试剂盒的应用，为解离两栖类动物皮肤组织获得细胞。本发明还保护一种用于解离两栖类动物肌肉组织获得细胞的试剂盒，包括以上任一所述的试剂d和试剂e。本发明还保护试剂盒的应用，为解离两栖类动物肌肉组织获得细胞。本发明还保护一种用于解离两栖类动物骨骼组织获得细胞的试剂盒，包括以上任一所述的试剂f。本发明还保护试剂盒的应用，为解离两栖类动物骨骼组织获得细胞。以上任一所述试剂盒还可包括试剂a和/或试剂b。试剂a为清洗试剂。试剂b为预处理试剂。试剂b中含有0.05-0.15g/100ml金属离子螯合剂。试剂b中具体含有0.1g/100ml金属离子螯合剂。以上任一所述金属离子螯合剂具体可为edta-na2。edta-na2具体可以以纯品的方式提供，也可以通过水合化合物的方式提供。以上任一所述试剂c可以由胶原酶ⅰ、分散酶ⅱ和试剂a组成。以上任一所述试剂d可以由胶原酶ⅰ和试剂a组成。以上任一所述试剂e可以由含有胰蛋白酶、金属离子螯合剂和试剂a组成。以上任一所述试剂f可以由胶原酶ⅱ和试剂a组成。以上任一所述试剂a含有3-4mg/100ml硫酸庆大霉素、80-120单位/ml青霉素(碱)和80-120μg/ml链霉素(碱)。以上任一所述试剂a含有3.5mg/100ml硫酸庆大霉素、100单位/ml青霉素(碱)和100μg/ml链霉素(碱)。以上任一所述试剂a由硫酸庆大霉素、青霉素(碱)、链霉素(碱)、dpbs和无酶水组成。以上任一所述试剂a的制备方法具体可为按照表2取各个原料，充分溶解混匀，然后用0.22μm滤膜过滤，收集滤液，即为试剂a。本发明还保护一种解离两栖动物组织获得单细胞的方法，包括如下步骤：取皮肤组织，剪碎，用所述试剂c进行处理；取肌肉组织，剪碎，先加入所述试剂d进行处理，再加入所述试剂e进行处理；取骨骼组织，切碎，用所述试剂f进行处理。解离两栖动物组织获得单细胞的方法具体包括如下步骤：取皮肤组织，剪碎，置于试剂c中，室温浸泡1-3h，然后加入2倍体积的含10％血清的α-mem培养基以终止消化，然后用70μm细胞滤网过滤并收集滤液，滤液1000rpm离心5min，收集细胞沉淀，用含10％血清的α-mem培养基重悬；取肌肉组织，剪碎，置于试剂d中，室温浸泡1-2h，然后加入等体积试剂e并继续室温浸泡20min，然后加入2倍体积的含10％血清的α-mem培养基以终止消化，然后用70μm细胞滤网过滤并收集滤液，滤液1000rpm离心5min，收集细胞沉淀，用含10％血清的α-mem培养基重悬；取骨骼组织，在试剂a中清洗三次(每次3min)，然后用手术刀将其切碎成约1mm3的小块，然后置于试剂f中，室温浸泡1.5-2h(此时，组织块基本消失，溶液变浑浊)，然后加入2倍体积的含10％血清的α-mem培养基以终止消化，然后用70μm细胞滤网过滤并收集滤液，滤液1000rpm离心5min，收集细胞沉淀，用含10％血清的α-mem培养基重悬。本发明还保护一种解离两栖类动物皮肤组织获得细胞的方法，包括如下步骤：取皮肤组织，剪碎，用所述的试剂c进行处理。具体包括如下步骤：取皮肤组织，剪碎，置于试剂c中，室温浸泡1-3h，然后加入2倍体积的含10％血清的α-mem培养基以终止消化，然后用70μm细胞滤网过滤并收集滤液，滤液1000rpm离心5min，收集细胞沉淀，用含10％血清的α-mem培养基重悬；本发明还保护一种解离两栖类动物肌肉组织获得细胞的方法，包括如下步骤：取肌肉组织，剪碎，先加入所述试剂d进行处理，再加入所述试剂e进行处理。具体包括如下步骤：取肌肉组织，剪碎，置于试剂d中，室温浸泡1-2h，然后加入等体积试剂e并继续室温浸泡20min，然后加入2倍体积的含10％血清的α-mem培养基以终止消化，然后用70μm细胞滤网过滤并收集滤液，滤液1000rpm离心5min，收集细胞沉淀，用含10％血清的α-mem培养基重悬；本发明还保护一种解离两栖类动物骨骼组织获得细胞的方法，包括如下步骤：取骨骼组织，切碎，用所述试剂f进行处理。具体包括如下步骤：取骨骼组织，在试剂a中清洗三次(每次3min)，然后用手术刀将其切碎成约1mm3的小块，然后置于试剂f中，室温浸泡1.5-2h(此时，组织块基本消失，溶液变浑浊)，然后加入2倍体积的含10％血清的α-mem培养基以终止消化，然后用70μm细胞滤网过滤并收集滤液，滤液1000rpm离心5min，收集细胞沉淀，用含10％血清的α-mem培养基重悬。以上任一所述方法还包括如下清洗和预处理步骤：取器官，在70％乙醇中清洗10min，然后在试剂a中清洗三遍(每遍3min)，充分去除组织表面的附着物，然后置于试剂b中，室温浸泡10-15min。本发明提供了用于两栖动物组织解离从而获得单细胞的试剂盒，进一步提供了应用试剂盒获得两栖动物单细胞的方法。本发明提供的试剂盒中，具有特定配方的清洗试剂、预处理试剂和酶溶解液，一方面试剂性质温和、可以避免渗透压过大对细胞的损伤，另一方面可快速有效完成两栖动物组织解离从而获得单细胞。本发明提供的方法，同时利用机械作用、酶解作用和离心力作用解离细胞。本发明建立了一种简单、稳定、高效的两栖动物单细胞分离方法，解离之前不能解离的两栖动物细胞，扩大单细胞水平研究的物种范围。现在实验室对于两栖类动物的研究大多停留在组织水平，由于两栖类物种的特殊性(细胞渗透压和细胞适宜的培养温度较哺乳动物低)，采用哺乳动物相关组织的酶解方法，存在解离效率低，对细胞伤害较大不利于后续研究等问题。本发明可同时适用于不同发育阶段的两栖类动物，可以应用到各种两栖动物肢体皮肤、肌肉，骨骼组织的单细胞研究。附图说明图1为墨西哥钝口螈肌肉组织单细胞图片(100x)。图2为墨西哥钝口螈皮肤组织单细胞图片(100x)。图3为墨西哥钝口螈骨骼组织单细胞图片(100x)。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中所用到的各个原料见表1。表11000×庆大霉素溶液的制备方法：将350mg硫酸庆大霉素(bbi，a620217-5g，粉末)用水溶解并用水定容至10ml。dpbs是杜氏磷酸缓冲液，和常用标准pbs的区别是不含钙、镁离子。实施例1、试剂盒的制备试剂盒由如下组件组成：试剂a、试剂b、试剂c、试剂d、试剂e和试剂f。试剂a为清洗试剂。试剂a的制备方法：按照表2取各个原料，充分溶解混匀，然后用0.22μm滤膜过滤，收集滤液，即为试剂a。表2(总体积125ml)原料用量dpbs100ml1000×庆大霉素0.125ml100×青链霉素1.25ml无酶水23.625ml试剂b为预处理试剂。试剂b的制备方法：将edta-na2-2h2o加至试剂a中，加热使其溶解，然后用氢氧化钠调ph值至7.0，然后用试剂a定容至100ml，即为试剂b。试剂b中，edta的浓度为0.1g/100ml。试剂c为酶溶解液。试剂c的制备方法：将0.5g胶原酶ⅰ和0.5g分散酶ⅱ加至25ml试剂a中，充分溶解混匀，然后用0.22μm滤膜过滤，收集滤液，即为储存液；将1ml储存液与9ml试剂a混匀，得到试剂c。试剂c中，胶原酶ⅰ的浓度为0.2g/100ml(相当于48000u/100ml),分散酶ⅱ的浓度为0.2g/100ml(相当于100units/100ml)。试剂d为酶溶解液。试剂d的制备方法：将0.5g胶原酶ⅰ加至25ml试剂a中，充分溶解混匀，然后用0.22μm滤膜过滤，收集滤液，即为储存液；将1.25ml储存液与8.75ml试剂a混匀，得到试剂d。试剂d中，胶原酶ⅰ的浓度为0.25g/100ml(相当于60000u/100ml)。试剂e为酶溶解液。试剂e的制备方法：将胰蛋白酶和edta-na-2h2o加至25ml试剂a中，充分溶解混匀，然后用0.22μm滤膜过滤，收集滤液，即为储存液；将1ml储存液与9ml试剂a混匀，得到试剂e。试剂e中，胰蛋白酶的浓度为0.5g/100ml(相当于150000uspu/100ml)，edta-na2-2h2o的浓度为0.05g/100ml。试剂f为酶溶解液。试剂f的制备方法：将0.5g胶原酶ⅱ加至25ml试剂a中，充分溶解混匀，然后用0.22μm滤膜过滤，收集滤液，即为储存液；将1ml储存液与9ml试剂a混匀，得到试剂f。试剂f中，胶原酶ⅱ的浓度为0.2g/100ml(相当于52200u/100ml)。实施例2、试剂盒的使用方法1、取样本(两栖类动物的器官或组织，例如四肢之一)，在70％乙醇中清洗10min，然后在试剂a中清洗三遍(每遍3min)，充分去除组织表面的附着物。2、取完成步骤1的组织，置于试剂b中，室温浸泡10-15min，然后分离皮肤组织。3、取步骤2得到的皮肤组织，剪碎，置于试剂c中，室温浸泡1-3h，然后加入2倍体积的含10％血清的α-mem培养基以终止消化，然后用70μm细胞滤网过滤并收集滤液，滤液1000rpm离心5min，收集细胞沉淀，用含10％血清的α-mem培养基重悬。4、完成步骤2后，从剩余的组织中剥取肌肉组织，剪碎，置于试剂d中，室温浸泡1-2h，然后加入等体积试剂e并继续室温浸泡20min，然后加入2倍体积的含10％血清的α-mem培养基以终止消化，然后用70μm细胞滤网过滤并收集滤液，滤液1000rpm离心5min，收集细胞沉淀，用含10％血清的α-mem培养基重悬。5、完成步骤2后，从剩余的组织中剥取骨骼组织，在试剂a中清洗三次(每次3min)，然后用手术刀将其切碎成约1mm3的小块，然后置于试剂f中，室温浸泡1.5-2h(此时，组织块基本消失，溶液变浑浊)，然后加入2倍体积的含10％血清的α-mem培养基以终止消化，然后用70μm细胞滤网过滤并收集滤液，滤液1000rpm离心5min，收集细胞沉淀，用含10％血清的α-mem培养基重悬。实施例3、试剂盒的应用墨西哥钝口螈，取右上肢，作为样本。按照实施例2进行操作。图1为墨西哥钝口螈肌肉组织单细胞图片(100x)。图2为墨西哥钝口螈皮肤组织单细胞图片(100x)。图3为墨西哥钝口螈骨骼组织单细胞图片(100x)。结果表明，本发明提供的试剂盒可以有效解离两栖类动物(比如蝾螈)组织，并且细胞存活率为85％以上(细胞存活率是在显微镜下观察统计的存活细胞数占总细胞数的比例)。对比例、墨西哥钝口螈，取右上肢，作为样本。一、对比例一用如下试剂代替试剂c：胶原酶ⅰ的浓度为2g/100ml，其它同试剂c。按照实施例2的步骤1、2和3进行操作。皮肤组织，细胞死亡率60％左右，细胞碎片较多。二、对比例二用如下试剂代替试剂d：胶原酶ⅰ的浓度为5g/100ml，其它同试剂d。按照实施例2的步骤1、2和4进行操作。肌肉组织，细胞变形严重，大部分细胞未见正常细胞形态，消化液中有较多碎屑，细胞死亡率40％左右。三、对比例三用如下试剂代替试剂f：胶原酶ⅱ的浓度为2g/100ml，其它同试剂f。按照实施例2的步骤1、2和5进行操作。骨骼组织，细胞状态较差，细胞死亡率37％左右。当前第1页12