一种外泌体肺部肿瘤标志物LSM2的快速检测试剂盒的制作方法

本发明属于试剂盒技术领域，具体涉及一种外泌体肺部肿瘤标志物lsm2的快速检测试剂盒。

背景技术：

外泌体（exosome），是一种能被大多数细胞分泌的微小膜泡，直径大约30-150nm，具有脂质双层膜结构，能很好地保护其包被的物质。这种微小膜泡中含有宿主细胞来源的特异的蛋白、脂质和核酸，能作为信号分子传递给其他细胞，是细胞之间通讯的重要媒介，可使受体细胞发生多种生物功能的改变。据报道，这种外逸性介导的细胞间通讯影响了癌症的几个特征，包括调节免疫反应、重编程基质细胞、重建细胞外基质结构，甚至赋予癌细胞耐药特性。不同细胞分泌的外泌体组份和含量不同，选择性地将特定的致癌分子装入外泌体中，通过在肿瘤和远端微环境的不同细胞之间转移生物活性分子参与癌症进展和转移，使外泌体成为潜在的检测生物标志物。

外泌体原位捕获孔板或芯片技术是一种全新的外泌体原位捕捉与检测技术，尤以检测外泌体中的mrna和microrna见长。其以涂附了生物分子膜的活化玻璃为载体，包被能特异识别疾病相关microrna或mrna靶标的分子信标（自行设计）的阳离子脂质纳米颗粒，其与带负电荷的外泌体融合后，分子信标与靶标结合而产生荧光信号，被全内反射荧光(tirf，totalinternalreflectionfluorescence)显微镜检测，信号强度与相应靶标含量成正比，从而判断病程或锁定病原体。由于tirf成像具有超微，对荧光信号超敏感的特性，使得外泌体捕获孔板或芯片结合tirf成像技术，可以实现对外泌体这种纳米级囊泡的直接成像及其内含物的半定量检测。外泌体原位捕捉与检测示意图，如图1所示。外泌体捕获孔板或芯片可制作成24、48、96、384孔多种规格，每孔可包被单一或3种荧光素标记的分子信标，将多个肿瘤标志物基因检测通道集成在一张捕获孔板或芯片上，快捷、方便、经济，优势明显。

由于外泌体在各种体液样品中大量存在，且其中富含肿瘤细胞来源的特异性核酸，因此可以通过分离外泌体，运用高度灵敏的外泌体捕获孔板或芯片检测技术加以鉴定。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种外泌体肺部肿瘤标志物lsm2的快速检测试剂盒的技术方案。

所述的一种外泌体肺部肿瘤标志物lsm2的快速检测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有外泌体原位捕获孔板或芯片，所述的外泌体原位捕获孔板或芯片上含有荧光素标记的分子信标，所述的分子信标为检测肺部肿瘤标志物lsm2mrna的特异性dna探针，所述的特异性dna探针的5’端茎和环与靶基因完全互补，3’端茎与5’端茎部分互补，5’端和3’端分别用荧光基团和淬灭基团修饰，环上部分碱基用锁核酸修饰。

所述的一种外泌体肺部肿瘤标志物lsm2的快速检测试剂盒，其特征在于所述的特异性dna探针具有如seqidno.1～5所示核苷酸序列的探针，所述seqidno.1所示序列其碱基修饰方式为：第1位碱基6fam修饰，第10、13、16、19、22、25和28位碱基lna修饰和第36位碱基bhq1修饰，所述seqidno.2所示序列其碱基修饰方式为：第1位碱基6fam修饰，第10、13、16、19、22、25和28位碱基lna修饰和第37位碱基bhq1修饰，所述seqidno.3所示序列其碱基修饰方式为：第1位碱基6fam修饰，第10、13、16、19、22、25和28位碱基lna修饰和第36位碱基bhq1修饰，所述seqidno.4所示序列其碱基修饰方式为：第1位碱基6fam修饰，第10、13、16、19、22、25和28位碱基lna修饰和第35位碱基bhq1修饰，所述seqidno.5所示序列其碱基修饰方式为：第1位碱基6fam修饰，第10、13、16、19、22、25和28位碱基lna修饰和第35位碱基bhq1修饰。

所述的一种外泌体肺部肿瘤标志物lsm2的快速检测试剂盒，其特征在于所述的特异性dna探针由阳离子脂质复合纳米颗粒包裹。

所述的一种外泌体肺部肿瘤标志物lsm2的快速检测试剂盒，其特征在于试剂盒中除了外泌体原位捕获孔板或芯片外，还包括外泌体分离试剂、外泌体纯化试剂、外泌体纯化色谱柱、阴性对照品、阳性对照品、蛋白酶k和1×pbs。

所述的检测肺部肿瘤标志物lsm2mrna的特异性dna探针在制备肺部肿瘤筛查用试剂中的应用，所述的特异性dna探针的5’端茎和环与靶基因完全互补，3’端茎与5’端茎部分互补，5’端和3’端分别用荧光基团和淬灭基团修饰，环上部分碱基用锁核酸修饰。

所述的应用，其特征在于所述的特异性dna探针具有如seqidno.1～5所示核苷酸序列的探针，所述seqidno.1所示序列其碱基修饰方式为：第1位碱基6fam修饰，第10、13、16、19、22、25和28位碱基lna修饰和第36位碱基bhq1修饰，所述seqidno.2所示序列其碱基修饰方式为：第1位碱基6fam修饰，第10、13、16、19、22、25和28位碱基lna修饰和第37位碱基bhq1修饰，所述seqidno.3所示序列其碱基修饰方式为：第1位碱基6fam修饰，第10、13、16、19、22、25和28位碱基lna修饰和第36位碱基bhq1修饰，所述seqidno.4所示序列其碱基修饰方式为：第1位碱基6fam修饰，第10、13、16、19、22、25和28位碱基lna修饰和第35位碱基bhq1修饰，所述seqidno.5所示序列其碱基修饰方式为：第1位碱基6fam修饰，第10、13、16、19、22、25和28位碱基lna修饰和第35位碱基bhq1修饰。

所述的应用，其特征在于所述的肺部肿瘤包括良性和恶性肿瘤。

本发明中肺部肿瘤标志物lsm2是一种rna结合蛋白，基因id号为57819，参与基因mrna的降解过程。

本发明的试剂盒运用了外泌体原位捕获孔板或芯片技术，检测肺部肿瘤患者体液样品中外泌体所包含的，肿瘤标志物lsm2mrna。

附图说明

图1为外泌体原位捕捉与检测示意图；

图2为实施例2中的检测结果图。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

实施例1：特异性分子信标设计

设计检测靶基因的特异性分子信标，对于外泌体捕获孔板检测特异性核酸至关重要。为此，结合靶基因的特征，申请人设计了特殊茎环结构的分子信标，5’端茎和环与靶基因完全互补，3’端茎与5’端茎部分互补，5’端和3’端分别用荧光基团和淬灭基团修饰，环上部分碱基用锁核酸修饰，特异性分子信标具体序列如表1所示。其中，seqidno.1所示序列其碱基修饰方式为：第1位碱基6fam修饰，第10、13、16、19、22、25和28位碱基lna修饰和第36位碱基bhq1修饰，所述seqidno.2所示序列其碱基修饰方式为：第1位碱基6fam修饰，第10、13、16、19、22、25和28位碱基lna修饰和第37位碱基bhq1修饰，所述seqidno.3所示序列其碱基修饰方式为：第1位碱基6fam修饰，第10、13、16、19、22、25和28位碱基lna修饰和第36位碱基bhq1修饰，所述seqidno.4所示序列其碱基修饰方式为：第1位碱基6fam修饰，第10、13、16、19、22、25和28位碱基lna修饰和第35位碱基bhq1修饰，所述seqidno.5所示序列其碱基修饰方式为：第1位碱基6fam修饰，第10、13、16、19、22、25和28位碱基lna修饰和第35位碱基bhq1修饰。

本发明设计的特异性分子信标最大程度地提高了分子信标与靶基因结合的特异性，同时降低了反应的背景荧光强度。分子信标合成后，为了验证其与相应靶基因结合的特异性和最佳工作温度，我们设计了如下表2，根据最高信噪比选取最佳分子信标及其工作温度。

表1

表2

*采用荧光读板机读取其荧光强度。**采用tirf显微镜检测其荧光强度。

实施例2：检测试验

一、外泌体分离

1、取200ul血浆样品（也可以为离体的人血清、尿液等体液或排泄物样品），室温12000×g离心30min，去除细胞和碎片；

2、转移上清至一新的ep管中，加入100ul外泌体沉淀试剂；

3、混匀，4℃孵育30min；

4、室温10,000×g离心10min；

5、吸弃上清，取100ul1×pbs重悬富含外泌体的沉淀物，4℃静置备用。

二、外泌体色谱柱纯化

1、平衡色谱柱：加100ul平衡液，9000×g离心1min；

2、上样：将100ul重悬液上柱，9000×g离心1min；

3、洗脱：加50ul洗脱液，9000×g离心3min。

三、外泌体捕获孔板或芯片检测

1、取出孔板或芯片（该孔板或芯片上每孔中含有表1所示的分子信标混合物，该分子信标由阳离子脂质复合纳米颗粒包裹），将纯化后的外泌体洗脱液加入样品孔中；

2、将试剂盒中的阴、阳性对照品（阴、阳性对照品是用阴离子纳米颗粒分别包裹的线虫基因片段和靶基因片段）加入后续样品孔中；

3、42℃孵育1小时；

4、室温平衡5min后，用tirf显微镜采集荧光图片；

5、用dximagev1软件分析图片，自动设置cut-off值，自动判读待测样品结果。

四、检测结果

为检测外泌体中肺部肿瘤标志物lsm2快速检测试剂盒的特异性，我们选取了20例健康体检者血浆作为对照组，40例肺癌患者血浆作为实验组，根据测试流程操作，获得结果如图2所示，实验组荧光强度明显高于对照组，说明肺癌患者的血浆外泌体中lsm2mrna的表达量，显著高于健康体检者。因此，肺癌患者血浆样品中外泌体所包含的肿瘤标志物lsm2mrna特异性核酸片段。

序列表

<110>杭州迪相实业有限公司

<120>一种外泌体肺部肿瘤标志物lsm2的快速检测试剂盒

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