一种生物医用可注射凝胶材料及其制备方法和用途与流程

本发明属于可注射凝胶领域，尤其是涉及一种生物医用可注射凝胶材料及其制备方法和用途。

背景技术：

可注射凝胶材料因其具有良好的注射性和形状可塑性在生物医疗方面有着重要的作用，生物医用可注射凝胶具有细胞毒性低、生物可降解性而不会滞留于组织体内或释放有毒残害物质，安全性好。在生物医学上它被广泛用于构建支架，比如为移植细胞提供粘附、增殖和分化的三维网络支架等。透明质酸和胶原都是较好的生物材料，在单独使用的时候，它们的流变学特性和粘弹性不能满足一些特殊治疗的需要，因而需要对其改性，以达到治疗的需求。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明旨在提出一种生物医用可注射凝胶材料及其制备方法和用途，以解决上述问题。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种生物医用可注射凝胶材料及其制备方法和用途，包括如下质量份数的组分：透明质酸1-3份，矿化胶原1-10份，甲基纤维素10-20份、交联剂0.01-0.03份。

优选的，包括如下质量份数的组分：透明质酸1-3份，矿化胶原1-8份，甲基纤维素12-18份、交联剂0.01-0.03份。

优选的，所述的交联剂为peg活性酯。

优选的，所述的peg活性酯由以下方法制备：将聚乙二醇溶于二氧六环中制备成(2-6)×10^-3mol/l的聚乙二醇溶液，加入吡啶作为催化剂，再加入琥珀酸酐，琥珀酸酐与聚乙二醇的摩尔比为(0.8-1):1，100℃回流搅拌4小时，反应完毕后冷却，冷却溶液在迅速搅拌下滴加无水乙醚至沉淀不在出现为止，在冰水混合物中搅拌30分钟后，过滤除去滤液，将沉淀充分溶于二氯甲烷中，过滤除去不溶物，在滤液中滴加无水乙醚至沉淀不在产生，并将该混合物在冰浴中搅拌15分钟，将溶液过滤，得到沉淀产物ⅰ，将沉淀完全干燥；所述的沉淀物ⅰ的反应原理如下：

按照摩尔数比为(0.8-1.2)：1将产物ⅰ和n一羟基琥珀酰亚胺溶解于含有二环己基碳化二亚胺的二甲基甲酰胺中，搅拌12小时后滴加无水乙醚至沉淀不再出现为止，再在冰水混合物中搅拌30分钟，过滤除去滤液，将沉淀充分溶于二氯甲烷中，在滤液中滴加无水乙醚至沉淀不再产生后，冰浴中搅拌15分钟，过滤得沉淀产物ⅱ，将沉淀完全干燥，即得到peg活性酯,所述的沉淀物ⅱ的反应原理如下：

优选的，所述的聚乙二醇溶于二氧六环中制备成4×10^-3mol/l的聚乙二醇溶液；琥珀酸酐与聚乙二醇的摩尔比为0.9:1；产物ⅰ和n一羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1。

本发明的另一目的在于提出一种制备所述可注射凝胶材料的方法，包括如下步骤：将甲基纤维素溶于缓冲溶液中，溶解后加入透明质酸和矿化胶原，溶解后再加入交联剂形成凝胶。

优选的，所述的缓冲溶液为人工脑脊液。

优选的，所述的人工脑脊液包括如下质量分数的组分：牛血清白蛋白(0.5-1.5)份、nacl(70-95)份、kcl(1-3)份、mgcl2(0.2-1.5)份、cacl2(1-3)份、na2hpo4(1-3)份、nah2po4(0.1-0.3)份。

本发明的又一目的在于提出所述的可注射凝胶应用与生物医用材料领域。

优选的，所述的可注射凝胶应用于3d生物打印材料领域。

相对于现有技术，本发明所述的一种生物医用可注射凝胶材料及其制备方法和用途具有以下优势：

本发明所述的可注射凝胶材料粘弹性好，毒性低，力学强度高、结构稳定，多孔的结构有利于细胞的迁移，在生物医疗领域具有良好的应用前景。

附图说明

构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为本发明实施例1中凝胶支架图；

图2为本发明实施例1和对比例1中粘度随剪切速率变化关系图；

图3为本发明实施例1和对比例1中弹性模量随时间变化关系图；

图4为本发明实施例1和对比例1中弹性模量随频率变化关系图；

图5为本发明实施例1和对比例1中粘性模量随时间变化关系图；

图6为本发明实施例1和对比例1中粘性模量随频率变化关系图；

图7为本发明实施例1中sem图；

图8为本发明实施例1中凝胶支架图；

图9为本发明实施例1中sem图。

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下面结合实施例及附图来详细说明本发明。

(1)peg活性酯的制备：

将peg(mw2000)溶于二氧杂环己烷中并制备4.0×10-3mol/l溶液。加入吡啶作为催化剂，加入3.6×10-3mol琥珀酸酐并在100℃回流搅拌4小时。反应完成后，待溶液冷却，并向冷却的溶液中滴加无水乙醚直至不再出现沉淀。在冰水混合物中搅拌30分钟后，过滤除去滤液。沉淀完全溶于二氯甲烷中，过滤除去不溶物。将无水乙醚滴加到滤液中直至不形成沉淀，并将该混合物在冰浴中搅拌15分钟。将溶液过滤，得到沉淀产物ⅰ，将沉淀放置于干燥器(具有内置的无水p205)内并干燥4天直至其完全干燥。

所述的沉淀物ⅰ的反应原理如下：

按照等摩尔数比将产物ⅰ和n一羟基琥珀酰亚胺溶解于含有二环己基碳化二亚胺(dcc)的二甲基甲酰胺(dmf)中，搅拌12小时后滴加无水乙醚至沉淀不再出现为止。再在冰水混合物中搅拌30分钟，过滤除去滤液，将沉淀充分溶于二氯甲烷中，在滤液中滴加无水乙醚至沉淀不再产生后，冰浴中搅拌15分钟，过滤得沉淀产物ⅱ，将沉淀放置于干燥器内(内置无水p205)干燥4天，至其完全干燥，即得到peg活性酯。所述的沉淀物ⅱ的反应原理如下：

(2)配制人工脑脊液

人工脑脊液(acsf)的具体成分为：148mm的nacl，3mm的kcl，1.4mm的cacl2，0.8mm的mgcl2，1.5mm的na2hpo4，0.2mm的nah2po4以及0.1mg/ml的牛血清白蛋白。

1)根据此配方配制acsf溶液，先称取8.649gnacl、0.2235gkcl、0.0760gmgcl2、0.1554gcacl2、0.2130gna2hpo4、0.0240gnah2po4以及0.1g牛血清白蛋白，将它们依次倒入洁净干燥的烧杯中。

2)向上述溶液中加入适量的去离子水，用磁力搅拌机溶解，将溶解后的溶液用玻璃棒引流倒入至1000ml的容量瓶中，用去离子水冲洗烧杯、玻璃棒以及转子三次以上，将冲洗的水倒入容量瓶中，再加入去离子水定容至1000ml，将容量瓶翻转摇匀。

3)把溶液装瓶并放置在4℃的冰箱中存放备用。

(3)制备甲基纤维素溶液(mc溶液)

1)预热恒温水浴锅，取约100ml预先制备好的acsf溶液加入到250ml的锥形瓶中。将其在恒温水浴锅中的水浴温度加热至90℃以上，同时，为了降低溶胶的凝胶温度，加入8g的nacl使其达到所需的添加剂浓度的4％。

2)称量24g甲基纤维素粉末加入到上述溶液当中，电磁搅拌至mc颗粒充分分散均匀。

3)再向溶液中加入冷的acsf溶液至溶液体积为200ml，搅拌均匀后将锥形瓶从水浴中取出，再将其放置在冰盐浴中维持溶液温度在0℃以下，在冰盐浴的情况下搅拌40min。

4)搅拌结束后，得到了分散均匀的mc溶液，将其放置在4℃的条件下冷藏过夜。

(4)矿化胶原材料的制备方法,包括下列各步骤：

1)将胶原溶于醋酸溶液中，缓慢滴加含有po4^3-的溶液，po4^3-的量为每克胶原0.055mol,滴加的同时搅拌，胶原溶液的浓度为0.02g/30ml；

2)在搅拌的同时缓慢滴加含有ca²⁺的水溶液于步骤1制备的溶液中，加入ca²⁺的量和第1步中加的po4^3-的摩尔数之比是ca：p＝1.66；

3)在搅拌的同时滴加naoh溶液，直至溶液的ph值为6～8。通过测定溶液的ph值，可以发现，溶液在ph值为5～6时溶液开始出现沉淀,ph值为7时会出现白色悬浊液；

4)静置溶液2～4小时，倒去上清液，去离子水反复清洗三次，使用布氏漏斗抽滤分离出沉淀，放入冻干机内冰冻干燥，随后研磨制得干粉即得所述材料。

实施例1

(1)凝胶制备：

称取0.2g的透明质酸(ha)粉末加入到20ml的mc溶液中，为了使ha能在mc溶液中搅拌得更分散更均匀，先分次加入ha粉末，再逐次倒入mc溶液，搅拌使ha粉末得到充分分散并溶解，然后加入0.2g矿化胶原搅拌溶解，最后向溶液里加入0.5ml浓度为4mg/ml的peg活性酯，搅拌12h，使ha、矿化胶原分散并溶解后4℃冷藏形成凝胶，凝胶化时间6分钟。

(2)性能检测：

1)凝胶支架打印测试。

利用软件设计拟构建矩形模型，将该模型装载于三维生物打印机的预设软件中。将(1)中已经成胶好凝胶装入三维生物打印机的喷头内，设定打印速率为2mm/s，微丝中心间距为400微米，然后将材料进行逐层打印堆积，通过三维生物打印机凝胶成功打印成尺寸为20.0mm×20.0mm×2.0mm的三维多孔立体支架，如图1所示。支架具有规整、均匀的结构，适合用于打印支架。

2)流变性能测试。

对(1)中的凝胶进行进行流变性能检测，其粘度随剪切速率的变化关系如图2中2.0％线所示，凝胶粘度随剪切速率的增加而降低，具有良好的假塑性。凝胶的弹性模量随时间的变化关系如图3中2.0％线所示，凝胶的弹性模量随频率的变化关系如图4中2.0％线所示，凝胶的粘性模量随时间的变化关系如图5中2.0％线所示，凝胶的粘性模量随频率的变化关系如图6中2.0％线所示。

3)扫描电镜(sem)检测。

将(1)中的凝胶经冻干后在场发射扫描电子显微镜进行sem检测，结果如图6所示，经交联后得到的,凝胶保持着缠绕形态，纤维呈现螺旋状扭曲，孔隙较大，形成了较有规则的蜂窝形状，有利于细胞的迁移。

实施例2

称取0.1g的透明质酸(ha)粉末加入到20ml的mc溶液中，为了使ha能在mc溶液中搅拌得更分散更均匀，先分次加入ha粉末，再逐次倒入mc溶液，搅拌使ha粉末得到充分分散并溶解，然后加入0.1g矿化胶原搅拌溶解，最后向溶液里加入0.25ml浓度为4mg/ml的peg活性酯，搅拌12h，使ha、矿化胶原分散并溶解后4℃冷藏形成凝胶，凝胶化时间6分钟。

实施例3

称取0.3g的透明质酸(ha)粉末加入到20ml的mc溶液中，为了使ha能在mc溶液中搅拌得更分散更均匀，先分次加入ha粉末，再逐次倒入mc溶液，搅拌使ha粉末得到充分分散并溶解，然后加入1g矿化胶原搅拌溶解，最后向溶液里加入0.75ml浓度为4mg/ml的peg活性酯，搅拌12h，使ha、矿化胶原分散并溶解后4℃冷藏形成凝胶，凝胶化时间6分钟。

实施例4

称取0.2g的透明质酸(ha)粉末加入到20ml的mc溶液中，为了使ha能在mc溶液中搅拌得更分散更均匀，先分次加入ha粉末，再逐次倒入mc溶液，搅拌使ha粉末得到充分分散并溶解，然后加入0.4g矿化胶原搅拌溶解，最后向溶液里加入0.5ml浓度为4mg/ml的peg活性酯，搅拌12h，使ha、矿化胶原分散并溶解后4℃冷藏形成凝胶，凝胶化时间6分钟。

实施例5

称取0.2g的透明质酸(ha)粉末加入到20ml的mc溶液中，为了使ha能在mc溶液中搅拌得更分散更均匀，先分次加入ha粉末，再逐次倒入mc溶液，搅拌使ha粉末得到充分分散并溶解，然后加入0.6g矿化胶原搅拌溶解，最后向溶液里加入0.5ml浓度为4mg/ml的peg活性酯，搅拌12h，使ha、矿化胶原分散并溶解后4℃冷藏形成凝胶，凝胶化时间6分钟。

实施例6

称取0.1g的透明质酸(ha)粉末加入到20ml的mc溶液中，为了使ha能在mc溶液中搅拌得更分散更均匀，先分次加入ha粉末，再逐次倒入mc溶液，搅拌使ha粉末得到充分分散并溶解，然后加入0.8g矿化胶原搅拌溶解，最后向溶液里加入0.25ml浓度为4mg/ml的peg活性酯，搅拌12h，使ha、矿化胶原分散并溶解后4℃冷藏形成凝胶，凝胶化时间6分钟。

实施例7

称取0.2g的透明质酸(ha)粉末加入到20ml的mc溶液中，为了使ha能在mc溶液中搅拌得更分散更均匀，先分次加入ha粉末，再逐次倒入mc溶液，搅拌使ha粉末得到充分分散并溶解，然后加入1g矿化胶原搅拌溶解，最后向溶液里加入0.5ml浓度为4mg/ml的peg活性酯，搅拌12h，使ha、矿化胶原分散并溶解后4℃冷藏形成凝胶，凝胶化时间6分钟。

对比例1

(1)凝胶制备：

称取0.2g的透明质酸(ha)粉末加入到20ml的mc溶液中，为了使ha能在mc溶液中搅拌得更分散更均匀，先分次加入ha粉末，再逐次倒入mc溶液，搅拌使ha粉末得到充分分散并溶解，然后向溶液里加入0.5ml浓度为4mg/ml的peg活性酯，搅拌12h，使ha、矿化胶原分散并溶解后4℃冷藏形成凝胶，凝胶化时间5.5分钟。

(2)性能检测：

1)凝胶支架打印测试。

利用软件设计拟构建矩形模型，将该模型装载于三维生物打印机的预设软件中。将(1)中已经成胶好凝胶装入三维生物打印机的喷头内，设定打印速率为2mm/s，微丝中心间距为400微米，然后将材料进行逐层打印堆积，通过三维生物打印机凝胶成功打印成尺寸为20.0mm×20.0mm×2.0mm的三维多孔立体支架，如图8所示，相对与实施例1来说该支架强度较小，支架稳定性弱，不适合用于打印支架。

2)流变性能测试。

对(1)中的凝胶进行进行流变性能检测，其粘度随剪切速率的变化关系如图2中0.0％线所示，凝胶粘度随剪切速率的增加而降低，具有良好的假塑性。凝胶的弹性模量随时间的变化关系如图3中0.0％线所示，相对于实施例1图2中2.0％线来说，其粘性提高，凝胶的弹性模量随频率的变化关系如图4中0.0％线所示，相对于实施例1图2中2.0％线来说，其粘性提高，凝胶的粘性模量随时间的变化关系如图5中0.0％线所示，相对于实施例1图2中2.0％线来说，其弹性提高，凝胶的粘性模量随频率的变化关系如图6中0.0％线所示，相对于实施例1图2中2.0％线来说，其弹性提高，对比说明加入适量的矿化胶原后复合凝胶的粘弹性均得到了提高。

3)扫描电镜(sem)检测。

将(1)中的凝胶经冻干后在场发射扫描电子显微镜进行sem检测，结果如图9所示，未加矿化胶原的复合凝胶经交联后得到的凝胶保持着缠绕形态，形状杂乱无规则，不利于细胞的迁移。

所述实施例和对比例中：

所述的透明质酸购买于山东福瑞达生物医药有限公司，mw为：2.6～2.7kda。

所述的牛血清白蛋白购买于spain公司，mw为68000。

甲基纤维素的粘度为η(20g/l，20℃)：17.0～23.0mpa·s，生产厂家为国药集团化学试剂有限公司。

聚乙二醇(peg-600，mw：570～630),peg-6000，国药集团化学试剂有限公司。

流变仪，型号为physicamcr300，生产厂家为：奥地利antonpaar。

场发射扫描电子显微镜，型号为merlinvp，生产厂家为：德国卡尔蔡司公司。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。