一种水稻叶片衰老和穗型调控基因HK73及其编码的蛋白质、分子标记与应用的制作方法

本发明涉及植物基因工程及育种领域，特别是涉及一种水稻叶片衰老和穗型调控基因hk73及其编码的蛋白质、分子标记与应用。

背景技术：

水稻叶片是合成有机物质的重要场所，通过延缓叶片的衰老和延长光合器官的功能，可以增加干物质积累；尤其在水稻的生育后期，通过延长植株叶片的光合作用时间，积累更多的有机物质可以提高水稻增产的潜能。水稻中存在着一类重要的叶色突变体--常绿叶，其是一种功能型常绿突变体，其主要的表型特征为生长后期叶片衰老延缓、叶绿素含量和光合能力保持不变。因此，叶片衰老或发育基因的有效利用，不仅可以提高水稻的生产能力，也为今后的超级稻育种提供了新的途径和方法。

水稻穗型特征包括穗粒数、枝梗数、穗长等，是决定水稻产量形成的重要因素之一。水稻穗的发育过程包括幼穗的形态建成和花粉发育两个阶段。幼穗的形态建成起始于茎顶端分生组织由营养生长向生殖生长的转变，随后包括苞分化期、一次枝梗原基分化期、二次枝梗原基分化期、小穗原基分化期和雌雄蕊形成期。幼穗的发育对水稻产量的影响最直接的体现在穗大小(长短)、分枝数目的多少、穗着粒密度等。因此，研究水稻穗的发育和形态特征不仅是植物发育方面的基础理论性问题，也在改良和提高水稻穗粒数、单穗重等方面具有重要的应用价值和现实意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种水稻叶片衰老和穗型调控基因及其编码的蛋白质、分子标记与应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一方面，本发明提供了一种水稻叶片衰老及穗型调控基因hk73编码的蛋白质，所述蛋白质具有如(a)或(b)所示的序列：

(a)seqidno：2所示的氨基酸序列；

(b)在(a)所限定的氨基酸序列中添加和/或取代和/或缺失一个或几个氨基酸且具有水稻叶片衰老及穗型调控功能的由(a)衍生的蛋白质。

本发明中的seqidno：2和图6所示的蛋白质属于atp功能域包含蛋白，其中进行一个或几个替换，插入或缺失所获得的功能类似物也能达到本发明的目的。

另一方面，本发明提供了一种编码上述蛋白质的基因。

进一步地，所述基因具有如(a)、(b)或(c)所示的序列：

(a)seqidno：1所示的核苷酸序列；

(b)与seqidno：1所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；

(c)在(a)或(b)所限定的核苷酸序列中添加和/或取代和/或缺失一个或多个核苷酸而生成的可编码具有水稻叶片衰老及穗型调控功能的蛋白质的突变基因、等位基因或衍生物。

再一方面，本发明提供了一种含有上述基因的质粒、植物表达载体或宿主细胞，该宿主细胞可为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。

再一方面，本发明提供了一种调控水稻叶片衰老及穗型的方法，包括用上述基因转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株。具体地说，本发明提供了具有seqidno：1和图5所示序列的基因或基因部分片段的载体，其中，如图3所示的pcambia1300-hk73,该载体可以表达有上述核苷酸序列编码的多肽片段或其同源类似物。

再一方面，本发明提供了上述蛋白质、基因、质粒、植物表达载体或宿主细胞的应用：(a1)调控植物叶片衰老；或(a2)调控植物穗型；即可影响植物的叶片衰老速率及穗型(尤其是穗长短)。

再一方面，本发明提供了一种与水稻叶片衰老及穗型调控基因hk73连锁的分子标记，所述分子标记的上游引物及下游引物分别为：

(a)上游引物为ctggcctctagctacaaccttgc，下游引物为aaactctcgctggattcgatagg；

或(b)上游引物为acgagagggaggagagagaaacg，下游引物为ggagagccacaggaacagatcg；

或(c)上游引物为agccaaaaccaaatccaaaa，下游引物为cttcgagttggccatattcac；

或(d)上游引物为gaccttctccctcctccaac，下游引物为gtgtgggacttgaacacgg。

再一方面，本发明提供了一种上述的分子标记的应用，所述分子标记单独或组合使用，通过植物分子标记辅助选择育种对植物叶片衰老和/或穗型性状进行选育。

进一步地，所述穗型为穗粒数、枝梗数和/或穗长。

进一步地，所述植物为禾本科植物，所述禾本科植物为水稻。

实现本发明的具体技术步骤如下：

(1)突变体hk73的分离和遗传分析：

本发明的水稻叶片早衰及短穗突变体hk73来自粳稻品种武运粳7号(oryzasatival.cvwuyunjing7)ems(ethylmethylsulfonate)诱变产生的突变。通过与野生型的正反交实验，证明该突变体受隐性单基因控制，如图1所示。

(2)图位克隆hk73基因：

1)hk73的初定位：

为了分离hk73基因，本发明首先构建了一个定位群体，由突变体hk73与籼稻品种台中本地1号杂交组配成f2定位群体。再通过图位克隆的方法，利用sts、ssr等分子标记将hk73位点初步定位在第12染色体介于12-26和k73-22标记之间的区域内(图2)。

2)hk73的精细定位：

发展新的sts标记将hk73精确定位于第12号染色体上k73-24和k73-31标记之间(图2)，通过分析此区段开放阅读框(orf)、测序推测候选基因。

3)hk73基因的鉴定和功能分析：

通过转基因技术，结果表明本发明获得了使突变体hk73恢复正常表型的转基因水稻(图4)，证明了本发明正确克隆了hk73基因。

本发明利用水稻叶片早衰及短穗突变体，通过图位克隆技术首次在水稻中克隆到了hk73基因，该基因编码一个atp功能域包含蛋白，调控水稻叶片衰老进程和穗大小。通过对hk73基因的功能分析，进一步明确了植物特别是禾本科植物叶片衰老过程及叶片早衰、穗发育的遗传机制，为改良农作物的光合作用效率，提高水稻增产潜力奠定了基础。

附图说明

上述仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，以下结合附图与具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。

图1是水稻叶片衰老材料hk73与野生型材料武运粳7号的抽穗期叶片(a)和成熟期穗部(b)表型；方框指示叶片衰老区域；标尺＝2厘米；

图2是hk73基因的精细定位与克隆图；

图3是pcambia1300-hk73载体图谱；

图4是转基因互补t1代水稻植株、野生型植株wyj7和hk73突变体植株中叶片(a)和穗部(b)表型对比图；其中(a)和(b)中：左，野生型wyj7；中，hk73突变体；右，转基因互补t1代；方框指示突变体叶片衰老区域；标尺＝2厘米；

图5是hk73基因核苷酸序列图；

图6是hk73基因编码的氨基酸序列。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应该理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。若未特别指明，实施例中所用的生化试剂、载体、耗材等均为市售购买产品。

实施例1.水稻叶片衰老及穗型调控基因hk73的克隆

(1)水稻材料：

水稻突变体hk73，其原始野生材料为粳稻品种武运粳7号(oryzasatival.cvwuyunjing7)。如图1所示，突变体hk73抽穗期开始表现叶片上部早衰、成熟期表现出穗部大小变小。

(2)分析和定位群体：

纯合的hk73突变体和野生型籼稻品种台中本地1号进行杂交，f1代自交，得到f2群体，并从中选出1148株hk73表型个体作为定位群体。在苗期每株取1-2克左右的嫩叶，用来提取植物总dna。

(3)hk73基因的定位：

利用从定位群体中选取的hk73表型个体，组成的小群体进行ssr分析，根据公布的粳稻和籼稻创建的分子遗传图谱，选取近似均匀分布于各条染色体上的ssr引物进行pcr扩增，采用如下扩增程序：95℃预变性3分钟；95℃变性30秒，55℃退火35秒，72℃延伸10秒，33个循环；最后72℃再延伸8分钟。pcr产物经5％琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙啶染色，检测pcr产物的多态性，将hk73初步定位在第12号染色体12-26和k73-22标记之间。在初定位的基础上继续设计ssr和sts标记，最终将hk73精确定位于第12号染色体上分子标记k73-24和k73-31之间(图2)，并与k73-31共分离。引物序列如下：

12-26f：agagagcccctaaatttccgr：aggtacgctcacctgtggac

k73-22f：acgagagggaggagagagaaacgr：ggagagccacaggaacagatcg

k73-24f：agccaaaaccaaatccaaaar：cttcgagttggccatattcac

k73-31f：gaccttctccctcctccaacr：gtgtgggacttgaacacgg

(4)基因预测和测序分析：

根据精细定位的结果，在候选范围内根据riceautomatedannotationsystem(http://ricegaas.dna.affrc.go.jp)的预测，根据两标记剩余的重组个体数及共分离标记，我们设计了各基因的测序引物，采用pcr方法分别从hk73和野生型品种武运粳7号基因组中扩增出各个候选基因进行测序分析。发现其中1个候选基因的1个dna片段中，突变体hk73扩增的产物与野生型品种武运粳7号比较有1个碱基鸟嘌呤g到腺嘌呤a的替换。将上述测序过程重复验证两次，均得出相同的结果。因此，将该候选基因命名为hk73。根据基因注释信息，预测该候选基因编码atp功能域包含蛋白(图6)。

实施例2.pcambia1300-hk73植物表达载体构建

根据ncbi中提供的水稻品种日本晴(oryzasativalcv.nipponbare)全基因组序列，设计扩增hk73候选基因全长序列的特异性扩增引物，并根据选用的pcambia1300表达载体及hk73候选基因序列的特征，在特异性引物两端添加特异性酶切位点(图3)。具体设计的引物为：正向引物(p1f)5’端添加kpni酶切位点(ggtacc)，反向引物(p1r)5’端添加sali酶切位点(gtcgac)，引物序列如下：

p1f正向引物：5’-ctggtaccaaatttgtaattgcctctaat-3’

p1r反向引物：5’-cagtcgacgtgtataaggactactttag-3’

然后提取水稻品种武运粳7号基因组dna，并以武运粳7号基因组dna为模板，利用上面设计的引物(p1f和p1r)扩增hk73候选基因全长序列共计6224bp：包括hk73基因组dna全长及其上下游序列。采用如下扩增程序：95℃预变性3分钟；98℃变性40秒，55℃退火40秒，68℃延伸7分钟，38个循环；最后72℃再延伸15分钟。回收pcr扩增的目的片段，将其连接zeroblunttopo载体到(invitrogen)，转化大肠杆菌dh5a感受态细胞，然后经过菌落pcr鉴定筛选阳性克隆，并将阳性克隆送杭州尚亚公司测序。将经过测序鉴定的阳性克隆进行质粒提取，提取的质粒用kpni和sali双酶切，并回收hk73互补片段。同时利用kpni和sali对pcambia1300进行双酶切线性化，并回收pcambia1300骨架，将酶切后回收的hk73互补片段与酶切后回收的pcambia1300骨架用t4连接酶(购于neb公司)进行连接，得到hk73互补表达载体pcambia1300-hk73(图3)，采用电击转化法将pcambia1300-hk73表达载体转入根瘤农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)eha105中。

实施例3.将pcambia1300-hk73植物表达载体转化水稻愈伤

采用农杆菌介导的水稻成熟胚愈伤浸染转化方法，将重组表达载体pcambia1300-hk73转入水稻成熟胚中，转化方法如下：(1)水稻成熟胚愈伤组织的诱导：将成熟的hk73突变体种子去壳，然后用70％酒精表面消毒1-2min,然后用30％naclo溶液震荡15min,并重复一次，然后用灭菌水清洗5次以上。然后将种子置于诱导培养基上培养，28度避光培养诱导愈伤组织用于转化。(2)水稻愈伤组织与农杆菌的共培养：将实施2中鉴定含有pcambia1300-hk73表达载体的eha105菌株进行活化、富集、重悬，调整od600＝0.5-0.7。将愈伤组织收集于200ml灭菌锥形瓶中，倒入重悬好的农杆菌悬浮液，浸染愈伤。浸泡15-30min后，倒掉悬浮液，将浸染过的愈伤置于无菌滤纸上吸干多余的农杆菌菌液。然后将愈伤置于铺有无菌滤纸的培养皿中，26度避光培养2-3天。(3)抗性愈伤的筛选：共培养完成后，将愈伤组织转移至含有50mg/ml潮霉素的筛选培养基中，26-30度条件下进行抗性愈伤组织筛选。(4)抗性愈伤的分化：将筛选培养基中生长状态良好的愈伤置于分化培养基中，置于15小时光照/9小时黑暗、环境温度在26-30度之间的条件下，分化培养，直至分化长出小苗。(5)分化小苗生根：待分化小苗长成约4cm左右时，将小苗转移到生根培养基中，进行生根培养。长出根系的小苗移栽于温室或转基因安全圃中进行生长。对植株进行鉴定和连续的观察发现，与同时期的突变体比较，转基因互补t1代植株抽穗期叶片和成熟期穗部形态恢复到正常状态(图4)。

本发明的基于自主获得一种水稻突变体hk73，以此为基础构建了定位群体，并进行图位克隆，最终克隆到新基因hk73及其蛋白，并获得了与该基因紧密连锁的分子标记，上述蛋白、基因及分子标记可用于分子育种，上述分子育种可通过转基因或是分子标记辅助选择育种等本领域技术人员熟知的常规操作方式进行。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰，均落在本发明的保护范围内。

序列表

<110>中国水稻研究所

<120>一种水稻叶片衰老和穗型调控基因hk73及其编码的蛋白质、分子标记与应用

<160>10

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>3408

<212>dna

<213>稻属水稻(oryzasativa)

<400>1

atggcgcggaagaagatccgggagtacgactccaagcgcctcctaagggagcacctcaag60

cgcctcgccgccatcgacctccacatcctctccgcccaggtacaccacatccatctacct120

ctctgttcctcgcgcttggatcggctcgtggtttggtggaattccgcgtggatctcggcg180

ctcggggatcggagcgtgtggattcggcgacctctcgcggtttggcctcgtaggatcttc240

gggggggggggggggggggagggggggtaagggttggagttctgaggtgttttggactcg300

gaggtgtgctccgattaggcgaaattctgctcaaagagggctcaatttcgtgttgtcaac360

tggtgattgtagctgtggctgtagctgccggctgatgtggaagtatatgtgatttgttag420

aatggttagtacctggcaacgaaatctgtttgggtgattgggcaaaatacatttgaattg480

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gaactgtactttttcttaggtcacggaatcaactgatttcacagagctcgtcaaccaaga1260

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ttctattgtatcagagaggcttggttccaccattagcttctcggagtgtggaggtattga1620

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actcaattcctctagtgttagaacttattattgatgatacctattttggtctgcattagc1860

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tgatttcatcagaggtgtatattctgttttccaaggtaattcacagttgaaaaataaaaa1980

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ctagacatgagaggagaattggacgacacagctgcctttaagaactttaagaagtatgat2160

tcaggcttttttttttctagcttacatagtgtccagttcaatcctttcaccatgcttgtc2220

atgctaaccagagcttccatggcataggtggggaaacattcagttccctctgcctttcgg2280

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caaattgaatttcactgcctctgcatgcaaaatattgaatcttgaattgaggttgatgta2460

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tccagatcttttttaggttaagttttgaagtttatcagtgccattcacacactggacaat2640

atcaccaggttggagatttgggatatgcgtcagagcttggaaattatgcagaatacagcg2700

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ttgaatctttgtagtgtgccactgctgatcctgatggccgtaagagagctcttctcattg2880

gaggtggtatagcgaacttcactgatgtcgctgctacattcagtggcatcattcgagctt2940

taagagagaaggcaagtttcgattggatcgttgttctgtccccaaccactcccacttgtt3000

gccattaaaatcttcatccatcttattattgtctggcttccaaatctggtggcaggaatc3060

caaattgaaggctgcacggatgaacatttacgttcggagaggtggtccaaactaccaaac3120

tggccttgccaaaatgcgtacactaggtgcagaacttggtgttccaattgaggtatggac3180

ctactggctacttactatgttcttccagcaaaccttagctcagccatttcctacactatt3240

tatcagaattcgtcagagattaactttattagacataggacaccattggaccatccccat3300

gatcataacggacgagctgaattcactgaattgcaggtatatggaccagaggcaacaatg3360

actggaatctgcaagcaagccattgattgcatcatggctgaagcataa3408

<210>2

<211>423

<212>prt

<213>稻属水稻(oryzasativa)

<400>2

metalaarglyslysileargglutyraspserlysargleuleuarg

151015

gluhisleulysargleualaalaileaspleuhisileleuserala

202530

glnvalthrgluserthraspphethrgluleuvalasnglnglupro

354045

trpleusersermetlysleuvalvallysproaspmetleuphegly

505560

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65707580

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100105110

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115120125

thrileserpheserglucysglyglyilegluileglugluasntrp

130135140

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145150155160

aspalacysalaproleuilealathrleuproleugluvalargthr

165170175

lysileglyasppheileargglyvaltyrservalpheglnaspleu

180185190

asppheserpheleuglumetasnprophethrmetvalasnglyglu

195200205

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210215220

lysasnphelyslystrpglyasnileglnpheproleuprophegly

225230235240

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245250255

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260265270

trpthrmetvalalaglyglyglyalaservaliletyralaaspthr

275280285

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290295300

serglyalaproasngluglugluvalleuglntyralaargvalval

305310315320

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325330335

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340345350

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355360365

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370375380

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385390395400

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405410415

aspcysilemetalagluala

420

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(12-26f)

<400>3

agagagcccctaaatttccg20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(12-26r)

<400>4

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<211>23

<212>dna

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<210>6

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<212>dna

<213>人工序列(k73-22r)

<400>6

ggagagccacaggaacagatcg22

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(k73-24f)

<400>7

agccaaaaccaaatccaaaa20

<210>8

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(k73-24r)

<400>8

cttcgagttggccatattcac21

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(k73-31f)

<400>9

gaccttctccctcctccaac20

<210>10

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(k73-31r)

<400>10

gtgtgggacttgaacacgg19