一种基于液基制片技术的真菌检测方法与流程

本申请涉及医学化验领域，特别涉及一种基于液基制片技术的真菌检测方法。
背景技术：
：真菌属于真核生物，没有质体，营养方式为吸收，无吞噬作用。细胞壁含有甲壳质和β-葡聚糖。可引起人类，动物的疾病，称为真菌病，还可引起植物的疾病、人类过敏性疾病和真菌毒素中毒症。真菌侵犯人体常继发于其他疾患，如恶性肿瘤、糖尿病等慢性消耗性疾病；大剤量x线照射；免疫抑制剂等导致免疫功能和抵抗力低下；大量应用肾上腺皮质激素的病人，其炎症反应多受抑制，也容易感染真菌；另外器官移植、导管插管、放疗等应用引起局部组织损伤，为真菌的入侵提供了条件。近年来由于免疫缺陷病毒感染者的不断出现，使原来不致病的真菌转为致病真菌。因此，真菌感染已经成为一个日益严峻的问题。真菌分为浅部真菌和深部真菌。浅部真菌:主要侵犯机体皮肤，寄生和腐生于表皮，毛发和甲板的角质组织中，引起浅部真菌病，简称癣病。临床最多见的浅部真菌病有:体癣、股癣、手癣和足癣。真菌感染在常用的检测方法包括：直接镜检法(如koh涂片或乳酸酚棉蓝涂片)及染色镜检法。其中，直接镜检法缺点在于阳性率较低，阴性结果也不能排除诊断，背景杂乱，灵敏度低，漏检率高，对操作人员专业识别能力要求高。一般的染色镜检法包括：革兰染色、吉姆萨染色、pas法、六胺银法(gms)、银氨液浸染法(g-s)、gridley染色法、粘蛋白卡红(mayer’smucicarminstain)染色法、巴氏染色法等。这几种特殊染色法的优点在于：在控制好染色细节的前提下，可染出漂亮的真菌形态，容易辨识。申请人在实现本申请的过程中发现，上述现有的处理方案至少存在如下的问题：1、对操作人员专业技能要求比较高。2、操作繁琐，用时长(1小时左右)。3、配套所需试剂的种类繁多，贮存管理麻烦。技术实现要素：本申请实施例提供一种基于液基制片技术的真菌检测方法，可以简便快捷的实现在待检测样本中过滤杂质，富集需检测的真菌进行制片，以便于观察和检测，有效的解决了现有技术中所存在的操作繁琐、过程耗时长，所需试剂多的问题。为了达到上述技术目的，本申请实施例提供了一种基于液基制片技术的真菌检测方法，所述方法具体包括：步骤1、采集样本，并将样本放入含有对白带其消化作用成分的细胞保存液中，化解黏稠物质；步骤2、通过过滤膜对包含样本的细胞保存液进行过滤；步骤3、通过截留膜对过滤后液体中的目标检测物进行截留；步骤4、将所述截留膜截留得到的目标检测物转移至载玻片，进行制片；步骤5、在制片完成的载玻片上盖上盖玻片，并通过显微镜进行真菌检测。优选的，所述步骤1，具体包括：将样本放入装有细胞保存液的样本试剂盒或试管中；将样本试剂盒或试管置于振荡器上震荡混匀，对粘稠物质进行充分化解。优选的，步骤2至步骤4的处理，具体通过tct制片机完成；其中，通过所述tct制片机执行步骤2至步骤4的处理过程，具体为：(1)将真菌样本溶液加入样本过滤器，所述样本过滤器由相联通的上下两体构成，上体安装了过滤网，保证所需真菌能通过过滤网，下体安装截留膜，保证所需观测的真菌被阻挡在截留膜上；(2)将所述样品过滤器安装到所述tct制片机中，所述样品过滤器的底部由所述tct制片机内置的真空泵产生负压，将样本溶液吸抽通过所述过滤网和所述截留膜，其中，所述真菌样本溶液中的杂质被所述过滤网过滤，所需观测的真菌被截留膜截留；(3)所述tct制片机将所述样本过滤器的上下两体结构分离，将载玻片推入被分离的所述上下两体结构的中间；(4)所述tct制片机将含有所需观测的真菌的截留膜由下至上的覆盖在所述载玻片上，停留样本转移时间10～20s，将所需观测的真菌转移至所述载玻片上；(5)所述tct制片机推出已制片完成的载玻片，制片结束。优选的，所述过滤网的滤孔直径为0.75-1.5mm。优选的，所述截留膜的滤孔直径为5-20μm。优选的，所述步骤5之前，还包括：在所述载玻片上滴加荧光染色液，对目标检测物进行染色。优选的，所述荧光染色液由以下配方按照重量百分比混合而成：荧光增白剂0.001％、氢氧化钾10％、二甲基亚砜4％、氯化钠3.6％、甘油10％、伊文思蓝0.01％，余量为纯化水；优选的，所述荧光染色液的配置方法为：(1)称取相应重量配比的氢氧化钾加入部分水进行充分搅拌溶解散热，待冷却至室温后，依次加入二甲基亚砜、氯化钠和甘油，搅拌均匀至无分层现象，溶解过程放热升温，自然冷却至室温备用，得到透明无色清澈液体，命名为甲液；(2)称取相应重量的荧光增白剂加入部分水中进行充分搅拌溶解，得到透明无色或淡黄色清澈液体，命名为乙液；(3)称取相应重量的伊文思蓝加入部分水中进行充分搅拌溶解，得到蓝紫色无析出物颗粒清澈液体，命名为丙液；(4)将乙液加入至甲液充分混匀，确保容器内无固体沉淀或絮状物，得到透明无色或淡黄色清澈液体，命名为丁液；(5)最后将丙液与丁液混合。优选的，所述在所述载玻片上滴加荧光染色液，对目标检测物进行染色之后，还包括：将滴加了荧光染色液的载玻片静置30秒。优选的，在所述载玻片上所滴加的荧光染色液的量，具体为50ul。与现有技术相比，本申请实施例所提出的技术方案的有益技术效果包括：本申请实施例公开了一种基于液基制片技术的真菌检测方法，以含有对白带其消化作用成分的细胞保存液化解样本中的黏稠物质，通过过滤网滤除杂质，并通过截留膜对目标检测物进行截留，从而，可以将目标检测物富集并转移至载玻片上进行制片，实现对真菌的精确检测，通过应用本申请实施例所提出的技术方案，可以简便快捷的实现在待检测样本中过滤杂质，富集需检测的真菌进行制片，以便于观察和检测，有效的解决了现有技术中所存在的操作繁琐、过程耗时长，所需试剂多的问题。附图说明为了更清楚地说明本申请的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本申请实施例所提出的一种基于液基制片技术的真菌检测方法的流程示意图；图2为本申请实施例所提出的一种通过tct制片机执行步骤s102至步骤s104的处理过程的流程示意图；图3为本申请实施例所提出的一种具体应用场景下的基于液基制片技术及荧光染色技术的真菌检测方法的流程示意图；图4为本申请实施例所提出的一种具体应用场景下，通过基于液基制片技术的真菌检测方法处理后的真菌样本，在目镜10倍，物镜40倍的情况下，通过荧光显微镜所观察到的念珠菌和孢子的成像示意图；图5为本申请实施例所提出的一种具体应用场景下，通过基于液基制片技术的真菌检测方法处理后的真菌样本，在目镜10倍，物镜10倍的情况下，通过荧光显微镜所观察到的甲屑的成像示意图；图6为本申请实施例所提出的一种具体应用场景下，通过基于液基制片技术的真菌检测方法处理后的真菌样本，在目镜10倍，物镜10倍的情况下，通过荧光显微镜所观察到的皮屑的成像示意图；图7为本申请实施例所提出的一种具体应用场景下，通过基于液基制片技术的真菌检测方法处理后的真菌样本，在目镜10倍，物镜10倍的情况下，通过荧光显微镜所观察到的阴道分泌物的成像示意图；图8为本申请实施例所提出的一种具体应用场景下，通过基于液基制片技术的真菌检测方法处理后的真菌样本，在目镜10倍，物镜40倍的情况下，通过荧光显微镜所观察到的念珠菌的成像示意图；图9为本申请实施例所提出的一种具体应用场景下，通过基于液基制片技术的真菌检测方法处理后的真菌样本，在目镜10倍，物镜10倍的情况下，通过荧光显微镜所观察到的念珠菌的成像示意图。具体实施方式正如本申请
背景技术：
所陈述的，现有的现有技术中存在操作繁琐、过程耗时长，所需试剂多等问题。为了解决这样的问题，本申请实施例提供了一种基于液基制片技术的真菌检测方法，可以简便快捷的实现在待检测样本中过滤杂质，富集需检测的真菌进行制片，以便于观察和检测。如图1所示，为本申请实施例所提出的一种基于液基制片技术的真菌检测方法的流程示意图，该方法应用于包括服务器，各下锚补偿装置所对应的数据采集装置，以及监控信息显示平台的下锚补偿装置的实时监控系统中，所述方法具体包括：步骤s101、采集样本，并将样本放入含有对白带其消化作用成分的细胞保存液中，化解黏稠物质。在具体的样本采集过程中，可以采用一次性植绒头的采集拭子进行操作。这样的材料释放率高达95％，且无微细纤维脱落。并且，取样放入细胞保存液中后，为了避免样品损失，可直接于保存液瓶中将采集拭子的杆折断，避免取出拭子时将样品带出，造成被检测物的损失。而被折断的采集拭子头，则可以通过步骤s102的过滤操作进行滤除，不会对后续操作造成影响。当然，在不影响检测结果的情况下，其他样品采集方式也可以应用于本申请实施例所提出的技术方案，这样的变化并不会影响本申请的保护范围。在具体的应用场景中，本步骤还可以进一步增加搅拌或振荡摇匀的操作，以便实现样品在细胞保存液中的充分溶解，尽可能的对黏稠物质进行化解。这样的变化同样属于本申请的保护范围。具体的，实际操作中的振荡摇匀过程可以通过振荡器辅助完成，便捷高效，具体的操作过程为：将样本放入装有细胞保存液的样本试剂盒或试管中；将样本试剂盒或试管置于振荡器上震荡混匀，对粘稠物质进行充分化解。步骤s102、通过过滤膜对包含样本的细胞保存液进行过滤。在具体的应用场景中，所述过滤网的滤孔直径可以为0.75-1.5mm，达到放过目标检测物，滤除大型杂质的目的。具体的滤孔直径数值可以根据实际需要进行调整，这样的变化并不会影响本申请的保护范围。步骤s103、通过截留膜对过滤后液体中的目标检测物进行截留。在具体的应用场景中，所述截留膜的滤孔直径为5-20μm。达到截留目标检测物，放过微小粒子，滤除检测杂质的目的。具体的滤孔直径数值可以根据实际需要进行调整，这样的变化并不会影响本申请的保护范围。步骤s104、将所述截留膜截留得到的目标检测物转移至载玻片，进行制片。至此，基于液基制片技术的制片过程完成，此过程中的步骤s102至步骤s104可以分阶段逐一操作，也可以通过tct(thinprepcytologictest，液基薄层细胞检测)制片机来自动完成，进一步提高效率，减少人工操作的失误干扰，并提高成片精确度。具体的，通过tct制片机执行步骤s102至步骤s104的处理过程的流程示意图如图2所示，具体为：步骤s201、将真菌样本溶液加入样本过滤器，所述样本过滤器由相联通的上下两体构成，上体安装了过滤网，保证所需真菌能通过过滤网，下体安装截留膜，保证所需观测的真菌被阻挡在截留膜上。与前述的步骤s102和步骤s103中的说明相类似，本步骤中的过滤网和截留膜的滤孔直径同样可以参考上述的尺寸数值，达到相同的过滤效果。步骤s202、将所述样品过滤器安装到所述tct制片机中，所述样品过滤器的底部由所述tct制片机内置的真空泵产生负压，将样本溶液吸抽通过所述过滤网和所述截留膜。其中，所述真菌样本溶液中的杂质被所述过滤网过滤，所需观测的真菌被截留膜截留。通过负压处理，提高了过滤速度，且可以增强过滤效果。步骤s203、所述tct制片机将所述样本过滤器的上下两体结构分离，将载玻片推入被分离的所述上下两体结构的中间。步骤s204、所述tct制片机将含有所需观测的真菌的截留膜由下至上的覆盖在所述载玻片上，停留样本转移时间10～20s，将所需观测的真菌转移至所述载玻片上。步骤s205、所述tct制片机推出已制片完成的载玻片，制片结束。当然，通过tct制片机执行上述的步骤s102至步骤s104的处理是进一步提高制片速度，提高制片精度效果的处理举措，但在达到相同技术效果的情况下，是否采用tct制片机代替人工或其他仪器的操作进行上述处理，并不会影响本申请的保护范围。步骤s105、在制片完成的载玻片上盖上盖玻片，并通过显微镜进行真菌检测。至此，本申请实施例所提出的一种基于液基制片技术的真菌检测方法的处理方案完成，根据上述真菌检测操作，所生成的检测结果，滤除了杂质的干扰，且制备过程便捷。需要进一步指出的是，为了进一步提高检测便捷性，将目标检测物更清晰的进行展示，可以通过添加荧光染色液的方式进一步的提升目标检测物的显影效果，具体的操作方式，是在步骤s105执行之前，在所述载玻片上滴加荧光染色液，对目标检测物进行染色。进一步的，在染色完成之后，为了更充分的着色，还包括以下的静置处理：将滴加了荧光染色液的载玻片静置30秒。当然，是否进行静置，以及静置时间的长短可以根据实际需要进行调整，这样的变化并不会影响本申请的保护范围。在实际的应用中，在所述载玻片上所滴加的荧光染色液的量，具体为50ul。当然，所滴加的荧光染色液的剂量可以根据实际需要进行调整，这样的变化并不会影响本申请的保护范围。在实际的应用中，上述的荧光染色液中各配方的重量百分比和效果说明如下：荧光增白剂，0.001％，与真菌细胞壁β-多糖类物质特异性的结合，从而标记荧光进行检测，在荧光显微镜特定的激发光波段下(340～400nm)，菌丝或孢子发出明亮的蓝绿色荧光。氢氧化钾，10％，溶解角质，使组织透化。二甲基亚砜，4％，促进荧光增白剂在氢氧化钾溶液中溶解，同时帮助荧光增白剂渗透进入样本中。氯化钠，3.6％，提高荧光增白剂与真菌细胞壁结构的结合强度，在紫外荧光激发的情况下，可以让菌体结构突显的更加清晰可见、立体，更方便识别真菌。甘油，10％，保湿，保持滴了染色液的样本一定时间的湿度，便于镜下观察。伊文思蓝，0.01％，弱化杂乱背景，使背景与真菌对比明显，便于识别。其与成分均为纯化水，起到对各配方进行溶解的作用。在具体的应用场景中，根据上述配方，荧光染色液的配置方法具体为：(1)称取相应重量配比的氢氧化钾加入部分水进行充分搅拌溶解散热，待冷却至室温后，依次加入二甲基亚砜、氯化钠和甘油，搅拌均匀至无分层现象，溶解过程放热升温，自然冷却至室温备用，得到透明无色清澈液体，命名为甲液。(2)称取相应重量的荧光增白剂加入部分水中进行充分搅拌溶解，得到透明无色或淡黄色清澈液体，命名为乙液。(3)称取相应重量的伊文思蓝加入部分水中进行充分搅拌溶解，得到蓝紫色无析出物颗粒清澈液体，命名为丙液。(4)将乙液加入至甲液充分混匀，确保容器内无固体沉淀或絮状物，得到透明无色或淡黄色清澈液体，命名为丁液。(5)最后将丙液与丁液混合。与现有技术相比，本申请实施例所提出的技术方案的有益技术效果包括：本申请实施例公开了一种基于液基制片技术的真菌检测方法，以含有对白带其消化作用成分的细胞保存液化解样本中的黏稠物质，通过过滤网滤除杂质，并通过截留膜对目标检测物进行截留，从而，可以将目标检测物富集并转移至载玻片上进行制片，实现对真菌的精确检测，通过应用本申请实施例所提出的技术方案，可以简便快捷的实现在待检测样本中过滤杂质，富集需检测的真菌进行制片，以便于观察和检测，有效的解决了现有技术中所存在的操作繁琐、过程耗时长，所需试剂多的问题。下面将结合本申请中的附图，对本申请中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。为了克服现有技术的缺陷，本申请实施例所提出的一种基于液基制片技术的真菌检测方法，可以简便快捷的实现在待检测样本中过滤杂质，富集需检测的真菌进行制片，以便于观察和检测。为了进一步体现更优的检测效果，本实施例基于“金标准”真菌培养法，以及添加荧光染色剂的具体应用场景，对本申请所提出的基于液基制片技术的真菌检测方法进行说明。之所以滴加前述配方的荧光染色液，是因为：真菌为真核生物，细胞壁中含较多的几丁质及纤维素等β-多糖类物质。而荧光增白剂可与人体各类组织或样本(包括皮屑、甲屑、毛发、尿液、体液以及阴道分泌物等)中可能存在的细胞壁β-多糖类物质特异性的结合，从而标记荧光进行检测。各种丝状真菌及酵母菌均可以被荧光染色，包括念珠菌属、毛癣菌属、表皮癣菌属、小孢子菌属、组织胞浆菌属、曲霉属等。真菌菌丝的不同发育阶段均可被荧光染色，有助于病理诊断。荧光染色法亲和力高，反应时间只需数十秒钟即可完，大大提高临床真菌检测灵敏度和效率。在荧光显微镜特定的激发光波段下(340～400nm)，菌丝或孢子发出明亮的蓝绿色荧光，真菌轮廓和黑暗背景可形成强烈对比反差，真菌形态结构较koh湿片法更为清晰，非常便于找寻和识别。而且真菌荧光染色液也含10％koh，溶解角质，使组织透化。值得注意的是，荧光染色法也能标记植物纤维素，空气和玻片上存在的少量纤维，在荧光显微镜下发荧光。但纤维形态一般不规则，大小、粗细、亮度等都与真菌有很大差异，没有典型的真菌横隔和出芽结构，凭经验一般可以避免假阳性情况的发生。本产品为单剂型染色液，不仅在操作上与koh法步骤一致，只需数十秒即可镜下观测(甲屑需延长1～2min)。而且标本中菌丝、孢子荧光标记后结构清晰，显著提高了菌体辨识度。如图3所示，为本申请实施例所提出的一种具体应用场景下的基于液基制片技术及荧光染色技术的真菌检测方法的流程示意图，该方法具体包括两个过程：1、“金标准”真菌培养法。(1)提前半小时打开超净工作台紫外灯消毒灭菌，操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。(2)拿出配置好的培养基，与妇科样本相对应进行编号。(3)按照对应编号，打开平板先在其上滴一滴已灭菌的生理盐水，将采样拭子蘸上生理盐水后均匀涂布在平板上，盖上培养皿盖，将采样拭子放回原管中。(4)倒置培养皿于33℃生化培养箱中培养24-72h，期间观察培养皿内菌落生长情况。基于上述操作培养的真菌样本，进一步执行后续检测操作。2、基于液基制片技术及荧光染色技术的真菌检测操作。步骤s301、采集样本，并将样本放入装有细胞保存液的样本试剂盒当中。步骤s302、将样本试剂盒置于振荡器上震荡混匀。步骤s303、在液基真菌制片仪上安装样本过滤器及载玻片。步骤s304、将样本试剂盒中所有样本液加入已安装好后的样本过滤器中。步骤s305、启动液基真菌制片仪进行自动制片。步骤s306、制片完成后取出玻片，在玻片上滴加50ul荧光染色液，盖上盖玻片后静置30s。步骤s307、在荧光显微镜下进行镜检。通过上述方法处理后的样品，在荧光显微镜下所观察到的真菌图像如图4至图9所示，具体说明如下：如图4所示，为本申请实施例所提出的一种具体应用场景下，通过基于液基制片技术的真菌检测方法处理后的真菌样本，在目镜10倍，物镜40倍的情况下，通过荧光显微镜所观察到的念珠菌和孢子的成像示意图；如图5所示，为本申请实施例所提出的一种具体应用场景下，通过基于液基制片技术的真菌检测方法处理后的真菌样本，在目镜10倍，物镜10倍的情况下，通过荧光显微镜所观察到的甲屑的成像示意图；如图6所示，为本申请实施例所提出的一种具体应用场景下，通过基于液基制片技术的真菌检测方法处理后的真菌样本，在目镜10倍，物镜10倍的情况下，通过荧光显微镜所观察到的皮屑的成像示意图；如图7所示，为本申请实施例所提出的一种具体应用场景下，通过基于液基制片技术的真菌检测方法处理后的真菌样本，在目镜10倍，物镜10倍的情况下，通过荧光显微镜所观察到的阴道分泌物的成像示意图；如图8所示，为本申请实施例所提出的一种具体应用场景下，通过基于液基制片技术的真菌检测方法处理后的真菌样本，在目镜10倍，物镜40倍的情况下，通过荧光显微镜所观察到的念珠菌的成像示意图；如图9所示，为本申请实施例所提出的一种具体应用场景下，通过基于液基制片技术的真菌检测方法处理后的真菌样本，在目镜10倍，物镜10倍的情况下，通过荧光显微镜所观察到的念珠菌的成像示意图。通过应用上述的处理方案，申请人在累积了200余例的真菌检测数据后，得到的效果统计如下：灵敏度特异度阳性预测值阴性预测值准确度漏检率75.00％99.30％97.83％90.38％92.08％9.62％通过与同一样本在其他方案中的检测数据对比，上述统计数据具有明显优势。与现有技术相比，本申请实施例所提出的技术方案的有益技术效果包括：1、可以将绝大部分样本富集起来制片，大大提高阳性检出率。2、制片操作极为简单。操作人员只需将样本过滤器与载玻片安装到液基真菌制片仪上，并加入被测样本液，液基真菌制片仪将在数十秒内自动完成样本过滤、废液排除、样本收集及玻片制片的过程，提高了制片效果及工作效率，降低人工操作复杂程度。3、易于识别真菌，灵敏度高，提高了染色结果判读的准确率和效率。4、检出率高，适用范围广。本领域技术人员可以理解附图只是一个优选实施场景的示意图，附图中的模块或流程并不一定是实施本发明实施例所必须的。本领域技术人员可以理解实施场景中的装置中的模块可以按照实施场景描述进行分布于实施场景的装置中，也可以进行相应变化位于不同于本实施场景的一个或多个装置中。上述实施场景的模块可以合并为一个模块，也可以进一步拆分成多个子模块。以上公开的仅为本发明实施例的具体实施场景，但是，本申请实施例并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本申请实施例的业务限制范围。当前第1页12