一种橙皮素的制备方法、橙皮素中间体的制备方法和用于制备橙皮素的生物酶与流程

本发明涉及生物医药
技术领域：
，特别涉及一种橙皮素的制备方法、橙皮素中间体的制备方法和用于制备橙皮素的生物酶。
背景技术：
：橙皮素(hesperetin)，分子式为c16h14o6，熔点为227.5℃，其水溶性很差，几乎不溶于水，也不溶于氯仿和笨，易溶于乙醇等。在自然界中多以橙皮苷(hesperidin)的形式存在。研究表明，橙皮素是一种中药提取物，主要存在于陈皮、青皮、枳壳等中药材中，是他们的主要起效成分，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎症、防止动脉粥样硬化等多种功效。目前常用酸水解法将新橙皮苷(neohesperidin)或橙皮苷水解得到橙皮素，此外还有很多文献报道的如水相-乙醇法、甲醇法、环己醇法等制备橙皮素方法，但这些方法工艺繁琐、污染严重，并且产物纯化困难等。近来发展的酶水解法有水解温度较低，水解反应较好控制等特点，但是经发酵产酶的产率并不高，价格昂贵，而且水解率较低，若酶系中含有多种酶，得到的反应产物仍然复杂，使得分离纯化困难。因此，发展一种工艺简单、成本低、产率高且绿色环保的橙皮素制备方法具有重要意义。技术实现要素：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种橙皮素的制备方法、橙皮素中间体的制备方法和用于制备橙皮素的生物酶；本发明所述制备方法工艺简单、产量高和安全环保。第一方面，本发明提供了一种橙皮素的制备方法，包括：将橙皮苷或新橙皮苷悬浮于水中，并加入氢氧化钠溶液至所述橙皮苷或所述新橙皮苷完全溶解后得到底物配制液；采用底物流加法将所述底物配制液以0.1-100ml/min的速度加入至含有α-l-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的缓冲液中进行搅拌反应并得到反应液，流加完成后继续反应0.5-1h，其中，所述反应液的ph为6.0-7.0，反应温度维持在45-65℃，所述α-l-鼠李糖苷酶来源于链霉菌属，所述β-葡萄糖苷酶来源于海栖热袍菌属；调节所述反应液的ph至3.0-5.0使固体产物完全析出，收集所述固体产物，所述固体产物即为橙皮素。本发明中，所述橙皮素的制备方法的具体工艺路线如下所示：其中，所述工艺采用生物酶法，所述橙皮苷如式(ⅰ)所示，所述橙皮素如式(ⅲ)所示。图中，式(ⅱ)所示为橙皮素-7-o-葡萄糖苷(hesperitin-7-o-glucoside)，也称橙皮素单葡萄糖苷，分子式c22h24o11，相对分子质量464，是在生物酶水解橙皮苷生成橙皮素过程中的中间体，是由橙皮苷脱掉一个鼠李糖之后的产物，在本发明中统称为橙皮素中间体。所述橙皮素中间体的含量很低，相较于橙皮素的含量可以忽略不计。所述新橙皮苷的化学结构式如(ⅵ)所示，将新橙皮苷按照上述生物酶法橙同样可以制得所述橙皮素，可选地，所述α-l-鼠李糖苷酶的基因编码序列包括如seqidno：1所示的核苷酸序列，所述β-葡萄糖苷酶的基因编码序列包括如seqidno：2所示的核苷酸序列。α-l-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的来源广泛，目前在动物组织、植物和微生物中均有发现，然而关于动物组织和植物来源的报道相对较少。不同微生物来源的α-l-鼠李糖苷酶或β-葡萄糖苷酶的酶学性质存在差异，包括酶的比活性、酶作用的底物范围、最适ph、最适温度、作用时间和酶的稳定性等方面。例如，细菌来源的α-l-鼠李糖苷酶最适ph呈中性或碱性，而真菌分泌的α-l-鼠李糖苷酶的最适ph一般在酸性范围内。并非所有的α-l-鼠李糖苷酶均对橙皮苷或新橙皮苷都有水解能力；本发明所述α-l-鼠李糖苷酶来源于链霉菌属(streptomyces)，通过水解底物(橙皮苷或新橙皮苷)的活力大小筛选获得活力较高的基因，经表达得到本发明所述的α-l-鼠李糖苷酶，所述α-l-鼠李糖苷酶可以高效专一的水解橙皮苷或新橙皮苷并得到橙皮素-7-o-葡萄糖苷。本发明所述β-葡萄糖苷酶属于海栖热袍菌属(thermotogapetrophilarku-1)，采用同样方法获得，所述β-葡萄糖苷酶可以高效专一的水解橙皮素-7-o-葡萄糖苷得到橙皮素。可选地，所述α-l-鼠李糖苷酶和所述β-葡萄糖苷酶通过大肠杆菌共表达产生。可选地，本发明所述α-l-鼠李糖苷酶和所述β-葡萄糖苷酶通过大肠杆菌rosetta(de3)共表达产生。其中所述α-l-鼠李糖苷酶和所述β-葡萄糖苷酶是两个独立的蛋白分子。所述α-l-鼠李糖苷酶和所述β-葡萄糖苷酶以粗酶液的形式参与反应。可选地，所述α-l-鼠李糖苷酶和所述β-葡萄糖苷酶的质量比为1：(0.1-10)。所述所述粗酶液是由大肠杆菌rosetta(de3)诱导表达所述α-l-鼠李糖苷酶和所述β-葡萄糖苷酶后，对所述大肠杆菌rosetta(de3)进行离心、清洗、破胞后收集得到。本发明通过采用共表达形式得到α-l-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶粗酶液水解橙皮苷或新橙皮苷并制备橙皮素的方法，工艺精简，节约成本，产量高，而且绿色环保。可选地，所述α-l-鼠李糖苷酶通过大肠杆菌表达产生；所述β-葡萄糖苷酶通过大肠杆菌表达产生。所述α-l-鼠李糖苷酶在所述粗酶液的质量浓度可以进行一定范围的调节。可选地，所述α-l-鼠李糖苷酶在所述粗酶液的质量浓度范围为0.2-3％。可选地，所述α-l-鼠李糖苷酶的氨基酸序列的羧基端含有his标签。所述his标签有利于表达后蛋白的分离纯化，及在实验中的分析和追踪，比如用于免疫印迹实验时的分析。当所述α-l-鼠李糖苷酶和所述β-葡萄糖苷酶通过大肠杆菌共表达产生时，所述α-l-鼠李糖苷酶和所述β-葡萄糖苷酶之间可以分别分离及提纯。本发明中，所述底物配制液制备的具体过程包括，将橙皮苷或新橙皮苷悬浮于水中，并加入5-10mol/l氢氧化钠溶液至所述橙皮苷或所述新橙皮苷完全溶解后得到底物配制液。可选地，所述氢氧化钠在底物配制液中的终浓度为0.25-0.5mol/l。所述浓度的氢氧化钠溶液可以有效提高橙皮苷的溶解性。相应地，所述浓度的氢氧化钠溶液可以有效提高新橙皮苷的溶解性。本发明中，所述采用底物流加法将所述底物配制液以0.1-100ml/min的速度加入至含有α-l-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的缓冲液中进行搅拌反应并得到反应液的过程中，所述底物配制液的流加时间为4-6h。进一步地，可选地，所述底物配制液的流加时间为4.5-5.5h。所述流加时间是指所述底物配制液完全流加至所述反应液中的时间，所述底物配制液在所述底物流加法中的流加的速度根据所述流加时间进行调节。可选地，所述橙皮苷或所述新橙皮苷在所述反应液的质量溶度为2.5-10％。进一步地，可选地，所述橙皮苷或所述新橙皮苷在所述反应液的质量溶度为5-10％。例如，所述橙皮苷或所述新橙皮苷在所述反应液的质量溶度为5％，或为8％，或为10％。可选地，所述反应液的ph为6.0-7.0，反应温度维持在45-65℃。进一步地，可选地，所述反应液的ph为6.5-7.0。可选地，所述反应温度维持在55-65℃。可选地，所述α-l-鼠李糖苷酶在所述反应液中的质量浓度为0.05-0.5％。进一步可选地，所述α-l-鼠李糖苷酶在所述反应液中的质量浓度为0.1-0.5％。可选地，所述缓冲液的缓冲剂包括磷酸盐、tris缓冲剂或其他缓冲剂。优选地，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液或tris缓冲液。进一步地，优选地，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液。具体地，所述缓冲液包括磷酸钠缓冲液。所述磷酸钠缓冲液中和所述氢氧化钠溶液具有相同的阳离子，可以减少其他杂质阳离子的添加，防止其他杂质阳离子降低酶(包括α-l-鼠李糖苷酶或β-葡萄糖苷酶)的生物活性。所述缓冲液的ph为6.0-7.0。可选地，所述缓冲液的浓度为80-110mmol/l。进一步可选地，所述缓冲液的浓度为70-100mmol/l。优选地，所述缓冲液的浓度为90-110mmol/l。例如，所述缓冲液的浓度为70mmol/l，或为80mmol/l，或为100mmol/l。可选地，所述调节所述反应液的ph至3.0-5.0使固体产物完全析出的过程包括向所述反应液加入酸溶液并调节所述反应液的ph至3.0-5.0，搅拌反应0.5-1h后使固体产物完全析出。可选地，所述酸溶液的浓度为2-6mol/l。进一步地，所述酸溶液的浓度为4-6mol/l。所述酸溶液包括盐酸。可选地，所述收集的过程包括将对所述反应液进行过滤、洗涤、干燥和重结晶过程。其中，所述干燥过程包括采用真空干燥，温度为50-60℃。所述重结晶过程包括：将干燥后的所述固体完全溶解于甲醇中，温度在40-60℃，过滤得到滤液，对所述滤液进行浓缩至原体积的5-10％后加水至所述橙皮素结晶固体全部析出，重复操作得到橙皮素的精品。本发明第一方面所提供的橙皮素的制备方法，所述制备方法工艺简单，成本低廉、绿色环保；由所述制备方法制得的橙皮素具有极高的产率。本发明利用底物流加法，将含有橙皮苷或新橙皮苷底物流加到反应体系中，底物终浓度可高到达10％，远远大于现有技术，相较与已报道现有制备工艺提高了5000倍左右，产能得到大幅度提高，适应大规模工业化生产。第二方面，本发明提供了一种橙皮素中间体的制备方法，包括：将橙皮苷或新橙皮苷悬浮于水中，并加入氢氧化钠溶液至所述橙皮苷或所述新橙皮苷完全溶解后得到底物配制液；采用底物流加法将所述底物配制液以0.1-100ml/min的速度加入至含有α-l-鼠李糖苷酶的缓冲液中进行搅拌反应并得到反应液，流加完成后继续反应0.5-1h，其中，所述反应液的ph为6.0-7.0，反应温度维持在45-65℃，所述α-l-鼠李糖苷酶来源于链霉菌属；收集所述反应液中析出的固体产物，所述固体产物即为橙皮素中间体。可选地，所述收集的过程包括对所述反应液进行过滤、洗涤、干燥和重结晶过程。所述重结晶过程包括：将干燥后的所述固体完全溶解于丙酮溶液中，温度在30-40℃，过滤得到滤液，对所述滤液进行浓缩至原体积的5-10％后加水至所述橙皮素中间体结晶固体全部析出，重复操作得到橙皮素中间体的精品。所述丙酮溶液是指丙酮体积比为60-80％的水溶液。可选地，所述橙皮素中间体的制备方法中，所述橙皮素中间体的固体产物在反应体系几乎不进行进一步的水解，即所述橙皮素在反应体系中的含量特别微小。将所述收集得到的橙皮素中间体再次采用底物流加法，并加入所述β-葡萄糖苷酶，可以制得所述橙皮素固体产物。本发明第二方面提供的一种橙皮素中间体的制备方法，利用α-l-鼠李糖苷酶，并采用底物流加法实现对橙皮素中间体的制备，该方法工艺简单，产率高，绿色环保；并且α-l-鼠李糖苷酶的专一性好，可以有效较少橙皮素中间体的进一步水解。第三方面，本发明提供了用于制备橙皮素的生物酶，所述生物酶包括α-l-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶，所述α-l-鼠李糖苷酶的基因编码序列包括如seqidno：1所示的核苷酸序列，所述β-葡萄糖苷酶的基因编码序列包括如seqidno：2所示的核苷酸序列。可选地，所述α-l-鼠李糖苷酶的氨基酸序列包括如seqidno：3所示的氨基酸序列。所述β-葡萄糖苷酶的基因编码序列包括如seqidno：4所示的核苷酸序列。其中，所述如seqidno：3所示的氨基酸序列的基因编码序列如seqidno：1所示；可选的，所述α-l-鼠李糖苷酶的氨基酸序列的基因编码序列应该考虑简并碱基，即如seqidno:3所示的氨基酸序列的编码基因包括如seqidno:1所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与seqidno:1具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为seqidno:3。同样的，对于所述β-葡萄糖苷酶，所述如seqidno：4所示的氨基酸序列的编码基因同样应该考虑简并碱基。可选地，所述α-l-鼠李糖苷酶可以高效专一的水解橙皮苷或新橙皮苷并得到橙皮素-7-o-葡萄糖苷。所述β-葡萄糖苷酶可以高效专一的水解橙皮素-7-o-葡萄糖苷得到橙皮素。所述橙皮苷或所述新橙皮苷经α-l-鼠李糖苷酶水解后得到橙皮素-7-o-葡萄糖苷(橙皮素中间体)过程中，并不会水解生成其他中间体产物，所述橙皮素-7-o-葡萄糖苷也不会被所述α-l-鼠李糖苷酶继续分解。本发明所述α-l-鼠李糖苷酶源于链霉菌属，所述α-l-鼠李糖苷酶的基因序列经优化筛选实验获得。本发明所述β-葡萄糖苷酶源于海栖热袍菌属，所述β-葡萄糖苷酶的基因序列经优化筛选实验获得。可选地，所述α-l-鼠李糖苷酶通过大肠杆菌表达生成。所述β-葡萄糖苷酶通过通过大肠杆菌表达生成。所述α-l-鼠李糖苷酶和所述β-葡萄糖苷酶在所述大肠杆菌表达生成的体系中均属于异源表达。本发明优选地大肠杆菌表达系统，简单可行，培养周期短，发酵成本低，蛋白产量高。所述α-l-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶具有很好的生物活性，纯度高，可广泛应用于生物制药、蛋白生产等领域。相比于传统其他发酵体系，本发明优选的α-l-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶具有更高的产率，并且具有更强的生物活性。所述α-l-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶都具有良好的专一性。可选地，所述α-l-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶通过构建重组质粒在大肠杆菌中异源表达；所述重组质粒包括所述α-l-鼠李糖苷酶和/或所述β-葡萄糖苷酶的基因编码序列。进一步地，当所述重组质粒同时包括所述α-l-鼠李糖苷酶和所述β-葡萄糖苷酶的基因编码序列时，所述α-l-鼠李糖苷酶的基因编码序列的5’端前插入rbs序列，所述β-葡萄糖苷酶的基因编码序列的5’端前插入rbs序列。所述rbs序列的核苷酸序列如seqidno：5所示。本发明所述rbs序列为核糖体结合位点(ribosomebindingsite，rbs)序列，可以有效促进两组蛋白基因(α-l-鼠李糖苷酶基因和β-葡萄糖苷酶基因)进行独立的转录及翻译。本发明中，所述重组质粒的载体质粒为pet22b(+)质粒。将所述α-l-鼠李糖苷酶和/或所述β-葡萄糖苷酶的基因编码序列插入至所述pet22b(+)质粒中得到重组质粒，所述重组质粒可以高效、高产的在大肠杆菌中的表达得到α-l-鼠李糖苷酶和/或所述β-葡萄糖苷酶。可选地，所述α-l-鼠李糖苷酶和/或所述β-葡萄糖苷酶的基因编码序列插入pet22b(+)质粒时，所述α-l-鼠李糖苷酶和/或所述β-葡萄糖苷酶的基因编码序列的5’端可加入起始密码子(如atg)，所述α-l-鼠李糖苷酶和/或所述β-葡萄糖苷酶的基因编码序列的3’端可加入终止密码子(如taa)。可选地，所述α-l-鼠李糖苷酶和/或所述β-葡萄糖苷酶的基因编码序列的5’端在加入始密码子之后再插入rbs序列。可选地，所述α-l-鼠李糖苷酶的基因片段的上增设his标签(组氨酸标签)的核苷酸序列，能使表达后的蛋白带上his标签，his标签有利于表达后蛋白的分离纯化，及在实验中的分析和追踪，比如用于免疫印迹实验时的分析。所述his标签可以用于分离所述α-l-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶。本发明还提供了一种重组质粒，所述重组质粒包括α-l-鼠李糖苷酶的基因编码序列和所述β-葡萄糖苷酶的基因编码序列中的一种或两种，所述α-l-鼠李糖苷酶的基因编码序列包括如seqidno：1所示的核苷酸序列，所述β-葡萄糖苷酶的基因编码序列包括如seqidno：2所示的核苷酸序列。本发明还提供了一种重组质粒的制备方法，包括：(1)提供上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物的碱基序列分别如seqidno:6-seqidno:11所示；(2)提供或制备α-l-鼠李糖苷酶和/或β-葡萄糖苷酶基因模板，并以步骤(1)所得上游引物和下游引物为pcr引物，扩增所述α-l-鼠李糖苷酶和/或所述β-葡萄糖苷酶基因片段；(3)取pet22b(+)质粒，将步骤(2)扩增得到的所述α-l-鼠李糖苷酶和/或所述β-葡萄糖苷酶基因片段和所述pet22b(+)质粒利用相同的内切酶分别进行双酶切反应，纯化回收后进行连接，得到所述重组质粒。可选地，所述步骤(3)中，在所述β-葡萄糖苷酶基因片段的5’端前插入rbs序列。可选地，所述步骤(3)中，在所述α-l-鼠李糖苷酶基因片段的5’端前插入rbs序列。可选地，所述步骤(3)中，所示双酶切反应的酶切位点可以为ndei内切酶和xhoi内切酶。本发明的有益效果包括以下几个方面：1、本发明所述的制备方法，采用生物酶法(包括α-l-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶)，并通过采用底物流加法进行反应，底物终浓度可高到达10％，相比于传统工艺提高了5000倍左右；2、本发明所述的制备方法，制备过程中未使用有机试剂，采用生物酶法，高效简便，成本低，绿色环保，可以广泛适用于工业化规模生产；3、由本发明所述的制备方法制备的橙皮素及其中间体，纯度高，可在制药领域或生物医学领域中有广泛的应用；4、本发明利用大肠杆菌异源表达α-l-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶，酶的表达水平高，水解活力好，特异性强，水解产物单一。附图说明图1为本发明一实施例提供的pet22b-bgl04-rha01重组质粒的质粒图谱；图2为本发明一实施例提供的pet22b-rha01重组质粒的质粒图谱；图3为本发明一实施例提供的bgl04-rha01粗酶液的凝胶电泳图；图4为本发明一实施例提供的rha01粗酶液的凝胶电泳图；图5为本发明一实施例提供的橙皮素的高效液相色谱图；图6为本发明一实施例提供的橙皮素-7-o-葡萄糖苷的高效液相色谱图。具体实施方式以下所述是本发明实施例的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。若无特别说明，本发明实施例所采用的原料及其它化学试剂皆为市售商品。(1)构建pet22b-bgl04-rha01、pet22b-rha01重组质粒a)提供上游引物和下游引物，采用pcr扩增实验得到α-l-鼠李糖苷酶(rha01)和β-葡萄糖苷酶(bgl04)的基因编码序列。其中，α-l-鼠李糖苷酶的基因编码序列包括如seqidno：1所示的核苷酸序列，β-葡萄糖苷酶的基因编码序列包括如seqidno：2所示的核苷酸序列。所述α-l-鼠李糖苷酶对应的上游引物的碱基序列如seqidno:6所示，下游引物的碱基序列如seqidno:7所示。所述β-葡萄糖苷酶对应的上游引物的碱基序列如seqidno:8所示，下游引物的碱基序列如seqidno:9所示。在所述rha01和所述bgl04基因的5’端前插入rbs序列，所述rbs序列如seqidno:5所示，并通过上下游引物将其插入至质粒pet22b(+)中并构建pet22b-bgl04-rha01重组质粒。b)提供上游引物和下游引物，采用pcr扩增实验得到α-l-鼠李糖苷酶(rha01)基因编码序列，所述α-l-鼠李糖苷酶的基因编码序列包括如seqidno：1所示的核苷酸序列，所述上游引物的碱基序列如seqidno:10所示，下游引物的碱基序列如seqidno:11所示。通过上下游引物进行将α-l-鼠李糖苷酶的基因插入至质粒pet22b(+)中并构建pet22b-bgl04-rha01重组质粒。通过对应的上游引物和下游引物分别进行pcr扩增体系，配置扩增体系如下：pcr扩增程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s；58℃退火15s；72℃延伸3min；30个循环后，72℃延伸10min。pcr产物经胶回收试剂盒纯化后，分别利用限制性内切酶ndei和ecori、ecori和xhoi进行酶切，酶切后用t4连接酶连接已用ndei和xhoi酶切处理的质粒pet22b(+)。连接产物转入大肠杆菌dh5α，经过氨苄抗性(amp+)的筛选后挑取菌落送测序，测序成功后即得到α-l-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶共表达的重组质粒pet22b-bgl04-rha01和pet22b-rha01。所述重组质粒pet22b-bgl04-rha01的质粒图谱如图1所示；所述重组质粒pet22b-rha01的质粒图谱如图2所示。(2)表达α-l-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶将构建的重组质粒pet22b-rha01、pet22b-bgl04和pet22b-bgl04-rha01中的一种或多种转入大肠杆菌rosetta(de3)中，并以1％的接种量接种至含有10ml的lb培养基(100μg/ml氨苄青霉素(amp))的50ml三角瓶中，维持恒定的37℃，200rpm的摇晃速率，过夜培养后，将菌液以1％的接种量转接到含有1l的lb培养基(100μg/mlamp)的2l三角瓶中，继续37℃恒温培养至培养基中的od600值达到0.6左右，加入终浓度为0.5mm左右的诱导剂iptg，在37℃条件培养10小时后离心收集菌体。将菌体分别用4倍质量的100mm的pbs缓冲液(ph＝6.0)进行重悬并超声破碎20min，得到重组酶粗酶液，包括α-l-鼠李糖苷酶(rha01)粗酶液、β-葡萄糖苷酶(bgl04)粗酶液以及bgl04-rha01粗酶液。其中bgl04-rha01粗酶液中含有α-l-鼠李糖苷酶(rha01)和β-葡萄糖苷酶(bgl04)。将表达获得的α-l-鼠李糖苷酶(rha01)粗酶液、β-葡萄糖苷酶(bgl04)粗酶液和bgl04-rha01粗酶液。分别进行sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)鉴定。图3为所述bgl04-rha01粗酶液的凝胶电泳图，其中泳道marker为分子量标阶梯(thermoscientificpageruler)，泳道bsa为质量浓度为1mg/ml的牛血清白蛋白，泳道a为菌体破胞后bgl04-rha01粗酶液上清液，泳道b为菌体破胞后rha01粗酶液上清液，泳道c为菌体破胞后bgl04粗酶液上清液，rha01的分子量为87kda，其中bgl04的分子量为72kda。图4为所述rha01粗酶液的凝胶电泳图，其中包括marker(thermoscientificpageruler)和bsa泳道，泳道1为菌体破胞后上清液，泳道2为菌体破胞后总蛋白，其中rha01的分子量约为87kda。所述α-l-鼠李糖苷酶(rha01)和β-葡萄糖苷酶(bgl04)的分子大小均于相应蛋白的理论计算值相近。实施例1一种橙皮素的制备方法，包括：将100g橙皮苷悬浮于300ml水中，并加入10mol/l氢氧化钠溶液至所述橙皮苷完全溶解后得到底物配制液。采用底物流加法将所述底物配制液以1ml/min的速度加入至含有α-l-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶共表达的粗酶液(400ml)的磷酸钠缓冲液(300ml,100mm)中进行搅拌反应得到反应液；流加约5h至底物配制液流加完成后继续反应1h，控制反应ph为6.0，温度维持在55℃；在上述反应液中缓慢加入2mol/lhcl，加至ph到5.0搅拌0.5h，过滤得到橙皮素的固体，烘干得到橙皮素的粗品，确保水分不大于5％；将粗品溶解在1000ml的甲醇中，60℃至完全溶解后过滤除去滤饼得滤液，将滤液进行旋蒸至原体积的10％后加入4倍体积的去离子水，搅拌0.5h后，过滤得滤饼，用50ml去离子水冲洗滤饼后，将滤饼在60℃进行干燥得橙皮素的精品，确保水分不大于1％。本实施例中，每隔一定时间取反应液用甲醇稀释50倍，微孔过滤后进样进行液相分析反应结果。液相检测使用月旭xtimatec18，5μm×250×4.6mm为分析柱，取5ml乙酸加入到1000ml的水溶液：乙腈＝70：30，柱温为30℃，检测波长为uv208nm，流速为1.0ml/min。图5是实验过程中检测的橙皮素的高效液相色谱图，实验测得转化率为99.2％。按照本实施例1的实验参数，在底物流加法中的反应温度在45-65℃区间内，选取在反应温度恒定在45℃、50℃、55℃、60℃、65℃时分别进行橙皮素的制备，并计算转化率，得到在不同反应温度下橙皮素的转化率，如表1所示。按照本实施例1的实验参数，调节反应底物橙皮苷的质量浓度，选取在橙皮苷底物的质量浓度在3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％和10％时分别进行橙皮素的制备，并计算转化率，得到在不同橙皮苷底物的质量浓度下橙皮素的转化率，如表2所示。按照本实施例1的实验参数，调节底物流加法中的流加的速度，将所述底物配制液分别在4-9h内流加完成，选取流加时间分别为4h、5h、6h、7h、8h和9h下进行橙皮素的制备，并计算转化率，得到在不同流加时间下的橙皮素的转化率，如表3所示。表1为在不同反应温度下橙皮素的转化率(％)：反应温度(℃)橙皮苷的质量(g)橙皮素的质量(g)转化率(％)4510044.189.15010047.295.35510049.199.26010049.099.06510048.898.5从表1中可以看出，本实施方式中，所述橙皮素的制备方法中在反应温度为45-65℃时，可以高效的水解橙皮苷得到橙皮素，所述橙皮素的转化率≥89％；特别地，当反应温度为55-65℃时，所述橙皮素的转化率≥98％，远远大于传统工艺中的20-50％的转化率。表2为在不同橙皮苷底物的质量浓度下橙皮素的转化率(％)：橙皮苷底物质量浓度(％)橙皮苷的质量(g)橙皮素的质量(g)转化率(％)33014.899.844019.799.555024.699.366029.599.377033.998.088038.396.799044.295.11010044.690.0从表2中可以看出，本实施方式中，所述橙皮素的制备方法中在所述橙皮苷底物的质量浓度在3-10％时，所述橙皮素的转化率≥90％；特别地，当橙皮苷底物的质量浓度在3-7％时，所述橙皮素的转化率≥98％，远远大于传统工艺中的20-50％的转化率。表3为在不同反应温度下橙皮素的转化率(％)：流加时间(h)流加的速度(ml/min)橙皮苷的质量(g)橙皮素的质量(g)转化率(％)31.6710037.175.041.2510045.592.051.0010049.099.160.8310049.199.270.7110049.199.280.6310049.299.490.5610049.299.3从表3中可以看出，本实施方式中，所述橙皮素的制备方法中在底物配制液分别在3-9h内流加完成时，所述橙皮素的转化率≥75％；特别地，当橙皮素的制备方法中在底物配制液分别在4-9h内流加完成时，所述橙皮素的转化率≥92％，远远大于传统工艺中的20-50％的转化率。本发明所述橙皮素的制备方法中，优选地，底物配制液的流加时间为4-6h，这样既保证的时效，又具有较高的转化率。当所述底物配制液的流加时间小于3h，所述橙皮素的转化率将低于50％。实施例2一种橙皮素的制备方法，包括：将100g橙皮苷悬浮于300ml水中，并加入10mol/l氢氧化钠溶液至所述橙皮苷完全溶解后得到底物配制液。采用底物流加法将所述底物配制液以1ml/min的速度加入至含有α-l-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶共表达的粗酶液(400ml)的磷酸钠缓冲液(300ml,100mm)中进行搅拌反应得到反应液；流加约5h至底物配制液流加完成后继续反应1h，控制反应ph为7.0，温度维持在55℃；在上述反应液中缓慢加入2mol/lhcl，加至ph到5.0搅拌0.5h，过滤得到橙皮素的固体，烘干得到橙皮素的粗品，确保水分不大于5％；将粗品溶解在1000ml的甲醇中，60℃至完全溶解后过滤除去滤饼得滤液，将滤液进行旋蒸至原体积的10％后加入4倍体积的去离子水，搅拌0.5h后，过滤得滤饼，用50ml去离子水冲洗滤饼后，将滤饼在60℃进行干燥得橙皮素的精品，确保水分不大于1％。本实施例中，每隔一定时间取反应液用甲醇稀释50倍，微孔过滤后进样进行液相分析反应结果，实验测得转化率为99.1％。实施例3一种橙皮素的制备方法，包括：将100g橙皮苷悬浮于300ml水中，并加入10mol/l氢氧化钠溶液至所述橙皮苷完全溶解后得到底物配制液。采用底物流加法将所述底物配制液以1ml/min的速度加入至含有α-l-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶共表达的粗酶液(400ml)的磷酸钠缓冲液(300ml,100mm)中进行搅拌反应得到反应液；流加约5h至底物配制液流加完成后继续反应1h，控制反应ph为6.5，温度维持在55℃；在上述反应液中缓慢加入2mol/lhcl，加至ph到5.0搅拌0.5h，过滤得到橙皮素的固体，烘干得到橙皮素的粗品，确保水分不大于5％；将粗品溶解在1000ml的甲醇中，60℃至完全溶解后过滤除去滤饼得滤液，将滤液进行旋蒸至原体积的10％后加入4倍体积的去离子水，搅拌0.5h后，过滤得滤饼，用50ml去离子水冲洗滤饼后，将滤饼在60℃进行干燥得橙皮素的精品，确保水分不大于1％。本实施例中，每隔一定时间取反应液用甲醇稀释50倍，微孔过滤后进样进行液相分析反应结果，实验测得转化率为99.4％。实施例4一种橙皮素的制备方法，包括：将100g新橙皮苷悬浮于300ml水中，并加入10mol/l氢氧化钠溶液至新橙皮苷完全溶解后得到底物配制液。采用底物流加法将所述底物配制液以1ml/min的速度加入至含有α-l-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶共表达的粗酶液(400ml)的磷酸钠缓冲液(300ml,)中进行搅拌反应得到反应液；流加约5h至底物配制液流加完成后继续反应1h，控制反应ph为6.5，温度维持在55℃；在上述反应液中缓慢加入4mol/lhcl，加至ph到3.0搅拌0.5h，过滤得到橙皮素的固体，烘干得到橙皮素的粗品，确保水分不大于5％；将粗品溶解在1000ml的甲醇中，60℃至完全溶解后过滤除去滤饼得滤液，将滤液进行旋蒸至原体积的10％后加入4倍体积的去离子水，搅拌0.5h后，过滤得滤饼，用50ml去离子水冲洗滤饼后，将滤饼在60℃进行干燥得橙皮素的精品，确保水分不大于1％。本实施例中，每隔一定时间取反应液用甲醇稀释50倍，微孔过滤后进样进行液相分析反应结果，实验测得转化率为99.0％。实施例5一种橙皮素中间体的制备方法，包括：将100g橙皮苷悬浮于300ml水中，并加入10mol/l氢氧化钠溶液至所述橙皮苷完全溶解后得到底物配制液；采用底物流加法将所述底物配制液以1ml/min的速度加入至含有α-l-鼠李糖苷酶粗酶液(300ml)的磷酸钠缓冲液(300ml,100mm)中进行搅拌反应，流加完成后继续反应4h，控制反应ph为6.5，温度维持在55℃；将上述反应液进行过滤，滤饼通过0.5倍体积的去离子水冲洗，取滤饼50℃烘干得到橙皮素中间体的粗品。将粗品溶解在100ml的80％的丙酮中，30℃搅拌至完全溶解后过滤得滤液，将滤液进行真空浓缩至原体积的10％后加入4倍体积的去离子水，有固体析出。过滤得滤饼，用少量去离子水冲洗滤饼后，将滤饼进行干燥得到橙皮素中间体精品。本实施例中，每隔一定时间取反应液用甲醇稀释50倍，微孔过滤后进样进行液相分析反应结果，实验测得转化率为99.2％。对比例1一种橙皮素的制备方法，包括：在磷酸钠缓冲液(600ml,100mm)中加入100g橙皮苷、并加入至含有α-l-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶共表达的粗酶液(400ml)进行搅拌反应6h得到反应液；控制反应ph为6.0，温度维持在55℃；在上述反应液中缓慢加入2mol/lhcl，加至ph到5.0搅拌0.5h，过滤得到橙皮素的固体，烘干得到橙皮素的粗品，确保水分不大于5％；将粗品溶解在1000ml的甲醇中，60℃至完全溶解后过滤除去滤饼得滤液，将滤液进行旋蒸至原体积的10％后加入4倍体积的去离子水，搅拌0.5h后，过滤得滤饼，用50ml去离子水冲洗滤饼后，将滤饼在60℃进行干燥得橙皮素的精品，本实施例中，每隔一定时间取反应液用甲醇稀释50倍，微孔过滤后进样进行液相分析反应结果，实验测得反应的转化率为10％。对比例2一种橙皮素的制备方法，包括：将100g橙皮苷悬浮于300ml水中，并加入10mol/l氢氧化钠溶液至所述橙皮苷完全溶解后得到底物配制液。采用底物流加法将所述底物配制液以1ml/min的速度加入至含有α-l-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶共表达的粗酶液(400ml)的磷酸钠缓冲液(300ml)中进行搅拌反应得到反应液；流加约5h至底物配制液流加完成后继续反应1h，控制反应ph为6.0，温度维持在30℃；在上述反应液中缓慢加入2mol/lhcl，加至ph到5.0搅拌0.5h，过滤得到橙皮素的固体，烘干得到橙皮素的粗品，确保水分不大于5％；将粗品溶解在1000ml的甲醇中，60℃至完全溶解后过滤除去滤饼得滤液，将滤液进行旋蒸至原体积的10％后加入4倍体积的去离子水，搅拌0.5h后，过滤得滤饼，用50ml去离子水冲洗滤饼后，将滤饼在60℃进行干燥得橙皮素的精品；实验测得橙皮素的转化率为58％。对比例3一种橙皮素的制备方法，包括：将100g橙皮苷悬浮于300ml水中，并加入10mol/l氢氧化钠溶液至所述橙皮苷完全溶解后得到底物配制液。采用底物流加法将所述底物配制液以1ml/min的速度加入至含有α-l-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶共表达的粗酶液(400ml)的磷酸钠缓冲液(300ml)中进行搅拌反应得到反应液；流加约5h至底物配制液流加完成后继续反应1h，控制反应ph为9.0，温度维持在55℃；在上述反应液中缓慢加入2mol/lhcl，加至ph到5.0搅拌0.5h，过滤得到橙皮素的固体，烘干得到橙皮素的粗品，确保水分不大于5％；将粗品溶解在1000ml的甲醇中，60℃至完全溶解后过滤除去滤饼得滤液，将滤液进行旋蒸至原体积的10％后加入4倍体积的去离子水，搅拌0.5h后，过滤得滤饼，用50ml去离子水冲洗滤饼后，将滤饼在60℃进行干燥得橙皮素的精品，实验测得橙皮素的转化率为30％。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。序列表<110>邦泰生物工程（深圳）有限公司江西邦泰绿色生物合成生态产业园发展有限公司<120>一种橙皮素的制备方法、橙皮素中间体的制备方法和用于制备橙皮素的生物酶<150>pct/cn2018/084377<151>2018-04-25<160>11<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>2610<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gcgctgagcatcagccaagttgcgtttgagcaccaccgtaccgcgctgggtattggcgaa60acccagccgcgtgtgagctggcgttttgacggtaacgttagcgattgggagcaacgtgcg120tacgagatcgaagtgaagcgtgcgggccacgacgcggatgttttccgtagcgaaagcagc180gacagcgtgctggtgccgtggccgagcagcccgctgcagagcggcgaggaagcgaccgtg240cgtgttcgtagctttggtagcgacggccaacacgataccccgtggagcgatgcggtgacc300gttgaaccgggtctgctgaccccggatgattggcacgatgcggtggttattgcgagcgat360cgtccgaccgaggtggatgcgacccaccgtccgattcagttccgtaaagaatttagcgtg420gacgatagctacgttagcgcgcgtctgtatatcaccgcgctgggtctgtacgaagcgcgt480attaacgaccaacgtgtgggtgatcacgttatggcgccgggctggcagagctaccaatat540cgtcacgagtacaacacctatgacgttaccgatctgctgaagcagggtccgaacgcgatc600ggcgtgaccgttggtgaaggctggtacagcggtcgtatcggctatgacggtggcaaacgt660aacatttacggtgataccctgggcctgctgagcctgctggttgtgaccaagagcgacggt720agcaaactgtatatcccgagcgatagcagctggaagagcagcaccggtccgatcattagc780agcgagatttacgacggcgaggaatatgatagccgtctggaacagaagggttggagccaa840gtgggcttcaacagcaccggttggctgggcacccacgaactgagctttccgaaagagcgt900ctggcgagcccggatggtccgccggtgcgtcgtgttgcggagcacaagctggcgaacgtg960ttcagcagcgcgagcggcaaaaccgttctggattttggtcagaacctggtgggctggctg1020cgtatccgtgttaagggtccgaaaggccaaaccattcgtttcgtgcacaccgaggttatg1080gaaaacggtgaggtggcgacccgtccgctgcgtcaggcgaaggcgaccgaccactttacc1140ctgagcggcgagggcgttcaagagtgggaaccgagcttcacctaccacggttttcgttat1200gttcaagttgatggttggccggcggacaccccgctggatgaaaacagcgttaccgcgatc1260gtggttcacagcgatatggaacgtaccggttacttcgagtgcagcaacccgctgatcagc1320aaactgcacgagaacattctgtggagcatgcgtggcaacttctttagcattccgaccgac1380tgcccgcaacgtgatgaacgtctgggttggaccggcgacatccacgcgttcagccgtacc1440gcgaactttatttatgacaccgcgggtttcctgcgtgcgtggctgaaggatgcgcgtagc1500gagcagctgaaccacagctacagcctgccgtatgtgatcccgaacattcacggtaacggc1560gagaccccgaccagcatctggggtgacgcgattgtgggcgttccgtggcagctgtacgaa1620agcttcggtgataaagtgatgctggaggaacaatatggtggcgcgaaggactgggttgat1680aaaggtatcgtgcgtaacgacgttggcctgtgggatcgtagcacctttcagtgggcggac1740tggctggatccgaaggcgccggcggatgatccgggtcaagcgaccaccaacaaatacctg1800gttagcgacgcgtatctgctgcacagcaccgatatgctggcgaacatcagcaccagcctg1860agcaagggcgaggaagcgagcaactacaccgaatggcacgcgaagctgaccaaagagttc1920caaaaagcgtggattaccagcaacggtaccatggcgaacgagacccagaccggtctggcg1980ctgccgctgtactttgacctgtttccgagcgcggaacaggcgcaaagcgcggcgaagcgt2040ctggtgaacatcatcaagcagaacgattacaaggttggtaccggttttgcgggtacccac2100ctgctgggtcacaccctgagcaaatacggcgagagcgacgcgttttatagcatgctgcgt2160cagaccgaagtgccgagctggctgtaccaagtggttatgaacggcaccaccacctgggag2220cgttgggatagcatgctgccgaacggtagcatcaacccgggccagatgaccagcttcaac2280cactatgcggtgggtagcgttggcagctggctgcacgaagtgattggtggcctgagcccg2340gcggagccgggttggcgtcgtatcaacattgaagtggttccgggtggcgacctgcagcaa2400gcgagcaccaagtttctgaccccgtacggtatggcgagcaccaaatggtggctggacggc2460caggatcaaagctgcggtggcttcgactttcacctggtggcggaagttccgccgaacacc2520cgtgcgaccgtggttctgccgggcaagggtggcgagaaagtggatgttggtagcggcgtt2580cacgaatatcacgtgcgttgcgttaaactg2610<210>2<211>2163<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2atgggcaagatcgacgagattctgagccagctgaccatcgaggaaaaggtgaaactggtg60gttggtgttggtctgccgggtctgtttggtaacccgcacagccgtgt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