抗EPHA2抗体和使用该抗EPHA2抗体的EPHA2免疫检测的制作方法

本发明涉及一种新型抗体、该抗体的功能片段、该抗体的修饰物、含有编码该抗体所具有的氨基酸序列的碱基序列的核苷酸、插入有该核苷酸的载体、导入有该核苷酸或载体的细胞、包括培养该细胞的步骤的该抗体的制造方法、药物组合物、用于诊断或用于检查的组合物等。

背景技术：

epha2是分子量为130kda且具有一次跨膜结构的受体型酪氨酸激酶(非专利文献1)。在epha2的n末端侧的胞外结构域，存在配体结合区域和两处iii型纤连蛋白结构域；在c末端侧的胞内结构域，存在酪氨酸激酶结构域和不育-α-基序(sterileα-motif,sam)结构域。

作为epha2的配体，已知有gpi锚定蛋白ephrin-a1～a5(非专利文献2)。通过配体结合引起的epha2的酪氨酸激酶结构域的活化，使存在于epha2的胞内结构域的酪氨酸残基发生自我磷酸化，诱导细胞内信号的传递。此外，还报告了与配体结合后，epha2通过内吞作用被摄入到细胞内，最终被蛋白酶体降解(非专利文献3)。

有报告称，epha2在临床上在多种癌，尤其是乳腺癌、食道癌、前列腺癌、胃癌、非小细胞肺癌、大肠癌、多形性胶质母细胞瘤中高表达(非专利文献4、5、6、7、8、9、10、11)。而且，有报告称，在食道癌中，观察到epha2表达与局部淋巴结转移、淋巴结转移数量和癌分化程度的低程度之间存在显著相关，epha2阳性患者的存活率低于epha2阴性患者(非专利文献5)。有报告称，在非小细胞肺癌中，与无病生存期间高于5年的患者相比，低于5年的患者的epha2表达水平高；与未复发患者相比，复发患者的epha2表达水平高；与未复发患者或转移局限于对侧的肺的患者相比，向脑转移发展患者的epha2表达水平高(非专利文献9)。有报告称，在大肠癌中，epha2表达水平也明显与肝转移、淋巴管浸润和临床分期有关(非专利文献10)。

另外，有报告称，将epha2基因导入到细胞，使非癌细胞获得锚定非依赖性生长能力和在细胞外基质上的管状形态形成能力、体内的肿瘤增殖能力等癌性状(非专利文献4)；癌细胞对细胞外基质的浸润性增强(非专利文献12、13)。与此相反，有报告称，如果用sirna抑制epha2的表达，则癌细胞的浸润性和锚定非依赖性生长、体内的肿瘤增殖受到抑制(非专利文献13、14)；以及使用配体ephrin-a1和人igg的fc区域的融合蛋白使epha2活化，诱导内吞作用引起的epha2降解，由此，癌细胞的浸润性和锚定非依赖性生长、管状形态形成能力受到抑制(非专利文献4、11、12)。

另一方面，有报告称，epha2不仅在癌细胞中表达，也在肿瘤内或肿瘤周围的血管中表达(非专利文献15)。有报告称，在小鼠中，epha2信号参与由ephrin-a1诱导的血管新生，尤其是在血管内皮细胞表达的epha2是血管内皮细胞的管腔形成和存活所必需的(非专利文献16)；还有报告称，epha2的胞外结构域和人igg的fc区域的融合蛋白在体内抑制血管新生，显示出抗肿瘤效果(非专利文献17)。

最近有报告称，膜型基质金属蛋白酶-1(mt1-mmp)在胞外结构域将epha2切断，结果是残留在膜上的epah2片段有助于原癌信号(非专利文献18、19)。

还有报告称，与健康者相比，肺癌、前列腺癌患者的可溶性epha2在血清中的浓度高(非专利文献20、21)。

根据上述内容，提示epha2有可能成为针对癌症的优异治疗靶点，实际上以epha2为靶点的药物的临床试验也正在实施(专利文献1～3)。

由上述可知，提供能够一种检测epha2表达的方法，对于癌症等与epha2相关的疾病、epha2表达的检查或诊断十分有效。作为来自受试者的样品中的epha2的测定方法，有免疫测定法，其中，elisa(enzyme-linkedimmunosorbentassay：酶联免疫吸附测定)法作为简便且快速的测定方法而被广泛使用。到目前，报告了使用抗epha2抗体测定待测样品中所含的epha2的方法(elisa法)(专利文献4、5、非专利文献20～27)，但是仅使用抗epha2单克隆抗体的方法尚未建立。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公布wo2003/094859号

专利文献2：国际公布wo2006/084226号

专利文献3：国际公布wo2009/028639号

专利文献4：国际公布wo2009/085805号

专利文献5：国际公布wo2014/126160号

非专利文献

非专利文献1：mocecularandcellularbiology,1990年,第10卷,p.6316-6324

非专利文献2：annualreviewofneuroscience,1998年,第21卷,p.309-345

非专利文献3：molecularcancerresearch,2002年,第1卷,p.79-87

非专利文献4：cancerresearch,2001年,第61卷,p.2301-2306

非专利文献5：internationaljournalofcancer,2003年,第103卷,p.657-663

非专利文献6：theprostate,1999年,第41卷,p.275-280

非专利文献7：americanjournalofpathology,2003年,第163卷,p.2271-2276

非专利文献8：cancerscience,2005年,第96卷,p.42-47

非专利文献9：clinicalcancerresearch,2003年,第9卷,p.613-618

非专利文献10：oncologyreports,2004年,第11卷,p.605-611

非专利文献11：molecularcancerresearch,2005年,第3卷,p.541-551

非专利文献12：biochemicalandbiophysicalresearchcommunications,2004年,第320卷,p.1096-1102

非专利文献13：oncogene,2004年,第23卷,p.1448-1456

非专利文献14：cancerresearch,2002年,第62卷,p.2840-2847

非专利文献15：oncogene,2000年,第19卷,p.6043-6052

非专利文献16：journalofcellscience,2004年,第117卷,p.2037-2049

非专利文献17：oncogene,2002年,第21卷,p.7011-7026

非专利文献18：thejournalofcellbiology,2013年,第201卷,p.467-484

非专利文献19：cancerresearch,2015年,第75卷,p.3327-3339

非专利文献20：proceedings：aacr106thannualmeeting2015；april18-22,2015；philadelphia,pacancerresearch2015；75(15suppl)：abstractnr546.

非专利文献21：第74届日本癌症学会学术总会p15-8p-3321

非专利文献22：raybiotech,humanepha2elisa(elh-epha2-1),<url:http://www.raybiotech.com/epha2-elisa.html>

非专利文献23：cusabio,humanephrintype-areceptor2(epha2)elisakit(csb-el007722hu),<http://www.cusabio.com/elisa-kit/human-ephrin-type-a-receptor-2epha2-elisa-kit-76651.html>

非专利文献24：lsbio,humanepha2/ephreceptora2elisakit(sandwichelisa)(ls-f23977),<https：//www.lsbio.com/elisakits/human-epha2-eph-receptor-a2-elisa-kit-sandwich-elisa-ls-f23977/23977？trid＝119>

非专利文献25：abnova,epha2(human)matchedantibodypair(h00001969-ap21),<http://www.abnova.com/products/products_detail.asp？catalog_id＝h00001969-ap21>

非专利文献26：abnova,epha2(human)matchedantibodypair(h00001969-ap11),<http://www.abnova.com/products/products_detail.asp？catalog_id＝h00001969-ap11>

非专利文献27：abnova、epha2(human)matchedantibodypair(h00001969-ap51)、<http://www.abnova.com/products/products_detail.asp？catalog_id＝h00001969-ap51>

技术实现要素：

发明所要解决的问题

本发明的一个要解决的问题是提供一种epha2特异性抗体。

本发明的另一个要解决的问题是提供一种含有抗epha2抗体的免疫诊断用组合物，以及用于该免疫诊断用组合物的抗epha2抗体或其组合。

另外，本发明的又一个要解决的问题是提供一种使用抗epha2抗体或其组合检测epha2的方法，以及含有该抗体或其组合的检测用或诊断用试剂盒。

解决问题的技术方案

为了简便且高灵敏度地测定epha2并提高癌症诊断的精度，本发明人制作了多种抗epha2单克隆抗体用于根据利用夹心免疫测定法测定epha2，选择特别适于夹心免疫测定法的单克隆抗体，确定重链可变区、轻链可变区的氨基酸序列和碱基序列，而且分析了6个cdr序列。

通过使用本发明人所开发的两种抗体，确认到能够以高灵敏度测定生物样品中的epha2，也能够以高灵敏度且高特异性实现癌症的检测，从而完成了本发明。

即，本发明如下所述：

[1]一种特异性结合epha2的单克隆抗体，或者特异性结合epha2的所述单克隆抗体的功能性片段，含有：

(a)由seqidno:29所示的氨基酸序列组成的重链cdrh1；

(b)由seqidno:30所示的氨基酸序列组成的重链cdrh2；

(c)由seqidno:31所示的氨基酸序列组成的重链cdrh3；

(d)由seqidno:32所示的氨基酸序列组成的轻链cdrl1；

(e)由seqidno:33所示的氨基酸序列组成的轻链cdrl2；以及

(f)由seqidno:34所示的氨基酸序列组成的轻链cdrl3。

[2]一种特异性结合epha2的单克隆抗体，或者特异性结合epha2的所述单克隆抗体的功能性片段，含有由seqidno:20所示的氨基酸序列组成的重链可变区和由seqidno:22所示的轻链可变区。

[3]一种特异性结合epha2的单克隆抗体，或者特异性结合epha2的所述单克隆抗的体功能性片段，含有如下所示的重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区由与seqidno:20所示的氨基酸序列具有95％以上序列同一性的氨基酸序列组成，且具有结合人epha2的活性；所述轻链可变区由与seqidno:22所示的氨基酸序列具有95％以上序列同一性的氨基酸序列组成，且具有结合人epha2的活性。

[4]一种特异性结合epha2的单克隆抗体，或者特异性结合epha2的所述单克隆抗体的功能性片段，含有：

(a)由seqidno:23所示的氨基酸序列组成的重链cdrh1；

(b)由seqidno:24所示的氨基酸序列组成的重链cdrh2；

(c)由seqidno:25所示的氨基酸序列组成的重链cdrh3；

(d)由seqidno:26所示的氨基酸序列组成的轻链cdrl1；

(e)由seqidno:27所示的氨基酸序列组成的轻链cdrl2；以及

(f)由seqidno:28所示的氨基酸序列组成的轻链cdrl3。

[5]一种特异性结合epha2的单克隆抗体，或者特异性结合epha2的所述单克隆抗体的功能性片段，其含有由seqidno:15所示的氨基酸序列组成的重链可变区和由seqidno:18所示的轻链可变区。

[6]一种特异性结合epha2的单克隆抗体，或者特异性结合epha2的所述单克隆抗体的功能性片段，含有如下所示的重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区由与seqidno:15所示的氨基酸序列具有95％以上序列同一性的氨基酸序列组成，且具有结合人epha2的活性；所述轻链可变区由与seqidno:18所示的氨基酸序列具有95％以上序列同一性的氨基酸序列组成，且具有结合人epha2的活性。

[7]两种单克隆抗体的组合，其中，所述两种单克隆抗体分别为[1]～[3]中任一项所述的特异性结合epha2的单克隆抗体或者特异性结合epha2的所述单克隆抗体的功能性片段，以及[4]～[6]中任一项所述的特异性结合epha2的单克隆抗体，或者特异性结合epha2的所述单克隆抗体的功能性片段。

[8]根据[7]所述的组合，所述组合用于生物样品中的epha2的检测或测定方法。

[9]一种利用免疫测定法特异性检测生物样品中所含的epha2的方法，使用[1]～[6]中任一项所述的特异性结合epha2的单克隆抗体，或者特异性结合epha2的所述单克隆抗体的功能性片段。

[10]一种利用夹心免疫测定法特异性检测生物样品中所含的epha2的方法，使用以下两种单克隆抗体，所述两种单克隆抗体分别为[1]～[3]中任一项所述的特异性结合epha2的单克隆抗体或者特异性结合epha2的所述单克隆抗体的功能性片段，以及[4]～[6]中任一项所述的特异性结合epha2的单克隆抗体或者特异性结合epha2的所述单克隆抗体的功能性片段。

[11]根据[10]所述的方法，其中，所述夹心免疫测定法为elisa。

[12]一种癌症检测方法，其使用[1]～[6]中任一项所述的特异性结合epha2的单克隆抗体，或者特异性结合epha2的所述单克隆抗体的功能性片段，并利用免疫测定法测定受试对象血液中的epha2浓度，当受试对象血液中的所述epha2浓度高于健康者血液中的epha2浓度时，则评价为受试对象患有癌症。

[13]一种癌症检测方法，其使用[1]～[3]中任一项所述的特异性结合epha2的单克隆抗体或者特异性结合epha2的所述单克隆抗体的功能性片段，以及[4]～[6]中任一项所述的特异性结合epha2的单克隆抗体或者特异性结合epha2的所述单克隆抗体的功能性片段这两种单克隆抗体，并利用夹心免疫测定法测定受试对象血液中的epha2浓度，当受试对象血液中的epha2浓度高于健康者血液中的epha2浓度时，则评价为受试对象患有癌症。

[14]根据[13]所述的方法，其中，所述夹心免疫测定法为elisa。

[15]根据[12]～[14]中任一项所述的方法，其中，所述癌症选自于由以下癌症组成的组：胃癌、卵巢癌、乳腺癌、食道癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、大肠癌、胰腺癌、肝癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫体癌、肾癌、脑肿瘤、恶性黑色素瘤和头颈癌。

[16]一种用于测定epha2的试剂盒，含有以下两种单克隆抗体或功能性片段，所述两种单克隆抗体或功能性片段分别为[1]～[3]中任一项所述的特异性结合epha2的单克隆抗体或者特异性结合epha2的所述单克隆抗体的功能性片段，以及[4]～[6]中任一项所述的特异性结合epha2的单克隆抗体或者特异性结合epha2的所述单克隆抗体的功能性片段。

[17]一种用于检测癌症的试剂盒，含有以下两种单克隆抗体或功能性片段，所述两种单克隆抗体或功能性片段分别为[1]～[3]中任一项所述的特异性结合epha2的单克隆抗体或者特异性结合epha2的所述单克隆抗体的功能性片段，以及[4]～[6]中任一项所述的特异性结合epha2的单克隆抗体或者特异性结合epha2的所述单克隆抗体的功能性片段。

[18]根据[17]所述的试剂盒，其中，所述癌症选自于由以下癌症组成的组：胃癌、卵巢癌、乳腺癌、食道癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、大肠癌、胰腺癌、肝癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫体癌、肾癌、脑肿瘤、恶性黑色素瘤和头颈癌。

本说明书包含了作为本申请的优先权基础的日本专利申请号2017-009349号的公开内容。

发明效果

本发明人制作的多种抗epha2单克隆抗体中，与使用其他单克隆抗体时相比，当组合使用57-1抗体和230-1抗体作为固相抗体和检测抗体时，能够以高灵敏度检测生物样品中的epha2。而且，当通过组合使用上述两种单克隆抗体的夹心免疫测定法测定epha2并检测癌症时，能够以高灵敏度且高特异性地检测癌症。

另外，与使用其他单克隆抗体时相比，通过使用了57-1抗体或230-1抗体的免疫测定法，能够以高灵敏度检测生物样品中的epha2。而且，当通过使用了上述单克隆抗体的免疫测定法测定epha2并检测癌症时，能够以高灵敏度且高特异性地检测癌症。

附图说明

图1是表示实施例2)-1的13种抗epha2单克隆抗体(shm41、57-1、80-21、83-21、113-1、119-1、131-1、141-21、148-1、151-4、230-1、240-4、245-21)对epha2的反应性的图。

图2是表示实施例2)-2中使用抗epha2单克隆抗体230-1作为生物素标记的抗体，使用11种抗epha2单克隆抗体57-1、80-21、83-21、113-1、119-1、131-1、141-21、148-1、151-4、240-4、245-21作为捕获抗体时的反应性的图。

图3是表示实施例2)-3中使用shm41、57-1或230-1作为捕获抗体，使用生物素标记的57-1或230-1作为检测抗体时的反应性的图。

图4是表示实施例2)-4的elisa系统(捕获抗体230-1和检测抗体生物素标记的57-1、捕获抗体57-1和检测抗体生物素标记的230-1)对epha2的反应性的图。

图5是表示实施例2)-5的elisa系统(捕获抗体230-1和检测抗体生物素标记的57-1)的标准曲线的图。

图6是表示实施例2)-6的elisa系统(捕获抗体230-1、检测抗体生物素标记的57-1)的epha2特异性的图。

图7-1是使用elisa系统(捕获抗体230-1、检测抗体生物素标记的57-1)测定健康者、胃癌和卵巢癌患者的血清中的epha2浓度的图。

图7-2是使用elisa系统(捕获抗体230-1、检测抗体生物素标记的57-1)测定健康者和非小细胞肺癌患者的血清中的epha2浓度的图。

图8是表示对小鼠抗epha2单克隆抗体57-1的重链可变区进行编码的cdna核苷酸序列(seqidno:14)的图。

图9是表示小鼠抗epha2单克隆抗体57-1重链可变区的氨基酸序列(seqidno:15)的图。

图10是表示对小鼠抗epha2单克隆抗体57-1的轻链可变区进行编码的cdna核苷酸序列(seqidno:17)的图。

图11是表示小鼠抗epha2单克隆抗体57-1轻链可变区的氨基酸序列(seqidno:18)的图。

图12是表示对小鼠抗epha2单克隆抗体230-1的重链可变区进行编码的cdna核苷酸序列(seqidno:19)的图。

图13是表示小鼠抗epha2单克隆抗体230-1重链可变区的氨基酸序列(seqidno:20)的图。

图14是表示对小鼠抗epha2单克隆抗体230-1的轻链可变区进行编码的cdna核苷酸序列(seqidno:21)的图。

图15是表示小鼠抗epha2单克隆抗体230-1轻链可变区的氨基酸序列(seqidno:22)的图。

图16是表示小鼠抗epha2单克隆抗体57-1所具有的cdr的氨基酸序列(seqidno:23～seqidno:28)的图。

图17是表示小鼠抗epha2单克隆抗体230-1所具有的cdr的氨基酸序列(seqidno:29～seqidno:34)的图。

具体实施方式

下面详细地说明本发明。

本发明是利用免疫测定方法对受试对象生物样品中的epha2进行测定的方法，以及用于测定的试剂或试剂盒，其中，所述免疫测定方法使用了特异性结合epha2的特定单克隆抗体。

另外，本发明是利用夹心免疫测定方法对受试对象生物样品中的epha2进行测定的方法，以及用于测定的试剂或试剂盒，其中，所述夹心免疫测定方法使用了特异性结合epha2的特定的两种单克隆抗体。

另外，本发明是适于利用夹心免疫测定方法测定epha2的抗epha2单克隆抗体，以及两种抗epha2单克隆抗体的组合。

而且，本发明是利用免疫测定方法测定受试对象生物样品中(优选为血液中)的epha2，并以生物样品中(优选为血液中)的epha2浓度为指标，检测受试对象是否患有癌症的方法，以及以生物样品中(优选为血液中)的epha2浓度为指标，用于检测受试对象是否患有癌症的试剂或试剂盒，其中，所述免疫测定方法使用了特定的抗epha2单克隆抗体。本发明的方法也是利用免疫测定方法测定受试对象生物样品中(优选为血液中)的epha2，并以生物样品中(优选为血液中)的epha2浓度为指标，获得用于判定受试对象是否患有癌症的辅助数据的方法，其中，所述免疫测定方法使用了特定的抗epha2单克隆抗体。

而且，本发明是利用夹心免疫测定方法测定受试对象生物样品中(优选为血液中)的epha2，并以生物样品中(优选为血液中)的epha2浓度为指标，检测受试对象是否患有癌症的方法，以及以生物样品中(优选为血液中)的epha2浓度为指标，用于检测受试对象是否患有癌症的试剂或试剂盒，其中，所述夹心免疫测定方法使用了特定的两种抗epha2单克隆抗体。本发明的方法也是利用夹心免疫测定方法测定受试对象生物样品中(优选为血液中)的epha2，并以生物样品中(优选为血液中)的epha2浓度为指标，获得用于判定受试对象是否患有癌症的辅助数据的方法，其中，所述夹心免疫测定方法使用了特定的两种抗epha2单克隆抗体。

作为生物样品，使用血液(全血、血清或血浆)、淋巴液、尿、组织匀浆、细胞培养上清液或细胞裂解液。优选可以使用血液，更优选可以使用血清。

关于本发明所使用的单克隆抗体，可以将epha2或其片段作为免疫原，对马、猴、狗、猪、牛、山羊、绵羊、兔、大鼠、豚鼠、仓鼠、小鼠等哺乳动物进行免疫，将脾细胞等和骨髓瘤融合，制作杂交瘤，作为杂交瘤产生分泌的抗体而得到。杂交瘤可以通过公知方法制作。

作为免疫原的epha2也可以根据序列信息进行化学合成，还可以根据编码蛋白质的dna序列信息，通过公知方法作为重组蛋白而得到。

筛选抗体可以通过任意方法进行，优选能够通过细胞elisa(cell-elisa)进行筛选，其中细胞elisa使用了利用编码epha2的dna进行转染的动物细胞。epha2的碱基序列如seqidno:5所示，氨基酸序列如seqidno:6所示。而且，可以通过流式细胞仪分析等确认所选择的抗体是否特异性结合epha2。

本发明的方法所使用的单克隆抗体是抗体230-1和抗体57-1中的任一种或两种。抗体230-1是制作的13种单克隆抗体中与epha2的反应性最高的单克隆抗体，抗体57-1是最适合与抗体230-1组合并利用夹心免疫测定方法测定epha2的抗体。

编码抗体57-1重链可变区的cdna序列如seqidno:14(图8)所示，抗体57-1重链可变区的氨基酸序列如seqidno:15(图9)所示。此外，编码抗体57-1轻链可变区的cdna序列如seqidno:17(图10)所示，抗体57-1轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:18(图11)所示。

即，本发明的抗epha2抗体是结合人epha2的抗人epha2单克隆抗体，其含有由seqidno:15所示的氨基酸序列组成的重链可变区和由seqidno:18所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。

另外，当使用blast(basiclocalalignmentsearchtoolatthenationalcenterforbiologicalinformation：美国国家生物技术信息中心的基本局部比对搜索工具)等(例如默认即初始设置的参数)进行计算时，是由与上述由seqidno:14或seqidno:17所示的序列组成的碱基序列至少具有85％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选97％以上、98％以上或99％以上的序列同一性的碱基序列组成的dna，且编码具有抗体重链可变区或轻链可变区的活性即具有结合人epha2活性的蛋白质的dna，也包括在编码本发明抗体的重链可变区或轻链可变区的dna中。

另外，能够与由与上述由seqidno:14或seqidno:17所示的序列组成的dna互补的序列组成的dna在严格条件下杂交的dna，且编码具有抗体重链可变区或轻链可变区的活性即具有结合人epha2活性的蛋白质的dna，也包括在编码本发明的重链可变区或轻链可变区的dna中。

另外，上述重链可变区或轻链可变区不仅包括由seqidno:15或seqidno:18所示的氨基酸序列组成的重链可变区或轻链可变区，还包括由在该氨基酸序列中缺失、置换、增添1个或数个，例如1～10个、优选1～5个、更优选1个或2个、进一步优选1个氨基酸而形成的氨基酸序列组成，且由具有抗体重链可变区或轻链可变区的活性即具有结合人epha2活性的蛋白质组成的重链可变区或轻链可变区。

作为这种在seqidno:15或seqidno:18所示的氨基酸序列中缺失、置换或增添1个或数个氨基酸而形成的氨基酸序列，可举出：当使用blast(basiclocalalignmentsearchtoolatthenationalcenterforbiologicalinformation：美国国家生物技术信息中心的基本局部比对搜索工具)等(例如默认即初始设置的参数)进行计算时，是与seqidno:15或seqidno:18所示的氨基酸序列至少具有85％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选97％以上、98％以上或99％以上的序列同一性的氨基酸序列。

具有这种在seqidno:15或seqidno:18所示的氨基酸序列中缺失、置换或增添1个或数个氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白质，与具有seqidno:15或seqidno:18所示的氨基酸序列的蛋白质实质上相同。

编码抗体230-1重链可变区的cdna序列如seqidno:19(图12)所示，抗体230-1重链可变区的氨基酸序列如seqidno:20(图13)所示。此外，编码抗体230-1轻链可变区的cdna序列如seqidno:21(图14)所示，抗体230-1轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:22(图15)所示。

即，本发明的抗epha2抗体是结合人epha2的抗人epha2单克隆抗体，其含有由seqidno:20所示的氨基酸序列组成的重链可变区和由seqidno:22所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。

另外，当使用blast(basiclocalalignmentsearchtoolatthenationalcenterforbiologicalinformation：美国国家生物技术信息中心的基本局部比对搜索工具)等(例如默认即初始设置的参数)进行计算时，是由与上述由seqidno:19或seqidno:21所示的序列组成的碱基序列至少具有85％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选97％以上、98％以上或99％以上的序列同一性的碱基序列组成的dna，且编码具有抗体重链可变区或轻链可变区的活性即具有结合人epha2活性的蛋白质的dna，也包括在编码本发明抗体的重链可变区或轻链可变区的dna中。

另外，能够与由与上述由seqidno:19或seqidno:21所示的序列组成的dna互补的序列组成的dna在严格条件下杂交的dna，且编码具有抗体重链可变区或轻链可变区的活性即具有结合人epha2活性的蛋白质的dna，也包括在编码本发明的重链可变区或轻链可变区的dna中。

另外，上述重链可变区或轻链可变区不仅包括由seqidno:20或seqidno:22所示的氨基酸序列组成的重链可变区或轻链可变区，还包括由在该氨基酸序列中缺失、置换、增添1个或数个，例如1～10个、优选1～5个、更优选1个或2个、进一步优选1个氨基酸而形成的氨基酸序列组成，且由具有抗体重链可变区的活性即具有结合人epha2活性的蛋白质组成的重链可变区。

作为这种在seqidno:20或seqidno:22所示的氨基酸序列中缺失、置换或增添1个或数个氨基酸而形成的氨基酸序列，可举出：当使用blast(basiclocalalignmentsearchtoolatthenationalcenterforbiologicalinformation：美国国家生物技术信息中心的基本局部比对搜索工具)等(例如默认即初始设置的参数)进行计算时，是与seqidno:20或seqidno:22所示的氨基酸序列至少具有85％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选97％以上、98％以上或99％以上的序列同一性的氨基酸序列。

具有这种在seqidno:20或seqidno:22所示的氨基酸序列中缺失、置换或增添1个或数个氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白质，与具有seqidno:20或seqidno:22所示的氨基酸序列的蛋白质实质上相同。

而且，抗体57-1含有由seqidno:23所示的氨基酸序列(nygmn)组成的cdrh1、由seqidno:24所示的氨基酸序列(wintdtgepifveefkg)组成的cdrh2、由seqidno:25所示的氨基酸序列(smggfan)组成的cdrh3作为重链可变区的cdr(互补决定区)；而且，含有由seqidno:26所示的氨基酸序列(rasqnisdylh)组成的cdrl1、由seqidno:27所示的氨基酸序列(yasqsis)组成的cdrl2、由seqidno:28所示的氨基酸序列(qnghtfpt)组成的cdrl3作为轻链可变区的cdr(图16)。

即，本发明的抗epha2抗体是含有由seqidno:23所示的氨基酸序列组成的重链可变区cdrh1、由seqidno:24所示的氨基酸序列组成的重链可变区cdrh2、由seqidno:25所示的氨基酸序列组成的重链可变区cdrh3、由seqidno:26所示的氨基酸序列组成的轻链可变区cdrl1、由seqidno:27所示的氨基酸序列组成的轻链可变区cdrl2，以及由seqidno:28所示的氨基酸序列组成的轻链可变区cdrl3的抗体。

而且，抗体230-1含有由seqidno:29所示的氨基酸序列(dyymy)组成的cdrh1、由seqidno:30所示的氨基酸序列(tisddgsfthyldsvkg)组成的cdrh2、由seqidno:31所示的氨基酸序列(dgyrydrpfay)组成的cdrh3作为重链可变区的cdr(互补决定区)；而且，含有由seqidno:32所示的氨基酸序列(kasqdvntava)组成的cdrl1、由seqidno:33所示的氨基酸序列(wastrht)组成的cdrl2、由seqidno:34所示的氨基酸序列(qqhystpyt)组成的cdrl3作为轻链可变区的cdr(图17)。

即，本发明的抗epha2抗体是含有由seqidno:29所示的氨基酸序列组成的重链可变区cdrh1、由seqidno:30所示的氨基酸序列组成的重链可变区cdrh2、由seqidno:31所示的氨基酸序列组成的重链可变区cdrh3、由seqidno:32所示的氨基酸序列组成的轻链可变区cdrl1、由seqidno:33所示的氨基酸序列组成的轻链可变区cdrl2，以及由seqidno:34所示的氨基酸序列组成的轻链可变区cdrl3的抗体。

上述各cdr也包括由在各自所示的氨基酸序列中缺失、置换、增添1个或数个、优选1个或2个、更优选1个氨基酸而形成的氨基酸序列组成的氨基酸序列所组成的cdr。

含有上述重链可变区和轻链可变区的抗epha2单克隆抗体由上述重链可变区和重链恒定区以及上述轻链可变区和轻链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域ch1、ch2和ch3组成。重链恒定区也可以为igg1、igg2、igg3、igg4、iga、ige、igm或igd恒定区，优选为igg1或igg2恒定区，最优选为igg1恒定区。轻链恒定区由1个结构域cl组成。轻链恒定区为κ或λ恒定区。

本发明的抗体也包括抗体功能性片段或其修饰物。例如，抗体功能性片段是抗体的片段，且是能够特异性结合抗原的片段。作为功能性片段，可举出：fab、fab’、f(ab’)2、二硫键fv(dsfv)、二聚体化v区域(diabody：双价抗体(diabody))、单链fv(scfv)等。

本发明的抗体也可以使用产生抗体的杂交瘤来产生，可以通过将编码重链可变区的dna或编码轻链可变区的dna插入到表达载体，使用该载体转化用于表达的宿主细胞，培养宿主细胞，从而使细胞产生本发明的抗体作为重组抗体。

本发明的抗体也包括与结合上述抗体的表位相结合的抗体，或者在与epha2的结合中与上述抗体竞争的抗体。

本发明使用抗人epha2单克隆抗体构建免疫测定系统。作为免疫测定法，可举出：免疫印迹法、酶免疫测定法(eia、elisa)、放射免疫测定法(ria)、荧光抗体法、利用凝集反应的方法、免疫色谱法等。

另外，本发明使用抗人epha2单克隆抗体构建免疫测定法中的夹心免疫测定系统。作为夹心免疫测定法，可举出：夹心放射免疫测定法(ria法)夹心酶免疫测定法(eia法)、夹心荧光免疫测定法(fia法)、夹心发光免疫测定法(clia法)、夹心发光酶免疫测定法(cleia法)、基于夹心法的免疫色谱法等所有夹心免疫测定法。其中，优选eia法即elisa(enzyme-linkedimmunosorbentassay：酶联免疫吸附法)。下面对elisa进行说明，而其他夹心免疫测定法在使用两种抗体“夹持”要测定的抗原这一点上来看与该方法相同，本领域技术人员可以构建其他夹心免疫测定法。将未标记的抗人epha2单克隆抗体固定在96孔微量滴定板和聚苯乙烯珠等载体上，作为捕捉抗体(一抗)。此外，检测抗体(二抗)使用用辣根过氧化物酶(hrp)和碱性磷酸酶(alp)等酶、fitc等荧光物质或者生物素等标记的抗人epha2单克隆抗体。这种情况下，也可以将酶等标记到使用胃蛋白酶消化抗体分子而得到的fab’片段上。或者，还可以在使未标记的二抗发生反应，然后将用酶和荧光物质等对特异性结合该二抗的抗体进行标记的所得物用作检测用三抗并进行反应。此外，此时也可以用生物素标记的二抗，使标记的抗生物素蛋白或链霉亲和素与生物素结合并显色。抗原抗体反应可以在4℃～45℃、更优选在20℃～40℃、进一步优选在25℃～38℃进行，此外，反应时间为10分钟～18小时、更优选10分钟～1小时、进一步优选30分钟～1小时左右。可以根据标准曲线计算出样品中的epha2浓度，其中，所述标准曲线预先制定了显色程度，或者是在测定从受试对象采集的样品的同时制成的。在夹心免疫测定法中，将抗体57-1和抗体230-1之一固定在elisa用微量滴定板等载体上，用作固相抗体；标记另一个抗体，用作检测抗体。可以将抗体57-1用作固相抗体，将抗体230-1用作检测抗体，此外，也可以将抗体57-1用作检测抗体，将抗体230-1用作固相抗体。使用这些单克隆抗体的方法的特异性高，只检测epha2，在epha1、epha3、epha4中不显示出交叉反应性。

本发明包括用于测定epha2的至少含有抗体57-1和抗体230-1这两种抗体的检查用试剂盒，或者免疫诊断用组合物。可以将抗体57-1和抗体230-1中的一个抗体固定在elisa用微量滴定板上，将另一种抗体进行标记。上述检查用试剂盒可以包括标本采集器具、标本处理液、显色底物等试剂，还可以包括试验所需的器具等。

通过测定受试对象血液中的epha2，可以判定受试对象是否患有癌症。即，如果受试对象血液中的epha2浓度高于健康者血液中的epha2浓度，则可以判断为受试对象患有癌症。此外，也可以事先测定健康者的生物样品中的epha2浓度，根据该测定值对epha2的浓度测定值确定临界值(cut-off值)。以该临界值为基准，当超过临界值时，则可判断为患有癌症。

癌症优选为胃癌、卵巢癌、乳腺癌、食道癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、大肠癌、胰腺癌、肝癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫体癌、肾癌、脑肿瘤、恶性黑色素瘤、头颈癌等。

本发明包括以血液中的epha2浓度为指标检测癌症的方法。该方法也是以血液中的epha2浓度为指标，获得用于检测癌症的辅助数据的方法。

本发明包括用于对至少含有抗体57-1或抗体230-1的epha2进行测定来检测癌症的检查用试剂盒，或者免疫诊断用组合物。上述检查用试剂盒可以包括标本采集器具、标本处理液、显色底物等试剂，还可以包括试验所需的器具等。

而且，本发明包括用于对至少含有抗体57-1和抗体230-1这两种抗体的epha2进行测定来检测癌症的检查用试剂盒，或者免疫诊断用组合物。上述检查用试剂盒可以包括标本采集器具、标本处理液、显色底物等试剂，还可以包括试验所需的器具等。

实施例

下面通过实施例对本发明进行具体说明，但本发明并不受这些实施例限制。此外，以下实施例中关于基因操作的各操作，如无特别说明，则是按照《分子克隆(molecularcloning)》(sambrook，j.，fritsch，e.f.和maniatis，t.著，冷泉港实验室出版社于1989年出版)记载的方法进行；或者，当使用市售试剂和试剂盒时，则按照市售品的说明书进行使用。

[实施例1]

制作抗人epha2单克隆抗体

1)-1制作编码人epha2的质粒

1)-1-1制作编码全长人epha2的质粒

通过使用了由sk-ov-3细胞总rna合成的cdna作为模板和以下引物组的pcr反应，扩增编码人epha2的cdna。

引物1：

5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcggggatcggaccgagagcgagaag-3’(序列表的seqidno:1)，以及

引物2：

5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcctagatggggatccccacagtgttcacctggtcctt-3’(序列表的seqidno:2)

使用bp克隆酶(invitrogen公司、赛默飞世尔科技公司)将pcr片段克隆到pdonr221(invitrogen公司、赛默飞世尔科技公司)。使用genetailor定点诱变系统(invitrogen公司、赛默飞世尔科技公司)和以下引物组，从克隆的epha2基因中除去终止密码子。

引物3：5’-ctgtggggatccccatcgacccagctttc-3’(序列表的seqidno:3)，以及

引物4：5’-gatggggatccccacagtgttcacctggtc-3’(序列表的seqidno:4)

使用lr克隆酶(invitrogen公司、赛默飞世尔科技公司)，将该epha2基因片段移接到pcdna-dest40gatewayvector(invitrogen公司、赛默飞世尔科技公司)。下面，将该质粒记作pcdna-dest40-epha2(该质粒在attb1和attb2序列之间具有序列表的seqidno:5所示的核苷酸序列)。此外，克隆到该质粒的epha2基因的编码序列由序列表的seqidno:5的核苷酸编号33～2960所示。另外，epha2的氨基酸序列由序列表的seqidno:6所示。

1)-1-2制作编码epha2胞外结构域的质粒

使用以下引物组，利用pcr反应，将编码人epha2胞外结构域(由序列表的seqidno:6的氨基酸编号1～534所示的氨基酸序列组成。以下记作“epha2(ecr)”)的基因扩增。

引物5：5’-aaaaagcttatggagctccaggcagcccgc-3’(序列表的seqidno:7)，以及

引物6：5’-aaagggccctcagttgccagatccctccgg-3’(序列表的seqidno:8)

用hindiii和apai将该pcr片段切断，克隆到pcdna3.1的hindiii/apai位点(以下记作“pcdna3.1-epha2(ecr)”。此外，以下将通过pcdna3.1-epha2(ecr)表达的重组蛋白记作“epha2(ecr)”)。

1)-2制作编码人erbb2的质粒

将人克隆集合(humanclonecollection)(stratagene公司#c33830、agilenttechnologies公司)作为模板，使用以下引物组进行pcr反应。

引物7：5’-caccatggagctggcggccttg-3’(序列表的seqidno:9)，以及

引物8：5’-tcccactggcacgtccagacc-3’(序列表的seqidno:10)

使用pentr定向topo克隆试剂盒(invitrogen公司、赛默飞世尔科技公司)将得到的pcr片段克隆到pentr/d-topo(invitrogen公司、赛默飞世尔科技公司)。为了修复伴有氨基酸置换的突变，对该质粒进行ecori处理，将得到的片段中含有来自pentr/d-topo序列的片段与将人克隆集合(stratagene公司#c14640、agilenttechnologies公司)进行ecori处理而得到的片段中的第二大片段(约1.6kbp)进行连接。使用lr克隆酶将该质粒中的erbb2基因片段移接到pcdna-dest40gateway载体。下面，将该质粒记作pcdna-dest40-erbb2(在attb1和attb2序列之间具有序列表的seqidno:11所示的核苷酸序列)。

1)-3制备抗原蛋白

为了表达epha2(ecr)，使用293fectin(invitrogen公司、赛默飞世尔科技公司)将pcdna3.1-epha2(ecr)转染到freestyle293-f细胞(invitrogen公司、赛默飞世尔科技公司)，在37℃、8％co2中培养5天。通过离心分离回收培养上清液，使用分子量截留15000的透析管在20mmtris-hclph7.5中透析。通过过滤器(0.45μm，pes)后，将培养上清液加到利用20mmtris-hclph7.5平衡的hiprep16/10qxl(gehealthcare公司)中。以nacl的线性浓度梯度(20mmtris-hclph7.5、0-1mnacl)洗脱结合蛋白。然后收集含有epha2(ecr)的级分，加到用pbs平衡的hiload26/60superdex200pg(gehealthcare公司)中。用pbs洗脱蛋白质。收集含有epha2(ecr)的级分，用做免疫用抗原。蛋白质浓度使用bca蛋白质分析试剂(pierce公司、赛默飞世尔科技公司)进行测定。

1)-4免疫

作为初次免疫，向balb/canncrlcrlj小鼠(日本charlesriver公司)的背部皮下给予与弗氏完全佐剂(adjuvantcompletefreund)h37rv(和光纯药株式会社)或titermax金佐剂(goldadjuvant)(sigma公司)混合的50μg的epha2(ecr)。作为第二次、第三次免疫，向小鼠的背部皮下给予与弗氏完全佐剂(adjuvantincompletefreund)(和光纯药株式会社)混合的50μg的epha2(ecr)。用50μg的epha2(ecr)对这些小鼠进行加强免疫(boost)，3天后采集脾脏。将该脾脏用于制作杂交瘤。

1)-5制作杂交瘤

使用peg4000(ibl公司)将脾细胞与小鼠骨髓瘤p3x63ag8u.1细胞进行细胞融合，制作杂交瘤。使用杂交瘤的培养上清液，筛选产生抗epha2抗体的杂交瘤。

1)-6抗体筛选

1)-6-1制备抗原表达细胞

以5×10⁴细胞/cm²，将293t细胞接种到i型胶原蛋白涂布的烧瓶(iwaki公司)，在含有10％fbs的dmem中在37℃、5％co2的加湿气氛中培养过夜。次日，使用lipofectamine2000(invitrogen公司、赛默飞世尔科技公司)，分别用pcdna-dest40-epha2和pcdna-dest40-erbb2(阴性对照)转染293t细胞，在37℃、5％co2的加湿气氛中再培养过夜。次日，对转染的细胞进行胰蛋白酶处理，用含有10％fbs的dmem洗涤细胞，然后悬浮于含有5％fbs的pbs中。将该细胞用于细胞elisa、流式细胞仪分析。

1)-6-2细胞elisa

将在1)-6-1中制备的细胞与杂交瘤培养上清液混合，在4℃孵育1小时。用含有5％fbs的pbs洗涤细胞两次，然后在用含有5％fbs的pbs稀释了500倍的偶联有过氧化物酶的山羊抗小鼠igg(goatanti-mouseigg，peroxidaseconjugated)(millipore(chemicon)公司#ap181p)中在4℃染色1小时。用含有5％fbs的pbs洗涤细胞两次，然后以100μl/孔的量加入opd显色液(在opd溶解液(0.05m柠檬酸三钠、0.1m十二水磷酸氢二钠ph4.5)中分别以0.4mg/ml、0.6％(v/v)的形式溶解邻苯二胺二盐酸盐(和光纯药株式会社)、h2o2)。一边搅拌一边进行显色反应，以100μl/孔的量加入1mhcl，使显色反应停止。离心后，将上清液转移到新的96孔平底微孔板，用读板机(arvo：perkinelmer公司)测定在490nm处的吸光度。为了选择产生特异性结合epha2的抗体的杂交瘤，选择对表达epha2的293t细胞显示出高于对表达erbb2的293t细胞(阴性对照)的吸光度的杂交瘤。1)-6-3流式细胞仪分析

为了除去细胞elisa中的假阳性，通过流式细胞仪分析来确认用细胞elisa判定为阳性的杂交瘤产生的抗体是否特异性结合epha2。将在1)-6-1中制备的细胞与杂交瘤培养上清液混合，在4℃孵育1小时。用含有5％fbs的pbs洗涤两次，然后在用含有5％fbs的pbs稀释了1000倍的偶联有荧光素的山羊igg组分抗小鼠igg(fluorescein-conjugatedgoatiggfractiontomouseigg)(全分子)(icnpharmaceuticals公司#55493)中在4℃染色1小时。用含有5％fbs的pbs洗涤两次，然后再悬浮于含有2μg/ml7-氨基放线菌素d(invitrogen(molecularprobes)公司、赛默飞世尔科技公司)的含5％fbs的pbs中，用流式细胞仪(fc500：beckmancoulter公司)进行分析。数据分析使用flowjo(treestar公司)进行。将7-氨基放线菌素d阳性的死细胞通过设门(gate)排除后，绘制活细胞的fitc荧光强度的直方图。选择产生对表达epha2的293t细胞显示出高于在直方图中作为对照的表达erbb2的293t细胞的结合性的抗体的杂交瘤。

1)-7杂交瘤的单克隆化。

产生抗epha2抗体的杂交瘤使用clonacell-hy选择培养基d(stemcelltechnologies公司#03804)来培养，回收出现的集落，从而进行单克隆化。使用单克隆化的细胞的培养上清液，通过与1)-6-3相同的方法确认对epha2的结合性。其结果是建立了产生抗epha2单克隆抗体(57-1、80-21、83-21、113-1、119-1、131-1、141-21、148-1、151-4、230-1、240-4和245-21)的杂交瘤。

1)-8单克隆抗体的同种型确定

单克隆抗体的同种型通过小鼠单克隆同种型鉴定试剂盒(serotec公司)来确定。其结果为igg1(57-1、113-1、119-1、131-1、141-21、230-1)、igg2a(80-21、83-21、148-1、151-4、240-4)、igg2b(245-21)。

[实施例2]

epha2测定法的开发

2)-1筛选elisa用单克隆抗体

2)-1-1抗epha2单克隆抗体的包被

为了筛选能够用于测定epha2的夹心elisa的抗epha2单克隆抗体，在包被前将抗epha2单克隆抗体shm41(东洋大学、非专利文献19、20)、57-1、80-21、83-21、113-1、119-1、131-1、141-21、148-1、151-4、230-1、240-4、245-21用pbs稀释制备成5μg/ml的浓度，各以100μl/孔的量加入到eia/ria孔板高结合型平底96孔板(costar公司：no.9018)。贴上封板膜，在4℃在孔板上吸附16小时以上，然后进行封闭处理。封闭使用用去离子水稀释5倍的检测溶液(测定稀释液：biolegend公司)，在4℃静置过夜。

2)-1-2标准蛋白质

人epha2标准蛋白质使用从r&d公司购买的人重组epha2-(x6his)。稀释浓度设定为2000pg/ml、500pg/ml、125pg/ml、31.3pg/ml、0pg/ml这五级别。除去2)-1-1的孔板的封闭溶液，然后以100μl/孔的量加入各浓度的epha2标准蛋白溶液，在室温反应2小时。

2)-1-3生物素标记的检测抗体

从反应结束的2)-1-2的孔板中除去溶液，以200μl/孔的量加入elisa洗涤溶液(含有0.05％tween20的pbs溶液)。用孔板混匀仪(日本asone株式会社)搅拌15秒，然后除去洗涤液。重复三次该洗涤操作，然后以100μl/孔的量加入用检测溶液稀释1000倍的生物素标记的抗epha2多克隆抗体(r&d公司：baf3035)，在室温反应1小时。

2)-1-4抗生物素蛋白酶溶液

从反应结束的2)-1-3的孔板中除去生物素抗体溶液，用elisa洗涤溶液重复四次洗涤操作。然后以100μl/孔的量加入用检测溶液稀释4000倍的链霉亲和素-hrp(bdbioscience公司)，在室温反应45分钟。

2)-1-5底物溶液

从反应结束的2)-1-4的孔板中除去生物素抗体溶液，用elisa洗涤溶液重复五次洗涤操作。然后以100μl/孔的量加入tmb(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)溶液(kpl公司)，在室温反应15分钟，显色为蓝色。

2)-1-6反应停止

以100μl/孔的量加入2n(2规定)硫酸溶液(和光纯药株式会社)，停止反应使溶液变成黄色，然后用微孔板读板机imark(bio-rad公司)测定在450nm处的吸光度(参考波长570nm)。

2)-1-7结果

在shm41、230-1、57-1、141-21、151-4中确认到反应，其中230-1的反应性最高(图1)。

2)-2使用抗epha2单克隆抗体230-1的夹心elisa

2)-2-1抗epha2单克隆抗体的包被

为了选择与抗epha2单克隆抗体230-1组合的抗epha2单克隆抗体，用生物素标记的230-1，用作检测抗体。作为捕获抗体，在包被前将57-1、80-21、83-21、113-1、119-1、131-1、141-21、148-1、151-4、240-4、245-21和同种型igg1用pbs稀释调节成5μg/ml的浓度，各以100μl/孔的量加入到eia/ria孔板高结合型平底96孔板。贴上封板膜，在4℃在孔板上吸附16小时以上，然后进行封闭处理。封闭使用用去离子水稀释5倍的检测溶液，在4℃静置过夜。

2)-2-2标准蛋白质

按照2000pg/ml、500pg/ml、125pg/ml、0pg/ml这四个稀释浓度级别来稀释人epha2标准蛋白质。除去2)-2-1的孔板的封闭溶液，然后以100μl/孔的量加入各浓度的epha2标准蛋白溶液，在室温反应2小时。

2)-2-3生物素化标记

使用生物素标记试剂盒(同仁化学研究所)，按照实验步骤对单克隆抗体230-1进行生物素化标记。

2)-2-4生物素标记的检测抗体

从反应结束的2)-2-2的孔板中除去溶液，以200μl/孔的量加入elisa洗涤溶液。用孔板混匀仪搅拌15秒，然后除去洗涤液。重复三次该洗涤操作，然后以100μl/孔的量加入用检测溶液稀释1000倍的生物素标记的抗epha2单克隆抗体230-1，在室温反应1小时。

2)-2-5抗生物素蛋白酶溶液

从反应结束的2)-2-4的孔板中除去生物素抗体溶液，用elisa洗涤溶液重复四次洗涤操作。然后以100μl/孔的量加入用检测溶液稀释2000倍的链霉亲和素-hrp(biolegend公司)，在室温反应45分钟。

2)-2-6底物溶液

从反应结束的2)-2-5的孔板中除去生物素抗体溶液，用elisa洗涤溶液重复五次洗涤操作。然后以100μl/孔的量加入tmb溶液，在室温反应15分钟，显色为蓝色。

2)-2-7反应停止

以100μl/孔的量加入2n硫酸溶液，停止反应使溶液变成黄色，然后用微孔板读板机测定在450nm处的吸光度(参考波长570nm)。

2)-2-8结果

当使用生物素标记的230-1时，考察的11种抗epha2单克隆抗体中，与57-1组合的反应性最高(图2)。

2)-3使用抗epha2抗体230-1、57-1和shm41的夹心elisa

2)-3-1抗epha2单克隆抗体的包被

作为epha2检测的夹心elisa的包被抗体，将57-1、230-1或shm41抗体用pbs稀释调节成5μg/ml的浓度，各以100μl/孔的量加入到eia/ria孔板高结合型平底96孔板。贴上封板膜，在4℃在孔板上吸附16小时以上，然后进行封闭处理。封闭使用用去离子水稀释5倍的检测溶液，在4℃静置过夜。

2)-3-2标准蛋白质

从稀释浓度2000pg/ml起，将人epha2标准蛋白质每次2倍逐级稀释8级(最小浓度7.8pg/ml)，除去2)-3-1的孔板的封闭溶液，然后以100μl/孔的量加入各浓度的epha2标准蛋白溶液，在室温反应2小时。

2)-3-3生物素标记的检测抗体

从反应结束的2)-3-2的孔板中除去溶液，以200μl/孔的量加入elisa洗涤溶液。用孔板混匀仪搅拌15秒，然后除去洗涤液。重复三次该洗涤操作，然后以100μl/孔的量加入用检测溶液稀释1000倍的生物素标记的抗epha2单克隆抗体(57-1或230-1)，在室温反应1小时。

2)-3-4抗生物素蛋白酶溶液

从反应结束的2)-3-3的孔板中除去生物素抗体溶液，用elisa洗涤溶液重复四次洗涤操作。然后以100μl/孔的量加入用检测溶液稀释2000倍的链霉亲和素-hrp，在室温反应45分钟。

2)-3-5底物溶液

从反应结束的2)-3-4的孔板中除去生物素抗体溶液，用elisa洗涤溶液重复五次洗涤操作。然后以100μl/孔的量加入tmb溶液，在室温反应15分钟，显色为蓝色。

2)-3-6反应停止

以100μl/孔的量加入2n硫酸溶液，停止反应使溶液变成黄色，然后用微孔板读板机测定在450nm处的吸光度(参考波长570nm)。

2)-3-7结果

在使用shm41作为捕获抗体，使用生物素标记的57-1作为检测抗体的系统中，几乎检测不到epha2。此外，在使用shm41作为捕获抗体，使用生物素标记230-1作为检测抗体的系统中，即使检测到epha2，背景也较高。而在使用57-1或230-1作为捕获抗体，使用生物素标记的57-1或生物素标记的230-1作为检测抗体的系统中，则可以检测到epha2，背景也较低。以上结果表明，57-1和230-1的组合有望用于epha2的检测(图3)。

2)-4epha2夹心elisa系统的构建

为了优化使用57-1和230-1的elisa系统，改变封闭溶液、标准蛋白质稀释溶液和生物素标记的抗体的稀释溶液。

2)-4-1抗epha2单克隆抗体的包被

作为epha2检测的夹心elisa的包被抗体，将57-1或230-1抗体用pbs稀释调节成5μg/ml的浓度，各以100μl/孔的量加入到eia/ria孔板高结合型平底96孔板。贴上封板膜，在4℃在孔板上吸附16小时以上，然后进行封闭处理。封闭使用superblock封闭溶液(thermoscientific公司)，在4℃静置过夜。

2)-4-2标准蛋白质

使用cangetsignal溶液#1(东洋纺生命科学公司)，从稀释浓度2000pg/ml起，将人epha2标准蛋白质每次2倍逐级稀释8级(最小浓度7.8pg/ml)，除去2)-4-1的孔板的封闭溶液，然后以100μl/孔的量加入各浓度的epha2标准蛋白溶液，在室温反应2小时。

2)-4-3生物素标记的检测抗体

从反应结束的2)-4-2的孔板中除去溶液，以200μl/孔的量加入elisa洗涤溶液。用孔板混匀仪搅拌15秒，然后除去洗涤液。重复三次该洗涤操作，然后以100μl/孔的量加入用cangetsignal溶液#2(东洋纺生命科学公司)稀释1000倍的生物素标记的抗epha2单克隆抗体(57-1或230-1)，在室温反应1小时。

2)-4-4抗生物素蛋白酶溶液

从反应结束的2)-4-3的孔板中除去生物素抗体溶液，用elisa洗涤溶液重复四次洗涤操作。然后以100μl/孔的量加入用检测溶液稀释2000倍的链霉亲和素-hrp，在室温反应45分钟。

2)-4-5底物溶液

从反应结束的2)-4-4的孔板中除去生物素抗体溶液，用elisa洗涤溶液重复五次洗涤操作。然后以100μl/孔的量加入tmb溶液，在室温反应15分钟，显色为蓝色。

2)-4-6反应停止

以100μl/孔的量加入2n硫酸溶液，停止反应使溶液变成黄色，然后用微孔板读板机测定在450nm处的吸光度(参考波长570nm)。

2)-4-7结果

在使用57-1作为捕获抗体、使用生物素标记的230-1作为检测抗体的系统，以及使用230-1作为捕获抗体、使用生物素标记的57-1作为检测抗体的系统这两个系统中，这些elisa系统可以检测到epha2，而且背景值较低。此外，使用230-1作为捕获抗体，使用生物素标记的57-1作为检测抗体的系统中，在高浓度区域显示出更高的吸光度值(图4)。

2)-5标准曲线

按照实施例2)-4的方法，将230-1抗体用作夹心elisa的包被用抗体(捕获抗体)，将生物素标记的57-1抗体用作检测抗体，测定从2000pg/ml逐级稀释到7.8pg/ml的人epha2标准蛋白质。标准曲线使用prism4(4.03版,graphpadsoftware公司)的三阶多项式模型绘制。结果是r²值为0.9998，标准曲线在7.8pg/ml至2000pg/ml的范围内显示出良好的普适性(图5)。

2)-6检测特异性

使用实施例2)-4的方法，除了epha2蛋白以外，将epha1、epha3、epha4蛋白(北京义翘神州科技有限公司)同样地稀释为2000pg/ml、1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml，并利用夹心elisa测定。结果是该方法只检测到epha2，未在epha1、epha3、epha4中显示出交叉反应性(图6)。该结果表明，该elisa系统对epha2具有高特异性。

2)-7人血清中的epha2值的测定

2)-7-1来自癌症患者的血清

来自胃癌患者的冷冻保存血清(10例)、来自卵巢癌患者的冷冻保存血清(10例)和健康者冷冻保存血清(10例)从bioserve公司(代理商：reprocell公司)获得。所有血清均使用具有获得所提供患者同意的irb证明书的血清。

来自非小细胞肺癌患者的冷冻保存血清(10例)和健康者冷冻保存血清(10例)从proteogenex公司(代理商：bizcomjapan公司)获得。所有血清均使用具有获得提供患者同意的irb证明书的血清。

2)-7-2血清中的epha2值的测定

按照实施例2)-4的方法，用cangetsignal溶液#1将各种血清(健康者、胃癌患者和卵巢癌患者)稀释5倍，并利用夹心elisa测定。

2)-7-3统计分析

统计分析使用steel检验(sassystemrelease9.2、sasinstitute公司)来进行。

2)-7-4结果

健康者、胃癌和卵巢癌患者血清中的epha2浓度的中位值为372pg/ml、647pg/ml、600pg/ml。与健康者相比，胃癌患者血液中的epha2显著增高(p＝0.0142)(图7-1)。

健康者和非小细胞肺癌患者血清中的epha2浓度的中位值为232pg/ml、645pg/ml。此外，平均值为231pg/ml、1,031pg/ml。与健康者相比，非小细胞肺癌患者血液中的epha2显著增高(p＝0.0024)(图7-2)。

[实施例3]

确定对小鼠抗epha2单克隆抗体的可变区进行编码的cdna核苷酸序列

3)-1确定对小鼠抗epha2抗体57-1的可变区进行编码的cdna核苷酸序列

3)-1-1制备来自产生57-1的杂交瘤的总rna

使用trizol试剂(ambion公司)，从产生57-1的杂交瘤制备总rna。

3)-1-2合成cdna(5’-race-readycdna)

使用在实施例3)-1-1中制备的1μg总rna和smarterrace5’/3’试剂盒(clontech公司)，合成cdna(5’-race-readycdna)。

3)-1-3利用5’-racepcr扩增编码57-1重链可变区的cdna和确定核苷酸序列

作为用于利用pcr扩增编码57-1重链可变区的cdna的引物，使用upm(universalprimeramix：smarterrace5’/3’试剂盒附带)和5’-catcccagggtcaccatggagttagtttgg-3’(mg1vr1：seqidno:12)。mg1vr1根据数据库中的小鼠重链(igg1)恒定区的序列来设计。

使用这些引物和在实施例3)-1-2中合成的cdna(5’-race-readycdna)作为模板，利用5’-racepcr扩增编码57-1重链可变区的cdna。该pcr使用kod-plus-(东洋纺公司)作为聚合酶，并按照smarterrace5’/3’试剂盒的使用手册所记载的降落pcr(touchdownpcr)操作步骤进行。

使用minelutepcr纯化试剂盒(qiagen公司)纯化扩增的cdna片段，然后使用zeroblunttopopcr克隆试剂盒(invitrogen公司、赛默飞世尔科技公司)进行克隆。

为了确定克隆的cdna片段的核苷酸序列，使用以下测序引物。

5’-catcccagggtcaccatggagttagtttgg-3’(mg1vr1：seqidno:12)，以及

5’-aagcagtggtatcaacgcagagt-3’(nup：seqidno:13)

测序反应使用geneamp9700(appliedbiosystems公司、赛默飞世尔科技公司)进行，dna的序列确定使用abiprism3700dna分析仪(appliedbiosystems公司、赛默飞世尔科技公司)或appliedbiosystems3730xl分析仪(appliedbiosystems公司、赛默飞世尔科技公司)进行。

确定的编码57-1重链可变区的cdna核苷酸序列如seqidno:14(图8)所示，氨基酸序列如seqidno:15(图9)所示。

3)-1-4利用5’-racepcr扩增编码57-1轻链可变区的cdna和确定核苷酸序列

作为用于利用pcr扩增编码57-1可变区的cdna的引物，使用upm(universalprimeramix：smarterrace5’/3’试剂盒附带)和5’-agtccaactgttcaggacgccattttgtcg-3’(mkvr2：seqidno:16)。mkvr2根据数据库中的小鼠轻链恒定区的序列来设计。

使用这些引物和在实施例3)-1-2中合成的cdna(5’-race-readycdna)作为模板，利用5’-racepcr扩增编码57-1轻链可变区的cdna。该pcr使用kod-plus-(东洋纺公司)作为聚合酶，并按照smarterrace5’/3’试剂盒的使用手册所记载的降落pcr(touchdownpcr)操作步骤进行。

使用minelutepcr纯化试剂盒(qiagen公司)纯化扩增的cdna片段，然后使用zeroblunttopopcr克隆试剂盒(invitrogen公司、赛默飞世尔科技公司)进行克隆。

为了确定克隆的cdna片段的核苷酸序列，使用以下测序引物。

5’-agtccaactgttcaggacgccattttgtcg-3’(mkvr2：seqidno:16)，以及

5’-aagcagtggtatcaacgcagagt-3’(nup：seqidno:13)

测序反应使用geneamp9700(appliedbiosystems公司，现赛默飞世尔科技公司)进行，dna的序列确定使用abiprism3700dna分析仪(appliedbiosystems公司、赛默飞世尔科技公司)或appliedbiosystems3730xl分析仪(appliedbiosystems公司、赛默飞世尔科技公司)进行。

确定的编码57-1轻链可变区的cdna核苷酸序列如序列表的seqidno:17(图10)所示，氨基酸序列如seqidno:18(图11)所示。

3)-2确定对小鼠抗epha2抗体230-1的可变区进行编码的cdna核苷酸序列

3)-2-1制备来自产生230-1的杂交瘤的总rna

使用与实施例3)-1-1相同的方法，从产生230-1的杂交瘤制备总rna。

3)-2-2合成cdna(5’-race-readycdna)

使用实施例3)-2-1中制备的1μg总rna，按照与实施例3)-1-2相同的方法合成cdna(5’-race-readycdna)。

3)-2-3利用5’-racepcr扩增编码230-1重链可变区的cdna和确定核苷酸序列

将实施例3)-2-2中合成的cdna(5’-race-readycdna)用作模板，按照与实施例3)-1-3相同的方法扩增编码230-1重链可变区的cdna，并确定核苷酸序列。

确定的编码230-1重链可变区的cdna核苷酸序列如序列表的seqidno:19(图12)所示，氨基酸序列如seqidno:20(图13)所示。

3)-2-4利用5’-racepcr扩增编码230-1轻链可变区的cdna和确定核苷酸序列

将实施例3)-2-2中合成的cdna(5’-race-readycdna)用作模板，按照与实施例3)-1-4相同的方法扩增编码抗体230-1轻链可变区的cdna，并确定核苷酸序列。

确定的编码230-1轻链可变区的cdna核苷酸序列如序列表的seqidno:21(图14)所示，氨基酸序列如seqidno:22(图15)所示。

工业实用性

本发明的抗体适合利用夹心免疫测定法测定生物样品中的epha2，能够用于癌症检测等。

序列表自由文本

seqidno:1～seqidno:4、seqidno:7～seqidno:10、seqidno:12、seqidno:13和seqidno:16引物

本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均通过直接引用而并入本说明书中。

序列表

<110>学校法人东洋大学

<120>抗epha2抗体和使用该抗epha2抗体的epha2免疫检测

<130>ph-7210-pct

<150>jp2017-009349

<151>2017-01-23

<160>34

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>55

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>1

ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcggggatcggaccgagagcgagaag55

<210>2

<211>66

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>2

ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcctagatggggatccccacagtgttcacctg60

gtcctt66

<210>3

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

ctgtggggatccccatcgacccagctttc29

<210>4

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

gatggggatccccacagtgttcacctggtc30

<210>5

<211>2961

<212>dna

<213>智人(homosapiens)

<400>5

tcggggatcggaccgagagcgagaagcgcggcatggagctccaggcagcccgcgcctgct60

tcgccctgctgtggggctgtgcgctggccgcggccgcggcggcgcagggcaaggaagtgg120

tactgctggactttgctgcagctggaggggagctcggctggctcacacacccgtatggca180

aagggtgggacctgatgcagaacatcatgaatgacatgccgatctacatgtactccgtgt240

gcaacgtgatgtctggcgaccaggacaactggctccgcaccaactgggtgtaccgaggag300

aggctgagcgtatcttcattgagctcaagtttactgtacgtgactgcaacagcttccctg360

gtggcgccagctcctgcaaggagactttcaacctctactatgccgagtcggacctggact420

acggcaccaacttccagaagcgcctgttcaccaagattgacaccattgcgcccgatgaga480

tcaccgtcagcagcgacttcgaggcacgccacgtgaagctgaacgtggaggagcgctccg540

tggggccgctcacccgcaaaggcttctacctggccttccaggatatcggtgcctgtgtgg600

cactactctccgtccgtgtctactacaagaagtgccccgagctgctgcagggcctggccc660

acttccctgagaccatcgccggctctgatgcaccttccctggccactgtggccggcacct720

gtgtggaccatgccgtggtgccaccggggggtgaagagccccgtatgcactgtgcagtgg780

atggcgagtggctggtgcccattgggcagtgcctgtgccaggcaggctacgagaaggtgg840

aggatgcctgccaggcctgctcgcctggattttttaagtttgaggcatctgagagcccct900

gcttggagtgccctgagcacacgctgccatcccctgagggtgccacctcctgcgagtgtg960

aggaaggcttcttccgggcacctcaggacccagcgtcgatgccttgcacacgaccccctt1020

ccgccccacactacctcacagccgtgggcatgggtgccaaggtggagctgcgctggacgc1080

cccctcaggacagcgggggccgcgaggacattgtctacagcgtcacctgcgaacagtgct1140

ggcccgagtctggggaatgcgggccgtgtgaggccagtgtgcgctactcggagcctcctc1200

acggactgacccgcaccagtgtgacagtgagcgacctggagccccacatgaactacacct1260

tcaccgtggaggcccgcaatggcgtctcaggcctggtaaccagccgcagcttccgtactg1320

ccagtgtcagcatcaaccagacagagccccccaaggtgaggctggagggccgcagcacca1380

cctcgcttagcgtctcctggagcatccccccgccgcagcagagccgagtgtggaagtacg1440

aggtcacttaccgcaagaagggagactccaacagctacaatgtgcgccgcaccgagggtt1500

tctccgtgaccctggacgacctggccccagacaccacctacctggtccaggtgcaggcac1560

tgacgcaggagggccagggggccggcagcaaggtgcacgaattccagacgctgtccccgg1620

agggatctggcaacttggcggtgattggcggcgtggctgtcggtgtggtcctgcttctgg1680

tgctggcaggagttggcttctttatccaccgcaggaggaagaaccagcgtgcccgccagt1740

ccccggaggacgtttacttctccaagtcagaacaactgaagcccctgaagacatacgtgg1800

acccccacacatatgaggaccccaaccaggctgtgttgaagttcactaccgagatccatc1860

catcctgtgtcactcggcagaaggtgatcggagcaggagagtttggggaggtgtacaagg1920

gcatgctgaagacatcctcggggaagaaggaggtgccggtggccatcaagacgctgaaag1980

ccggctacacagagaagcagcgagtggacttcctcggcgaggccggcatcatgggccagt2040

tcagccaccacaacatcatccgcctagagggcgtcatctccaaatacaagcccatgatga2100

tcatcactgagtacatggagaatggggccctggacaagttccttcgggagaaggatggcg2160

agttcagcgtgctgcagctggtgggcatgctgcggggcatcgcagctggcatgaagtacc2220

tggccaacatgaactatgtgcaccgtgacctggctgcccgcaacatcctcgtcaacagca2280

acctggtctgcaaggtgtctgactttggcctgtcccgcgtgctggaggacgaccccgagg2340

ccacctacaccaccagtggcggcaagatccccatccgctggaccgccccggaggccattt2400

cctaccggaagttcacctctgccagcgacgtgtggagctttggcattgtcatgtgggagg2460

tgatgacctatggcgagcggccctactgggagttgtccaaccacgaggtgatgaaagcca2520

tcaatgatggcttccggctccccacacccatggactgcccctccgccatctaccagctca2580

tgatgcagtgctggcagcaggagcgtgcccgccgccccaagttcgctgacatcgtcagca2640

tcctggacaagctcattcgtgcccctgactccctcaagaccctggctgactttgaccccc2700

gcgtgtctatccggctccccagcacgagcggctcggagggggtgcccttccgcacggtgt2760

ccgagtggctggagtccatcaagatgcagcagtatacggagcacttcatggcggccggct2820

acactgccatcgagaaggtggtgcagatgaccaacgacgacatcaagaggattggggtgc2880

ggctgcccggccaccagaagcgcatcgcctacagcctgctgggactcaaggaccaggtga2940

acactgtggggatccccatcg2961

<210>6

<211>976

<212>prt

<213>智人(homosapiens)

<400>6

metgluleuglnalaalaargalacysphealaleuleutrpglycys

151015

alaleualaalaalaalaalaalaglnglylysgluvalvalleuleu

202530

aspphealaalaalaglyglygluleuglytrpleuthrhisprotyr

354045

glylysglytrpaspleumetglnasnilemetasnaspmetproile

505560

tyrmettyrservalcysasnvalmetserglyaspglnaspasntrp

65707580

leuargthrasntrpvaltyrargglyglualagluargilepheile

859095

gluleulysphethrvalargaspcysasnserpheproglyglyala

100105110

sersercyslysgluthrpheasnleutyrtyralagluseraspleu

115120125

asptyrglythrasnpheglnlysargleuphethrlysileaspthr

130135140

ilealaproaspgluilethrvalserserasppheglualaarghis

145150155160

vallysleuasnvalglugluargservalglyproleuthrarglys

165170175

glyphetyrleualapheglnaspileglyalacysvalalaleuleu

180185190

servalargvaltyrtyrlyslyscysprogluleuleuglnglyleu

195200205

alahispheprogluthrilealaglyseraspalaproserleuala

210215220

thrvalalaglythrcysvalasphisalavalvalproproglygly

225230235240

glugluproargmethiscysalavalaspglyglutrpleuvalpro

245250255

ileglyglncysleucysglnalaglytyrglulysvalgluaspala

260265270

cysglnalacysserproglyphephelyspheglualasergluser

275280285

procysleuglucysprogluhisthrleuproserprogluglyala

290295300

thrsercysglucysglugluglyphepheargalaproglnasppro

305310315320

alasermetprocysthrargproproseralaprohistyrleuthr

325330335

alavalglymetglyalalysvalgluleuargtrpthrproprogln

340345350

aspserglyglyarggluaspilevaltyrservalthrcysglugln

355360365

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370375380

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385390395400

aspleugluprohismetasntyrthrphethrvalglualaargasn

405410415

glyvalserglyleuvalthrserargserpheargthralaserval

420425430

serileasnglnthrgluproprolysvalargleugluglyargser

435440445

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450455460

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465470475480

sertyrasnvalargargthrgluglypheservalthrleuaspasp

485490495

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500505510

gluglyglnglyalaglyserlysvalhisglupheglnthrleuser

515520525

progluglyserglyasnleualavalileglyglyvalalavalgly

530535540

valvalleuleuleuvalleualaglyvalglyphepheilehisarg

545550555560

argarglysasnglnargalaargglnserprogluaspvaltyrphe

565570575

serlyssergluglnleulysproleulysthrtyrvalaspprohis

580585590

thrtyrgluaspproasnglnalavalleulysphethrthrgluile

595600605

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610615620

glygluvaltyrlysglymetleulysthrserserglylyslysglu

625630635640

valprovalalailelysthrleulysalaglytyrthrglulysgln

645650655

argvalasppheleuglyglualaglyilemetglyglnpheserhis

660665670

hisasnileileargleugluglyvalileserlystyrlyspromet

675680685

metileilethrglutyrmetgluasnglyalaleuasplyspheleu

690695700

argglulysaspglyglupheservalleuglnleuvalglymetleu

705710715720

argglyilealaalaglymetlystyrleualaasnmetasntyrval

725730735

hisargaspleualaalaargasnileleuvalasnserasnleuval

740745750

cyslysvalserasppheglyleuserargvalleugluaspasppro

755760765

glualathrtyrthrthrserglyglylysileproileargtrpthr

770775780

alaproglualailesertyrarglysphethrseralaseraspval

785790795800

trpserpheglyilevalmettrpgluvalmetthrtyrglygluarg

805810815

protyrtrpgluleuserasnhisgluvalmetlysalaileasnasp

820825830

glypheargleuprothrprometaspcysproseralailetyrgln

835840845

leumetmetglncystrpglnglngluargalaargargprolysphe

850855860

alaaspilevalserileleuasplysleuileargalaproaspser

865870875880

leulysthrleualaasppheaspproargvalserileargleupro

885890895

serthrserglysergluglyvalpropheargthrvalserglutrp

900905910

leugluserilelysmetglnglntyrthrgluhisphemetalaala

915920925

glytyrthralaileglulysvalvalglnmetthrasnaspaspile

930935940

lysargileglyvalargleuproglyhisglnlysargilealatyr

945950955960

serleuleuglyleulysaspglnvalasnthrvalglyileproile

965970975

<210>7

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>7

aaaaagcttatggagctccaggcagcccgc30

<210>8

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>8

aaagggccctcagttgccagatccctccgg30

<210>9

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>9

caccatggagctggcggccttg22

<210>10

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>10

tcccactggcacgtccagacc21

<210>11

<211>3804

<212>dna

<213>智人(homosapiens)

<400>11

ccgcggccgcccccttcaccatggagctggcggccttgtgccgctgggggctcctcctcg60

ccctcttgccccccggagccgcgagcacccaagtgtgcaccggcacagacatgaagctgc120

ggctccctgccagtcccgagacccacctggacatgctccgccacctctaccagggctgcc180

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tgcaggatatccaggaggtgcagggctacgtgctcatcgctcacaaccaagtgaggcagg300

tcccactgcagaggctgcggattgtgcgaggcacccagctctttgaggacaactatgccc360

tggccgtgctagacaatggagacccgctgaacaataccacccctgtcacaggggcctccc420

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tgatccagcggaacccccagctctgctaccaggacacgattttgtggaaggacatcttcc540

acaagaacaaccagctggctctcacactgatagacaccaaccgctctcgggcctgccacc600

cctgttctccgatgtgtaagggctcccgctgctggggagagagttctgaggattgtcaga660

gcctgacgcgcactgtctgtgccggtggctgtgcccgctgcaaggggccactgcccactg720

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tctgccccctgcacaaccaagaggtgacagcagaggatggaacacagcggtgtgagaagt1020

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cagagcagctccaagtgtttgagactctggaagagatcacaggttacctatacatctcag1260

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gaattctgcacaatggcgcctactcgctgaccctgcaagggctgggcatcagctggctgg1380

ggctgcgctcactgagggaactgggcagtggactggccctcatccaccataacacccacc1440

tctgcttcgtgcacacggtgccctgggaccagctctttcggaacccgcaccaagctctgc1500

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ccttctgcgtggcccgctgccccagcggtgtgaaacctgacctctcctacatgcccatct1860

ggaagtttccagatgaggagggcgcatgccagccttgccccatcaactgcacccactcct1920

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tcatctctgcggtggttggcattctgctggtcgtggtcttgggggtggtctttgggatcc2040

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tcctgaaagagacggagctgaggaaggtgaaggtgcttggatctggcgcttttggcacag2220

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agacagagtaccatgcagatgggggcaaggtgcccatcaagtggatggcgctggagtcca2700

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ctgaattctcccgcatggccagggacccccagcgctttgtggtcatccagaatgaggact3000

tgggcccagccagtcccttggacagcaccttctaccgctcactgctggaggacgatgaca3060

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cactggcaccctccgaaggggctggctccgatgtatttgatggtgacctgggaatggggg3300

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<210>12

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>12

catcccagggtcaccatggagttagtttgg30

<210>13

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>13

aagcagtggtatcaacgcagagt23

<210>14

<211>348

<212>dna

<213>小家鼠(musmusculus)

<400>14

cagatccagttggtgcagtctggacctgagctgaagaagcctggagagacagtcaagatc60

tcctgcaagggttctgggtataccttcacaaactatggaatgaactgggtgaagcaggct120

ccaggaaagggtttaaagtggatggcctggataaacaccgacactggagagccaatattt180

gttgaagagttcaagggacggtttgccttctctttggaaacctctgccagcactgcctat240

ttgcagatcaacaacctcacaaatgaggacacggctacatatttctgtgcaagatctatg300

gggggctttgctaactggggccaagggactctggtcactgtctctgca348

<210>15

<211>116

<212>prt

<213>小家鼠(musmusculus)

<400>15

glnileglnleuvalglnserglyprogluleulyslysproglyglu

151015

thrvallysilesercyslysglyserglytyrthrphethrasntyr

202530

glymetasntrpvallysglnalaproglylysglyleulystrpmet

354045

alatrpileasnthraspthrglygluproilephevalglugluphe

505560

lysglyargphealapheserleugluthrseralaserthralatyr

65707580

leuglnileasnasnleuthrasngluaspthralathrtyrphecys

859095

alaargsermetglyglyphealaasntrpglyglnglythrleuval

100105110

thrvalserala

115

<210>16

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>16

agtccaactgttcaggacgccattttgtcg30

<210>17

<211>324

<212>dna

<213>小家鼠(musmusculus)

<400>17

gacattgtgatgactcagtctccagccaccctgtctgtgactccaggagatagagtctct60

ctttcctgcagggccagccagaatattagcgactacttacactggtatcaacaaaaatca120

catgaatctccaaggcttctcatcaaatatgcttcccaatccatctctgggatcccctcc180

aggttcagtggcagtggatcagggtcagatttcactctcactatcaacagtgtggaacct240

gaagatgttgcaatgtattactgtcaaaatggtcacacctttcccacgttcggtgctggg300

accaagctggagctgaaacgggct324

<210>18

<211>108

<212>prt

<213>小家鼠(musmusculus)

<400>18

aspilevalmetthrglnserproalathrleuservalthrprogly

151015

aspargvalserleusercysargalaserglnasnileserasptyr

202530

leuhistrptyrglnglnlysserhisgluserproargleuleuile

354045

lystyralaserglnserileserglyileproserargphesergly

505560

serglyserglyseraspphethrleuthrileasnservalglupro

65707580

gluaspvalalamettyrtyrcysglnasnglyhisthrpheprothr

859095

pheglyalaglythrlysleugluleulysargala

100105

<210>19

<211>360

<212>dna

<213>小家鼠(musmusculus)

<400>19

gaagtgcagctggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtcccttaaactc60

tcctgtgaagcctctggattcactttcagtgactattacatgtattgggttcggcagact120

ccggaaaagaggctggagtgggtcgcaaccattagtgatgatggtagtttcacccactat180

ctagacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagagacaatgcccagaacaacctgtac240

ctccaaatgagtagtctgaagtctgacgacacagccatgtattactgtgcaagagacggc300

tataggtacgacaggccgtttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca360

<210>20

<211>120

<212>prt

<213>小家鼠(musmusculus)

<400>20

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvallysproglygly

151015

serleulysleusercysglualaserglyphethrpheserasptyr

202530

tyrmettyrtrpvalargglnthrproglulysargleuglutrpval

354045

alathrileseraspaspglyserphethrhistyrleuaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnalaglnasnasnleutyr

65707580

leuglnmetserserleulysseraspaspthralamettyrtyrcys

859095

alaargaspglytyrargtyraspargprophealatyrtrpglygln

100105110

glythrleuvalthrvalserala

115120

<210>21

<211>327

<212>dna

<213>小家鼠(musmusculus)

<400>21

gacattgtgatgacccagtctcacaaattcatgtccacatcagtaggagacagggtccgc60

atcacctgcaaggccagtcaggatgtgaatactgctgtagcctggtatcaacaaaaacca120

gggcaatctcctaaactactgatttactgggcatccacccggcacactggagtccctgat180

cgattcacaggcagtggatctgggacagattattctctcaccatcagcagtgtgcaggct240

gaagacctggcactttattactgtcaacaacattatagcactccgtacacgttcggaggg300

gggaccaagctggagataaaacgggct327

<210>22

<211>109

<212>prt

<213>小家鼠(musmusculus)

<400>22

aspilevalmetthrglnserhislysphemetserthrservalgly

151015

aspargvalargilethrcyslysalaserglnaspvalasnthrala

202530

valalatrptyrglnglnlysproglyglnserprolysleuleuile

354045

tyrtrpalaserthrarghisthrglyvalproaspargphethrgly

505560

serglyserglythrasptyrserleuthrileserservalglnala

65707580

gluaspleualaleutyrtyrcysglnglnhistyrserthrprotyr

859095

thrpheglyglyglythrlysleugluilelysargala

100105

<210>23

<211>5

<212>prt

<213>小家鼠(musmusculus)

<400>23

asntyrglymetasn

15

<210>24

<211>17

<212>prt

<213>小家鼠(musmusculus)

<400>24

trpileasnthraspthrglygluproilephevalglugluphelys

151015

gly

<210>25

<211>7

<212>prt

<213>小家鼠(musmusculus)

<400>25

sermetglyglyphealaasn

15

<210>26

<211>11

<212>prt

<213>小家鼠(musmusculus)

<400>26

argalaserglnasnileserasptyrleuhis

1510

<210>27

<211>7

<212>prt

<213>小家鼠(musmusculus)

<400>27

tyralaserglnserileser

15

<210>28

<211>8

<212>prt

<213>小家鼠(musmusculus)

<400>28

glnasnglyhisthrpheprothr

15

<210>29

<211>5

<212>prt

<213>小家鼠(musmusculus)

<400>29

asptyrtyrmettyr

15

<210>30

<211>17

<212>prt

<213>小家鼠(musmusculus)

<400>30

thrileseraspaspglyserphethrhistyrleuaspservallys

151015

gly

<210>31

<211>11

<212>prt

<213>小家鼠(musmusculus)

<400>31

aspglytyrargtyraspargprophealatyr

1510

<210>32

<211>11

<212>prt

<213>小家鼠(musmusculus)

<400>32

lysalaserglnaspvalasnthralavalala

1510

<210>33

<211>7

<212>prt

<213>小家鼠(musmusculus)

<400>33

trpalaserthrarghisthr

15

<210>34

<211>9

<212>prt

<213>小家鼠(musmusculus)

<400>34

glnglnhistyrserthrprotyrthr

15