增强的免疫细胞受体测序方法与流程

本申请依据35u.s.c.§119(e)要求于2017年1月31日提交的美国临时专利申请序列号62/452,409的优先权，将其全部内容通过引用并入本文。本公开涉及用于对来自免疫细胞(例如t细胞或b细胞)的免疫细胞受体库进行测序的方法、系统和试剂盒。
背景技术：
：免疫细胞库(例如b或t细胞库)由数百万个淋巴细胞组成，每一个淋巴细胞表达不同的蛋白质复合物，该复合物能够特异性识别单一抗原。cd4和cd8阳性t细胞表达所谓的t细胞受体(tcr)。这些异二聚体受体识别由抗原呈递细胞表面上的主要组织相容性复合物(mhc)分子展示的抗原衍生肽，如rudolphmg,stanfieldrl,wilsonia.howtcrsbindmhcs,peptides,andcoreceptors.[tcr如何结合mhc、肽和共受体]annurevimmunol.[免疫学年度评论]2006；24:419-66所述。tcr由两个亚基组成，最常见的是一个α链和一个β链。一种较不常见的tcr类型包含一个γ链和一个δ链。α链由(可变)v区域、连接(j)区域和恒定(c)区域组成，而β链在v区域和j区域之间包含另外的多样性(d)区域(见图1)，如starrtk,jamesonsc,hogquistka.positiveandnegativeselectionoftcells.[t细胞的阳性和阴性选择]annurevimmunol.[免疫学年度评论]2003；21:139-76所述。以若干碎片形式(即所谓的基因区段)编码这些tcr区域中的每一个，这些基因区段在种系中空间分离。在人类中，tcrα基因座包含54个不同的v基因区段和61个j基因区段。人类tcrβ链基因座包含65个v区段、2个d区段和14个j区段。通过在胸腺中在淋巴细胞发育期间对这些tcr基因区段进行体细胞重组来实现tcr的巨大结构多样性。在此过程中，每种区域类型的若干个基因区段被随机选择并连接形成重排的tcr基因座。通过在重组位点添加或去除核苷酸来产生额外的连接多样性，如krangelms.mechanicsoftcellreceptorgenerearrangement.[t细胞受体基因重排机制]curropinimmunol.[免疫学当下观点]2009年4月；21(2):133-9所述。v(d)j连接的过程在形成tcrα链和β链的第三高变环(也称为互补决定区，cdr3)中起关键作用。这些区域结合抗原并且对于提供tcr展示的高特异性抗原识别是必需的。与tcrαβ类似，tcrγ和δ区段在胸腺发育期间经历v(d)j重排。这两个基因座都在t细胞发育的双阴性(dn)阶段重组。朝着γδ或αβ谱系的分化依赖于细胞产生功能性γδ或αβtcr的能力。δ基因座嵌入在α基因座内，dδ区段、jδ区段和cs区段位于α基因座的v区段和j区段之间。vδ区段与vα区段相同，但只有vα区段的一部分用于tcrδ链。总的来说，v(d)j重组能够产生数百万种不同的tcr序列，并在生物体消除感染或转化的细胞的能力中发挥关键作用。毫不奇怪，tcr库会影响多种疾病，包括恶性肿瘤、自身免疫性障碍和传染病。tcr测序有助于我们了解tcr库在感染期间或治疗后(例如，在造血干细胞移植、慢性病毒感染、免疫治疗后)如何演变。此外，肿瘤浸润淋巴细胞和靶向癌症特异性表位的其他t细胞上的tcr的鉴定不仅增强了我们对恶性疾病的认识，而且还导致了新的癌症治疗方法，如过继性t细胞转移或癌症疫苗。由于序列的多样性，确定tcr库在实践中具有挑战性。在过去的几年中，下一代测序(ngs)为全面评估tcr库的极端多样性开辟了新的机会，如以下文献中所述：genoletr,stevensonbj,farinellil,m,luescherif.highlydiversetcrachainrepertoireofpre-immunecd8+tcellsrevealsnewinsightsingenerecombination[免疫前cd8+t细胞的高度多样化tcrα链库显示出基因重组的新见解].emboj[欧洲分子生物学学会杂志].2012年4月；31(7):1666-78；robinshs,campregherpv,srivastavask,wachera,turtlecj,kahsaio,riddellsr,warreneh,carlsoncs.comprehensiveassessmentoft-cellreceptorbeta-chaindiversityinalphabetatcells[综合评估αβt细胞中t细胞受体β链的多样性].blood[血液].2009年11月5日；114(19):4099-107；linnemannc,heemskerkb,kvistborgp,kluinrj,bolotinda,chenx,bresserk,nieuwlandm,schotter,michelss,gomez-eerlandr,jahnl,hombrinkp,legrandn,shucj,mamedoviz,veldsa,blankcu,haanenjb,turchaninovama,kerkhovenrm,spitsh,hadrupsr,heemskerkmh,blankensteint,chudakovdm,bendlegm,schumachertn.high-throughputidentificationofantigen-specifictcrsbytcrgenecapture[通过tcr基因捕获高通量鉴定抗原特异性tcr].natmed[自然医学].2013年11月；19(11):1534-41；turchaninovama,britanovaov,bolotinda,shugaym,putintsevaev,staroverovdb,sharonovg,shcherbod,zvyaginiv,mamedoviz,linnemannc,schumachertn,chudakovdm.pairingoft-cellreceptorchainsviaemulsionpcr[通过乳化pcr配对t细胞受体链].eurjimmunol[欧洲免疫学杂志].2013年9月；43(9):2507-15。由于大多数目前的tcr测序技术需要富集tcr基因用于测序，因此大多数方法都包括扩增步骤，其中编码个体tcr的核酸被扩增。因此，tcr测序的挑战之一涉及该技术在扩增期间维持每个tcr的比例的能力。因此，制备tcr文库的方式对获得的测序结果的质量和可靠性、以及对可从数据得出的结论具有强烈影响。过去已经使用了几种方法来扩增和测序tcr库，每种方法都有其自己的一系列问题。一种常用的tcr测序方法基于多重pcr步骤，其中v区段和j区段的所有引物混合在一起以扩增所有可能的v(d)j重排/组合，如robinshs,campregherpv,srivastavask,wachera,turtlecj,kahsaio,riddellsr,warreneh,carlsoncs.comprehensiveassessmentoft-cellreceptorbeta-chaindiversityinalphabetatcells[综合评估αβt细胞中t细胞受体β链的多样性].blood[血液].2009年11月5日；114(19):4099-107所述。该技术的主要缺点是扩增不是定量的：因为每个引物对的功效不同，所以一些tcr序列优先在文库中表示出来。另一种tcr测序方法使用称为“dna基因捕获”的过程来分离编码tcr的dna片段，如linnemannc,heemskerkb,kvistborgp,kluinrj,bolotinda,chenx,bresserk,nieuwlandm,schotter,michelss,gomez-eerlandr,jahnl,hombrinkp,legrandn,shucj,mamedoviz,veldsa,blankcu,haanenjb,turchaninovama,kerkhovenrm,spitsh,hadrupsr,heemskerkmh,blankensteint,chudakovdm,bendlegm,schumachertn.high-throughputidentificationofantigen-specifictcrsbytcrgenecapture[通过tcr基因捕获高通量鉴定抗原特异性tcr].natmed[自然医学].2013年11月；19(11):1534-41所述。然而，由于该方法使用dna而不是rna，因此该方法还将分离尚未经历体细胞重排的v区段和j区段。因此，获得的许多测序数据对于tcr基因鉴定是不提供信息的，因为它们不含有重排的tcr基因座的v(d)j区。此外，使用dna代替rna进行tcr基因分析可能会高估tcr库的多样性，因为只有两个β链中的一个由t细胞表达而另一个基因是沉默的(等位基因排斥)。第三种tcr扩增方法基于5'-racepcr技术(人类tcra/b分析试剂盒，宝生物克隆技术公司(takara-clontech))。在该方法中，在逆转录步骤期间核酸衔接子被添加到cdna的5'端。结果，随后可以用单一引物对扩增tcr产物，其中一个引物在cdna的5'端与衔接子结合，第二引物在cdna的3'端附近与恒定区结合。该技术的缺点之一是扩增步骤将产生范围在500bp和600bp之间的pcr片段。由于v区段的长度超过400bp，所以实际上不可能使用测序技术从5'端开始对v(d)j接合点进行测序，该测序技术仅可以产生高达300bp的测序读数。因此，通常从恒定区开始，穿过j区段、cdr3区域和v区段的一部分，执行v/j接合点的测序。然而，测序错误随着测序读数的长度而增加，因此测序错误最常引入v区段-由于不同v区段之间的高同源性而对于正确分配最具挑战性的区域。因此，从恒定区开始的测序可能导致可以明确鉴定的v区段的数量减少。虽然通过配对末端测序可以避免这种警告，但是这种方案的修改将显著增加与该方法相关的持续时间和成本。技术实现要素：由于目前的每种方法都存在明显的缺点，因此非常需要一种提供高灵敏度和可靠性的tcr库数据的tcr测序技术。本文公开了用于对t细胞受体库和其他免疫细胞库(例如b细胞库)进行测序的、具有高灵敏度和可靠性的方法和试剂盒。在一个实施例中，所述方法包括以下步骤：(1)提供来自t细胞的rna；(2)将rna转录为互补rna(crna)；(3)将crna逆转录为cdna，同时向cdna产物的5'端引入共同的衔接子；(4)使用单一引物对扩增cdna；(5)用单一引物对进一步扩增pcr产物，该单一引物对引入用于下一代测序的衔接子，其中第一引物与共同衔接子区结合，并且其中第二引物与tcr基因的恒定区结合；以及(6)对pcr产物进行测序。在一个实施例中，所述方法包括以下步骤：(1)提供来自t细胞的rna；(2)将rna逆转录为cdna；(3)产生第二链cdna，同时向cdna产物的5'端引入共同的衔接子；(4)使用单一引物对扩增cdna；(5)用单一引物对进一步扩增pcr产物，该单一引物对引入用于下一代测序的衔接子，其中第一引物与共同衔接子区结合，并且其中第二引物与tcr基因的恒定区结合；以及(6)对pcr产物进行测序。这些实施例也被称为seqtr(测序t细胞受体)方法。本文还提供了包含用于对t细胞受体库进行测序的引物混合物的试剂盒。提供了用于对b细胞受体库进行测序的类似方法和试剂盒。根据一个方面，提供了用于对免疫细胞受体基因进行测序的方法。所述方法包括(1)提供来自免疫细胞的rna；(2)(a)任选地将所述rna转录为互补rna(crna)，然后使用一个或多个包含第一衔接子序列的引物将crna逆转录为互补dna(cdna)，其中通过逆转录产生的cdna的每个5’端含有所述第一衔接子序列；(2)(b)如果没有进行步骤(2)(a)，则将所述rna逆转录为互补dna(cdna)，然后使用一个或多个包含第一衔接子序列的引物将cdna转录为第二链cdna，其中将cdna转录为第二链cdna而产生的cdna的每个5’端含有所述第一衔接子序列；(3)使用第一引物对扩增cdna以产生第一扩增产物，所述第一引物对包含与第一衔接子序列杂交的第一引物和与免疫细胞受体基因的恒定区杂交的第二引物；(4)使用第二引物对扩增第一扩增产物以产生第二扩增产物，其中(i)第二引物对的第一引物在第二扩增产物的5’端与衔接子序列结合，(ii)第二引物对的第二引物与第二扩增产物中的免疫细胞受体基因的恒定区结合，并且(iii)第一和第二引物包含用于测序的衔接子序列；以及(5)对第二扩增产物进行测序。在一些实施例中，逆转录步骤产生150-600bp的pcr产物。在一些实施例中，免疫细胞受体基因是t细胞受体(tcr)基因或b细胞受体(bcr)基因。在一些实施例中，用于逆转录(步骤(2)(a))或第二链cdna合成(步骤(2)(b))的一种或多种引物与tcrα链v区段杂交。在一些实施例中，用于逆转录(步骤(2)(a))或第二链cdna合成(步骤(2)(b))的一种或多种引物包括seqidno:1-50或seqidno:261-310中的一个或多个。在一些实施例中，用于逆转录(步骤(2)(a))或第二链cdna合成(步骤(2)(b))的一种或多种引物与tcrβ链v区段杂交。在一些实施例中，用于逆转录(步骤(2)(a))或第二链cdna合成(步骤(2)(b))的一种或多种引物包括seqidno:51-100或seqidno:311-360中的一个或多个。在一些实施例中，用于逆转录(步骤(2)(a))或第二链cdna合成(步骤(2)(b))的一种或多种引物与tcrγ链v区段杂交。在一些实施例中，用于逆转录(步骤(2)(a))或第二链cdna合成(步骤(2)(b))的一种或多种引物与tcrδ链v区段杂交。在一些实施例中，用于逆转录(步骤(2)(a))或第二链cdna合成(步骤(2)(b))的一种或多种引物与bcr重链v区段杂交。在一些实施例中，用于逆转录(步骤(2)(a))或第二链cdna合成(步骤(2)(b))的一种或多种引物与bcr轻链v区段杂交。在一些实施例中，用于逆转录(步骤(2)(a))或第二链cdna合成(步骤(2)(b))的一种或多种引物包含核苷酸条形码序列。在一些实施例中，核苷酸条形码包含6至20个核苷酸。在一些实施例中，核苷酸条形码由9个核苷酸组成。在一些实施例中，核苷酸条形码由序列nnnntnnnn、nnnnannnn或hhhhhnnnn组成。在一些实施例中，用于逆转录(步骤(2)(a))或第二链cdna合成(步骤(2)(b))的一种或多种引物的第一衔接子序列包含t7衔接子或衔接子。在一些实施例中，免疫细胞是t细胞，并且其中第一引物对的第二引物与tcr基因的恒定区杂交。在一些实施例中，免疫细胞是b细胞，并且其中第一引物对的第二引物与bcr基因的恒定区杂交。在一些实施例中，测序是下一代测序。在一些实施例中，来自免疫细胞的rna通过在rna提取之前将免疫细胞与载体细胞混合来获得。在一些实施例中，免疫细胞是肿瘤浸润淋巴细胞。在一些实施例中，免疫细胞是cd4或cd8阳性t细胞。在一些实施例中，免疫细胞在rna提取之前从外周血单核细胞(pbmc)中纯化出来。在一些实施例中，免疫细胞是pbmc混合物的一部分。在一些实施例中，免疫细胞来源于哺乳细胞。在一些实施例中，该哺乳动物是人或小鼠。根据另一方面，提供了用于对t细胞受体进行测序的试剂盒。所述试剂盒包含至少一个引物，该引物包含seqidno:1-50或seqidno:261-310中任一个的tcrα链v区段部分和条形码序列。在一些实施例中，所述试剂盒包含至少一个引物，该引物包含seqidno:1-50或seqidno:261-310中的任一个。根据另一方面，提供了用于对t细胞受体进行测序的试剂盒。所述试剂盒包括至少一个引物，该引物包含seqidno:51-100或seqidno:311-360中任一个的tcrβ链v区段部分和条形码序列。在一些实施例中，所述试剂盒包含至少一个引物，该引物包含seqidno:51-100或seqidno:311-360中的任一个。参考以下说明书、所附权利要求书和附图，将更好地理解本发明的这些和其他特征、方面和优点。附图说明图1显示了t细胞受体的α链和β链中(可变)v区域、多样性(d)区域、连接(j)区域和恒定(c)区域的排列。本图出自murphy,k.,travers,p.,walport,m.,以及janeway,c.(2012).janeway’simmunobiology[詹韦免疫生物学].纽约:garlandscience[加兰科学]。图2是过去使用的三种不同tcr测序技术的说明。图3提供了使用tcrα链作为实例的seqtr方法的概述。每个条形代表一个tcrα链基因。在rna和crna分子中，区段的顺序从左到右是：v区段、j区段和恒定区。条形码区域被添加到cdna分子中的v区段的左侧，并且t7衔接子区被添加到条形码的左侧(也通过pcr1和pcr2步骤中的t7引物扩增进行表示)。测序衔接子在pcr2步骤中被添加到分子的5’端和3’端，如最后一组分子所示。图4展示了seqtr方法的灵敏度。分别将10^6、10^5、10^4、10^3或0个cd8阳性t细胞与5×10^4个3t3细胞混合。提取rna并进行转录、逆转录和一轮扩增(步骤2-4，参见具体实施方式)。将得到的pcr产物在琼脂糖凝胶上分离，并用溴化乙锭显色。图5展示了seqtr方法的特异性。分别将10^6、10^5、10^4、10^3或0个cd8阳性t细胞与5×10^4个3t3细胞混合。提取rna并进行seqtr方法。显示了分别与真实tcr基因相关或不相关的测序读数的百分比。图6展示了tcr基因的明确鉴定，这是seqtr方法的一个特征。将5×10^4个3t3细胞分别与10^6、10^5、10^4、10^3或0个cd8阳性细胞混合。分离每种混合物中的rna，并进行seqtr方法。从数据集中移除与tcr基因不相关的读数。对于剩余的读数，显示了分别可以或不可以明确地分配给特定v区段或j区段的读数的百分比。图7展示了seqtr方法的线性。将编码已知tcr序列的固定量的dna以不同浓度稀释到代表原初cd8t细胞库的dna混合物中。使用seqtr方法对各个混合物的tcr库进行测序。将观察到的整个库中已知tcr序列的频率相对于各自的tcr基因稀释度作图。图8展示了seqtr方法的重复性。使用seqtr方法，以两个独立的技术重复，对来自一个生物样品的tcr库进行测序。确定tcrβ链中每个v-j重排/组合的频率，并在两个重复之间进行比较。每个球体代表单个v-j重排，球体大小表示特定v-j重组的相对频率。灰色球体表示在两个重复中检测到的相对频率相差小于两倍的重排。黑色球体表示在两个重复中检测到的相对频率相差大于两倍的重排。图9a-9c展示了使用seqtr方法的三个不同tcr库测序数据集的多样性。图9a，从外周血单核细胞(pbmc)分离cd8阳性t细胞；图9b，另外使用与新表位tedymihii(seqidno:236)缀合的四聚体对其进行纯化；或图9c，另外使用与新表位(与图9b相同)缀合的四聚体对其进行纯化，随后在体外扩增。使用seqtr方法对各个样品的tcr库进行测序，并对所有观察到的v/j重排/组合的相对频率进行作图。图10a-10c展示了使用单细胞克隆方法鉴定的tcr和使用seqtr方法鉴定的tcr的重叠。图10a：从pbmc分离t细胞，并使用与新表位tedymihii(seqidno:236)缀合的四聚体进行另一轮纯化。然后通过荧光激活细胞分选法(facs)对得到的细胞群进行分选。对一半分选的细胞进行seqtr方法以对tcr库进行测序。对于另一半细胞，分离单个t细胞克隆并在体外扩增(单细胞克隆)。一旦克隆建立，就扩增每个t细胞克隆的tcr基因并使用经典的桑格(sanger)测序进行测序。图10b：该表显示了使用单细胞克隆方法鉴定的所有六种tcr。序列从上到下分别对应于seqidno:237至242。图10c：该表显示了使用seqtr方法鉴定的八种最常见的tcr。序列从上到下分别对应于seqidno:243至250。图11展示了使用适应性生物技术公司(adaptivebiotechnology)提供的tcr测序服务获得的不同样品的读数。每个样品所要求的读数为200,000个读数。x轴上的数字表示对来自16个不同患者的样品的分析。针对每个样本，从左到右的柱表示来自以下各项的读数：肿瘤；基质(肿瘤周围的组织)；用四聚体染色并从肿瘤样品通过facs分选出的表位特异性til(肿瘤浸润淋巴细胞)(tet)；以及来自已植入小鼠体内的一块肿瘤的、四聚体分选的til(mtet)。图12展示了使用seqtr方法的步骤2到4，对来自作为pbmc混合物的一部分的t细胞(上图)或来自分离的cd4阳性t细胞(下图)的tcr基因进行的扩增。具体实施方式鉴于现有测序tcr技术的缺点，确定了提供最可靠的tcr库数据的tcr测序技术包括以下特征：1)tcr基因的扩增是线性的，并且不使用多重pcr，因此避免了某些tcr序列的人工过度表达；2)该方法基于rna而不是dna，因此仅提供经历重排并且实际上在t细胞中表达的tcr序列的数据；3)tcr基因从5'端开始测序，提供高质量的测序数据，因此最大化地进行高度同源v区段的可靠和明确鉴定；4)测序数据包括高度可变的cdr3区域，因此有助于明确鉴定tcr序列。所公开的方法、系统和试剂盒满足所有这些标准。这些相同的特征用于对来自其他免疫细胞(例如b细胞)的受体进行测序。在一些实施例中，免疫细胞受体测序方法包括以下步骤：(1)提供总rna(rna)作为起始材料；(2)(a)将rna转录为互补rna(crna)，然后使用在cdna产物的5'端引入共同衔接子的引物，将crna逆转录为cdna；(2)(b)如果没有进行步骤(2)(a)，则将rna逆转录为互补dna(cdna)，然后使用一个或多个包含第一衔接子序列的引物将cdna转录为第二链cdna，其中将cdna转录为第二链cdna而产生的cdna的每个5’端含有所述第一衔接子序列；(3)使用单一引物对扩增cdna产物；(4)使用单一引物对扩增步骤4的pcr产物，其中：i.引物引入了用于下一代测序的衔接子，并且ii.第一引物与pcr产物5’端的共同衔接子区结合，并且iii.第二引物结合pcr产物的一个区域，该区域构成待测序的tcr的恒定区；以及(5)对步骤4中产生的pcr产物进行测序。待测序的遗传信息待测序的遗传信息是免疫细胞受体基因。在本发明的一些实施例中，待测序的遗传信息包括t细胞受体基因。在一些实施例中，被测序的tcr基因编码tcrα链或tcrβ链。在其他实施例中，被测序的tcr基因编码tcrδ链或tcrγ链。在本发明的其他一些实施例中，待测序的遗传信息包括b细胞受体(bcr)基因。起始材料(步骤1)将rna从免疫细胞中分离并用于通过体外转录来产生互补rna(crna)。这与现有的tcr测序技术形成对比，现有的tcr测序技术使用dna或互补dna(cdna)作为遗传起始材料。在一些实施例中，在rna提取之前，从外周血单核细胞中分离出从其获得rna的免疫细胞。在一些实施例中，所述免疫细胞是t细胞或b细胞。在一些实施例中，从其获得rna的t细胞表达cd4或cd8。通过转录产生crna(步骤(2)(a))通过体外转录产生互补rna(crna)。可以使用任何用于进行分子生物学技术人员已知的体外转录的方法。在一些实施例中，步骤2中的体外转录使用市售试剂盒进行，例如可从赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific)获得的ambiontm试剂盒。逆转录(步骤(2)(a))进行crna的逆转录以产生互补dna(cdna)。使用分子生物学技术人员已知的方法来将crna逆转录为cdna。通常，此类方法包括使用逆转录酶和适当的核苷酸、盐和缓冲液，使引物与crna分子的3'端杂交，以及从杂交的引物开始产生dna。用于逆转录反应的引物的选择对于以高度确定性区分同源但不同的免疫细胞受体序列的能力是重要的，并且其允许从5'端缩短v区段，产生大小为250-300bp的pcr产物。pcr产物的这种大小范围对于下一代测序是最佳的。在一些实施例中，用于逆转录的引物被设计为结合在tcr基因的v区段内(参见图3)。例如，逆转录引物被设计为足够接近v(d)j接合点，以便得到的测序数据覆盖v区段和j区段的cdr3，但设计为足够远离v(d)j接合点以允许区分不同的v区域。在本发明的一些实施例中，使用一组优选的引物(参见，例如，表2和表4、以及表8和表9中的序列)。由于不同v区段之间的高度同源性，表2和表4(以及表8和表9)中描述的一些引物与多于一个v区段结合(参见表3和表5；引物seqidno:1-100和seqidno:261-360的各个v区段中的结合位点示于表15和表16中)。然而，对表2和表4中列出的引物的设计(表8和表9同理)仍然允许基于引物结合位点下游的v区段之间的差异明确分配/鉴定各个v区段。在本发明的一个替代性实施例中，只有优选引物seqidno:1-100和seqidno:261-360的一部分可用于逆转录。在本发明的又另一个实施例中，当与具有seqidno:1-100和seqidno:261-360的引物相比时，可以使用与v区段中的不同区域结合的引物组。例如，一个或多个引物的结合位点可以朝tcr基因的cdr3区域移动。由于v区段之间的高度同源性，引物结合位点在tcr基因的cdr3区域的方向上移动得越远，在多于一个v区段存在的情况下所得的测序数据一致的可能性越大。虽然在这些情况下，各个v区段不能被明确地分配或鉴定，但是样本中可能存在的v/j区段的数量通常可以缩小到小的子集。根据这种应用，这种有限的信息对实验者来说已经是有价值的。在本发明的另一个实施例中，与引物seqidno:1-100和seqidno:261-360的结合位点相比，一个或多个引物的结合位点可以朝v区段的5'端移动。许多下一代测序技术产生150bp长的测序读数。因此，引物结合位点朝v区段的5'端移动得越远，相应的j区段(可在所得测序读数的3'端找到)无法被明确鉴定的概率越大。然而，通过使用产生>150bp读数的替代测序技术可以避免这个问题。在一些实施例中，步骤(2)(a)中使用的引物另外含有独特的条形码。在扩增前，每种rna分子的这种条形码可用于校正获得的pcr测序结果和测序错误。在一些实施例中，用于该逆转录步骤的引物在所得pcr产物的5'端引入共同的t7衔接子。然而，替代性衔接子序列是可能的，包括但不限于衔接子和表1中列出的序列。表1可用于代替t7衔接子序列的替代性核苷酸衔接子的实例逆转录(步骤(2)(b))进行rna的逆转录以产生互补dna(cdna)。使用分子生物学技术人员已知的方法来将rna逆转录为cdna。通常，此类方法包括使用逆转录酶和适当的核苷酸、盐和缓冲液，使引物与rna分子的3'端杂交，以及从杂交的引物开始产生dna。将cdna转录为第二链cdna(步骤(2)(b))在产生cdna后，使用分子生物学技术人员已知的方法合成第二链cdna。通常，此类方法包括使用聚合酶和适当的核苷酸、盐和缓冲液，使引物与cdna分子的3'端杂交，以及从杂交的引物开始产生第二链cdna。用于第二链合成反应的引物的选择是步骤(2)(b)，如上关于步骤(2)(a)中的逆转录所述。引物的选择对于以高度确定性区分同源但不同的免疫细胞受体序列的能力是重要的，并且其允许从5'端缩短v区段，产生大小为250-300bp的pcr产物。pcr产物的这种大小范围对于下一代测序是最佳的。扩增(步骤3)cdna的扩增通过任何众所周知的扩增反应进行，例如聚合酶链式反应(pcr)。使用分子生物学技术人员已知的方法来扩增cdna或其部分(例如，如图3所描绘)。通常，此类方法包括使用聚合酶和适当的核苷酸、盐和缓冲液，使引物对与cdna分子杂交，以及扩增在杂交的引物之间的dna序列。在一些实施例中，用于扩增步骤的引物对的第一引物与步骤3中产生的cdna产物的共同衔接子区结合，并且该引物对的第二引物与cdna产物的一个区域结合，该区域构成待测序的tcr的恒定区(见图3)。值得注意的是，并非所有设计用于靶向tcr基因恒定区的反向引物在该反应中都表现得同样良好。例如，表7中列出的引物均未能用所选的t75'衔接子提供良好的扩增。因此，在某些实施例中，表6中列出的引物用于该扩增步骤。扩增(步骤4)进行第二个扩增步骤以向扩增的分子添加额外的序列，例如可用于下游dna测序反应的序列。在本发明的一些实施例中，该步骤中使用的引物添加用于测序的合适的衔接子。测序(步骤5)使用本文描述的或本领域已知的各种合适的测序方法从样品内的核酸分子的扩增序列获得序列信息。例如，可以在本文公开的方法中使用的测序方法包括：经典的桑格测序、大规模平行测序、下一代测序、聚合酶克隆测序、454焦磷酸测序、测序、测序、solidtm测序、离子半导体测序、dna纳米球测序、heliscope单分子测序、单分子实时测序、纳米孔dna测序、隧穿电流dna测序、杂交测序、质谱测序、微流体桑格测序、基于显微镜的测序、rna聚合酶测序、体外病毒高通量测序、马克萨姆-吉尔伯特(maxam-gilbert)测序、单末端测序、配对末端测序、深度测序、和/或超深度测序。定义如本文所公开的，提供了许多数值的范围。应理解，范围的上限和下限之间的每个中间值(至下限的单位的十分之一，除非上下文另有清楚规定)也被具体公开。所陈述范围内的任何陈述值或中间值以及该陈述范围内的任何其他陈述值或中间值之间每个较小的范围涵盖在本发明之内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在所述范围内或排除在其外，并且每个范围(其中两个极限之一、没有一个、或都包括在所述较小的范围内)也包括在本发明内，服从所陈述范围中任何特别排除的限值。在所陈述的范围包括一个或两个限值的情况下，排除了那些被包括的限值的任一个或两者的范围也被包括在本发明之内。如本文所用，“引物”是与互补(包括部分互补)多核苷酸链杂交的核酸分子。引物可以是dna分子、rna分子、或者dna或rna类似物。dna或rna类似物可以由核苷酸类似物合成。实例实例1：使用t7和trueseq衔接子的seqtr方法的示例性方案在两个独立的反应中对tcrα和β链基因进行测序。1)起始材料和rna提取为了在提取中获得足够量的rna，使用最少500,000个t细胞作为起始材料。可替代地，特别是在可获得较少t细胞的情况下，将t细胞与充当载体的50,000个小鼠3t3细胞混合。使用来自凯杰公司(qiageninc.)的微试剂盒，根据生产商的说明提取t细胞rna，并进行以下修改：用预热至50℃的20μl水进行洗脱。使用片段分析仪验证rna质量和数量。2)通过体外转录(ivt)合成crna：使用来自(赛默飞世尔科技公司)的messageamptmiiarna扩增试剂盒进行分离的rna的体外转录，该试剂盒包含酶、缓冲液以及进行第一和第二链cdna及体外转录所需的核苷酸。该试剂盒还提供了cdna和crna纯化所需的所有柱和试剂。根据制造商的说明进行rna扩增，并进行以下修改：1)使用0.5和1μg之间的总rna作为起始材料。2)ivt以40μl的终体积进行，并在37℃下孵育16h。使用nanodroptm分光光度计(赛默飞世尔科技公司)通过吸光度定量纯化的crna。3)通过逆转录合成cdna：用来自invitrogen(赛默飞世尔科技公司)的iii进行crna的逆转录。该试剂盒提供反应所需的酶、缓冲液和二硫苏糖醇(dtt)。脱氧核苷酸(dntp)和核糖核酸酶抑制剂购自普洛麦格公司(promega)。用于逆转录的引物的序列可以在表2(用于测序tcrα链基因的引物)和表4(用于测序tcrβ链基因的引物)中找到。将500ngcrna用作逆转录的起始材料。将crna与1μlhtrav或htrbv引物混合物(各2μm)和1μldntp(25mm)混合，最终体积为13μl。首先将该混合物在70℃下孵育10min，然后在50℃下孵育30s。向该混合物中添加4μl5x缓冲液、1μldtt(100mm)、1μlsuperscriptiii和1μl随后将样品在55℃下孵育1h，然后在85℃下孵育5min。cdna合成后，将1μg无dna酶的rna酶(罗氏公司(roche))添加到cdna中，并在37℃下孵育30min以除去crna。4)tcr基因扩增：使用高保真dna聚合酶(新英格兰生物实验室(newenglandbiolabs))在以下条件下进行tcr基因扩增：pcr混合物：来自步骤3的1μlcdna、1μldntp(25mm)、1μl引物混合物(各10μm，参见表5)、5μl5x缓冲液和0.2μl酶，总体积为25μl。pcr条件：-94℃持续5min-20至30个如下循环ο98℃持续10sο55℃持续30sο72℃持续30s-72℃持续2min根据生产商的说明，从琼脂糖凝胶(使用来自凯杰公司的qiaquick凝胶提取试剂盒)或使用pcr产物清洁试剂盒(昂飞公司)来纯化pcr产物。5)添加下一代测序衔接子：通过使用高保真dna聚合酶(新英格兰生物实验室)的pcr来添加测序衔接子。将来自步骤4的1/3的纯化pcr产物与0.5μldntp(25mm)、1μl引物混合物(各10μm，参见表8)、5μl5x缓冲液和0.2μl酶混合，总体积为25μl。pcr条件：-94℃持续5min-执行12个如下循环：ο98℃持续10sο55℃持续30sο72℃持续30s-72℃持续2min6)tcr库纯化：根据制造商的说明，使用pcr产物清洁试剂盒(昂飞公司(affymetrix))或者ampurexp珠粒(贝克曼库尔特公司(beckmancoulter))纯化来自步骤5的10μlpcr产物。然后样品可以直接用于测序。表2用于扩增tcrα链v区段的优选引物序列。n可以是任何核苷酸。该表中列出的引物序列由三个部分组成(从5'至3’列出)：t7衔接子、条形码和tcrα链v区段。表3由用于扩增tcrα链v区段的每个引物靶向的v区段。表4用于扩增tcrβ链v区段的优选引物序列。n可以是任何核苷酸。该表中列出的引物序列由三个部分组成(从5'至3’列出)：t7衔接子、条形码和tcrβ链v区段。表5由用于扩增tcrβ链v区段的每个引物靶向的v区段。表6用于tcr基因扩增的引物。用于测序tcrα基因的引物对：seqidno101和102。用于测序tcrβ基因的引物对：seqidno101和103。表7用于tcr基因扩增、未导致pcr产物成功扩增的反向引物。表8用于添加下一代测序衔接子的引物。对应于衔接子(正向和反向)的引物部分在下面显示的正向和反向引物中加下划线。用于测序tcrα基因的引物对：seqidno:114和115。用于测序tcrβ基因的引物对：seqidno:114和116。实例2：使用nextera衔接子的seqtr方法的示例性方案在两个独立的反应中对tcrα和β链基因进行测序。1)起始材料和rna提取为了在提取中获得足够量的rna，使用最少500,000个t细胞作为起始材料。可替代地，特别是在可获得较少t细胞的情况下，将t细胞与充当载体的50,000个小鼠3t3细胞混合。使用来自凯杰公司的微试剂盒，根据生产商的说明提取t细胞rna，并进行以下修改：用预热至50℃的20μl水进行洗脱。使用片段分析仪验证rna质量和数量。2)通过体外转录(ivt)合成crna：使用来自(赛默飞世尔科技公司)的messageamptmiiarna扩增试剂盒进行分离的rna的体外转录，该试剂盒包含酶、缓冲液以及进行第一和第二链cdna及体外转录所需的核苷酸。该试剂盒还提供了cdna和crna纯化所需的所有柱和试剂。根据制造商的说明进行rna扩增，并进行以下修改：1)使用0.5和1μg之间的总rna作为起始材料。2)ivt以40μl的终体积进行，并在37℃下孵育16h。使用nanodroptm分光光度计(赛默飞世尔科技公司)通过吸光度定量纯化的crna。3)通过逆转录合成cdna：用来自invitrogen(赛默飞世尔科技公司)的iii进行crna的逆转录。该试剂盒提供反应所需的酶、缓冲液和二硫苏糖醇(dtt)。脱氧核苷酸(dntp)和核糖核酸酶抑制剂购自普洛麦格公司。用于逆转录的引物的序列可以在表9(用于测序tcrα链基因的引物)和表10(用于测序tcrβ链基因的引物)中找到。将500ngcrna用作逆转录的起始材料。将crna与1μlhtrav或htrbv引物混合物(各2μm)和1μldntp(25mm)混合，最终体积为13μl。首先将该混合物在70℃下孵育10min，然后在50℃下孵育30s。向该混合物中添加4μl5x缓冲液、1μldtt(100mm)、1μlsuperscriptiii和1μl随后将样品在55℃下孵育1h，然后在85℃下孵育5min。cdna合成后，将1μg无dna酶的rna酶(罗氏公司)添加到cdna中，并在37℃下孵育30min以除去crna。4)tcr基因扩增：使用高保真dna聚合酶(新英格兰生物实验室)在以下条件下进行tcr基因扩增：pcr混合物：来自步骤3的1μlcdna、0.4μldntp(10mm)、0.4μl引物混合物(20μmnextera5'、10μm反向pcr引物1trav或2.5μm反向引物pcr1trbv，参见表11)、2μl5x缓冲液和0.2μl酶，总体积为10μl。pcr条件：-94℃持续5min-20个如下循环ο98℃持续10sο55℃持续30sο72℃持续30s-72℃持续2min根据制造商的说明，使用1μl的pcr产物清洁试剂盒(昂飞公司)纯化pcr产物。5)添加下一代测序衔接子：通过使用高保真dna聚合酶(新英格兰生物实验室)的pcr来添加测序衔接子。将以下混合物添加至11μlpcr1中：1μldntp(10mm)、1μl引物混合物(各1.25μm，参见表12)、3μl5x缓冲液和0.2μl酶以及9.8μl的h2o。pcr条件：-94℃持续5min-执行25个如下循环：ο98℃持续10sο55℃持续30sο72℃持续30s-72℃持续2min6)tcr库纯化：根据制造商的说明，使用ampurexp珠粒(贝克曼库尔特公司)纯化来自步骤5的10μlpcr产物。然后样品可以直接用于测序。表9用于扩增tcrα链v区段的优选引物序列。n可以是任何核苷酸。该表中列出的引物序列由三个部分组成(从5'至3’列出)：t7衔接子、条形码和tcrα链v区段。表10用于扩增tcrβ链v区段的优选引物序列。n可以是任何核苷酸。该表中列出的引物序列由三个部分组成(从5'至3’列出)：t7衔接子、条形码和tcrβ链v区段。表11用于tcr基因扩增的引物。用于测序tcrα基因的引物对：seqidno:256和257。用于测序tcrβ基因的引物对：seqidno:256和258。对应于衔接子(正向和反向)的引物部分在下面显示的反向引物中加下划线。表12用于将完整的nextera序列添加到tcrα和tcrβ的引物。实例3：不具有体外转录的seqtr方法的示例性方案在两个独立的反应中对tcrα和β链基因进行测序。1)起始材料和rna提取为了在提取中获得足够量的rna，使用最少500,000个t细胞作为起始材料。可替代地，特别是在可获得较少t细胞的情况下，将t细胞与充当载体的50,000个小鼠3t3细胞混合。使用来自凯杰公司的微试剂盒，根据生产商的说明提取t细胞rna，并进行以下修改：用预热至50℃的20μl水进行洗脱。使用片段分析仪验证rna质量和数量。2)通过逆转录合成cdna：用来自invitrogen(赛默飞世尔科技公司)的iii和寡d(t)进行rna的逆转录。该试剂盒提供反应所需的酶、缓冲液和二硫苏糖醇(dtt)。脱氧核苷酸(dntp)、寡d(t)和核糖核酸酶抑制剂购自普洛麦格公司。将500ng的rna用作逆转录的起始材料。将rna与1μl的寡d(t)和1μldntp(25mm)混合，总体积13μl。首先将该混合物在70℃下孵育10min，然后在50℃下孵育30s。向该混合物中添加4μl5x缓冲液、1μldtt(100mm)、1μlsuperscriptiii和1μl随后将样品在55℃下孵育1h，然后在85℃下孵育5min。3)第二链cdna合成：使用cdna合成第二条链，使用高保真dna聚合酶(新英格兰生物实验室)在以下条件下进行：混合：来自步骤2的20μlcdna、4μldntp(10mm)、2μltrav引物混合物(表9)、2μltrbv引物混合物(表10)、20μl5x缓冲液、1μl酶，总体积为100μl。合成条件：-98℃持续5min-40℃持续30s-72℃持续5min4)cdna纯化：根据制造商的说明，使用ampurexp珠粒(贝克曼库尔特公司)纯化来自步骤3的100μlcdna产物。5)tcr基因扩增：使用高保真dna聚合酶(新英格兰生物实验室)在以下条件下进行tcr基因扩增：pcr混合物：来自步骤4的7μlcdna、0.4μldntp(10mm)、0.4μl引物混合物(20μmnextera5'，10μm反向pcr引物1trav或2.5μm反向引物pcr1trbv，参见表11)、2μl5x缓冲液和0.2μl酶，总体积为10μl。pcr条件：-94℃持续5min-20个如下循环ο98℃持续10sο55℃持续30sο72℃持续30s-72℃持续2min根据制造商的说明，使用1μl的pcr产物清洁试剂盒(昂飞公司)纯化pcr产物。6)添加下一代测序衔接子：通过使用高保真dna聚合酶(新英格兰生物实验室)的pcr来添加测序衔接子。将以下混合物添加至11μlpcr1中：1μldntp(10mm)、1μl引物混合物(各1.25μm，参见表12)、3μl5x缓冲液和0.2μl酶以及9.8μl的h2o。pcr条件：-94℃持续5min-执行25个如下循环：ο98℃持续10sο55℃持续30sο72℃持续30s-72℃持续2min7)tcr库纯化：根据制造商的说明，使用ampurexp珠粒(贝克曼库尔特公司)纯化来自步骤5的10μlpcr产物。然后样品可以直接用于测序。实例4：tcr测序方法的灵敏度tcr测序的挑战之一是每个t细胞克隆的少量的遗传物质。在许多情况下，可以从给定实验中回收的t细胞数量太少，研究人员无法直接提取足够量的rna用于随后的tcr基因扩增。在这类情况下，目的t细胞可以与充当载体的3t3小鼠细胞混合。将5×10^4个3t3细胞分别与10^6、10^5、10^4、10^3或0个cd8阳性细胞混合。分离每种混合物的rna，并进行上述seqtr方法的步骤2至4(参见具体实施方式)。在琼脂糖凝胶上分离pcr产物，并使其可视化。在仅含有3t3细胞的样品中未观察到tcr特异性pcr产物(参见图4)。但是，在所有其他样本中都检测到tcr特异性条带：增加样品中cd8阳性t细胞的量与增加tcr特异性pcr产物的量和降低非特异性二聚体引物条带的强度相关。这些数据表明seqtr方法足够灵敏，可以从少至1,000个t细胞扩增tcr基因，而没有来自3t3载体细胞的可检测背景信号。实例5：seqtr方法的特异性tcr测序的另一个挑战是缺乏来自复杂样品的tcr基因的特异性扩增。竞争性tcr测序技术(例如适应性生物技术公司提供的服务)的特征在于高达90％的非特异性扩增。结果，只有少至所有测序数据的10％为tcr库确定提供了信息，这增加了任何旨在对tcr库进行测序的项目的成本和持续时间。将5×10^4个3t3细胞分别与10^6、10^5、10^4、10^3或0个cd8阳性细胞混合。使用seqtr方法对各个样品的tcr库进行测序，并确定分别对应于tcr序列或非tcr序列的读数百分比。如图5所示，所有测序读数的93％-97％确实对应于tcr基因，与用作起始材料的t细胞的量无关。总之，这些数据表明即使使用少至1,000个t细胞作为起始材料，使用seqtr方法进行的tcr扩增也具有高度特异性。实例6：tcr基因的明确鉴定在人类中，tcr基因座包含tcrα链的54个不同的v区段和tcrβ链的65个不同的v区段。然而，这些v区段中的许多区段是高度同源的。因此，tcr测序的重大挑战之一是成功地区分具有高度同源性的两个或更多个tcr基因区段。例如，根据tcr基因扩增中使用的引物的选择和产生的pcr产物的长度，得到的测序数据可能与多于一个v区段或j区段相容(换句话说，两个或更多个tcrv区段或j区段在测序区域中显示100％同源性)。在这些情况下，不能明确地分配/鉴定特定读数的tcr基因。将5×10^4个3t3细胞分别与10^6、10^5、10^4、10^3或0个cd8阳性细胞混合。分离每种混合物的rna，并进行tcr测序方法。在鉴定为tcr基因的所有测序读数中，评估是否可以明确地鉴定v区段或j区段。数据显示，即使使用少至1,000个t细胞作为遗传起始材料，所有tcr测序读数的95％至97％也可被分配给特定的tcr区段(参见图6)。总之，数据证明了seqtr方法的稳健性，因为一旦除去非特异性序列和不明确的tcr序列，全部读数的90％至93％都可用于鉴定tcr序列。由于v区段之间的同源性，有时清楚地鉴定tcr序列是困难的。不能区分htrbv6-2和htrbv6-3，因为它们具有100％同源性，因此将编码相同的tcr。htrbv12-3和htrbv12-4，由于它们的序列，不能用本文公开的方法区分。只有能够捕获v区段5'端的配对末端测序才能区分这两个序列。因此，htrbv12-3和htrbv12-4被认为是用于分析该库的独特序列。实例7：tcr基因扩增的线性因为各个tcr序列的非线性扩增可导致最终tcr库中受影响的tcr基因的不正确过度表达或不足表达，所以扩增的线性是tcr测序数据的可靠性和质量的关键决定因素。为了测试我们系统中tcr基因扩增的线性，将编码已知tcr序列的固定量的dna以不同浓度稀释到代表原初cd8库的dna池中。然后使用seqtr分析每个样品的tcr库。然后针对每个稀释度，对整个tcr库中已知tcr序列的观察频率进行测序，并与预期频率进行比较。图7中的散点图显示了稀释度与测序后观察到的库中已知tcr序列的频率之间的极好相关性(r2＝0.99)。这些数据证实了扩增的线性，并表明使用seqtr技术获得的结果是定量的。实例8：seqtr方法的重复性通过从同一样品开始进行两个独立的技术重复来测试该方法的重复性。确定tcrβ链中每个v-j重排的频率，并在两个重复之间进行比较，如图8所示。每个球体代表在这两个重复中检测到的单个v-j重排。每个球体代表单个v-j重排，球体大小表示特定v-j重组的相对频率。灰色球体表示在两个重复中检测到的相对频率相差小于两倍的重排。黑色球体表示在两个重复中检测到的相对频率相差大于两倍的重排。与基因表达数据分析中的常规做法一致，替代之间的差异小于2倍被认为并不重要。数据显示，在两次技术重复之间，只有13％的所有v-j重排显示出显著的频率差异超过两倍(参见图8的上图)。然而，如图8所示，在技术重复之间显著不同的v-j重组表达相当差，如小尺寸的黑色球体所示。因此，如果考虑单个v-j重排的频率，则只有0.5％的序列在重复之间显示超过两倍的差异(参见图8的下图)，这证明seqtr方法是非常可重复的。实例9：使用seqtr方法对示例库进行测序在三种不同类型的cd8阳性t细胞上测试seqtr方法：(1)t细胞群1：从外周血单核细胞(pbmc)分离的cd8阳性t细胞。(2)t细胞群2：使用四聚体对群1中的cd8阳性t细胞进行facs分选。四聚体是呈递特定肽的mhc分子，其与荧光染料连接。四聚体结合表达tcr的t细胞，所述tcr特异性识别所述肽。荧光染料允许通过facs分选所需的t细胞。(3)t细胞群3：随后在体外扩增的细胞群2中的cd8阳性t细胞。使用seqtr方法确定每个v-j重排的相对频率(参见图9)。如所预期的，来源于pbmc(群1)的原初tcr库是高度多样化的(参见图9a)。几乎所有可能的v-j重排都在样品中呈现出来，没有单个v-j重排展示出超过11％的频率。四聚体分选的cd8阳性t细胞亚群2(参见图9b)的库与原初库相比具有更小的多样性。整个库中不仅存在较少的v-j重排。此外，两个v-j重排显然占主导地位，显示出超过20％的频率。这些v-j重排代表少数以下t细胞，所述t细胞识别与四聚体缀合的表位tedymihii(seqidno:236)并且在四聚体纯化步骤中富集。最后，四聚体纯化的t细胞的快速克隆扩增(群3)增强了tcr库朝着已经占优势的亚群2的t细胞克隆偏倚。因此，部分低频v-j重排丢失并且不再被检测到(参见图9c)。总之，这些数据表明seqtr方法非常适合区分具有不同程度的多样性的tcr库。实例10：seqtr方法与低通量单细胞克隆的比较为了确定与给定t细胞群中存在的真实tcr库相比，使用seqtr方法获得的tcr库数据有多精确，我们将我们的结果与通过单细胞测序获得的数据进行比较。从pbmc通过facs分选四聚体特异性cd8。将回收的细胞群分成两部分。对一半细胞进行seqtr方法以对tcr库进行测序。对于另一半细胞，分离单个t细胞克隆并在体外扩增(单细胞克隆)。一旦克隆建立，就扩增每个t细胞克隆的tcr基因并使用经典的桑格(sanger)测序进行测序(参见图10a)。在使用单细胞方法测试的42个单个克隆中，可以鉴定出六种不同的tcr(参见图10b)。使用seqtr方法，可以发现116个不同的tcr基因(图10c显示了八个最常被观察到的v-j重排，同时还参见表13和表14)。实际上，使用单细胞克隆技术最常观察到的五种tcr也与应用seqtr方法时最常观察到的五个克隆相一致。总之，用单细胞测序鉴定的所有六个tcr克隆都呈现在seqtr方法中以最高频率观察到的八种tcr中。总之，这些数据表明，seqtr方法产生给定t细胞群的真实tcr库的真实表现。表13使用单细胞测序方法鉴定的tcr克隆的cdr3区域。seqidnocdr3区域237cassrhvggvpeaffg238cassigrgseqyfg239cassdvlsgeaffg240casqghknteaffg241casslgpggvktneklffg242casslgpggvktneklffg表14使用seqtr方法鉴定的116个不同tcr基因中最常观察到的八种v-j重排。实例11：适应性生物技术公司提供的tcr测序服务提供了可反映高达90％的非特异性tcr扩增的测序数据收集来自16名患者的肿瘤样品，并且将肿瘤细胞从周围组织(基质)中分离出来。此外，使用四聚体染色(tet)通过facs从肿瘤样品中分选表位特异性til。最后，将肿瘤细胞移植到人源化小鼠中。一段时间后，收集肿瘤并通过facs分选表位特异性til。对每个样本都进行dna提取。将dna送至适应性生物技术公司进行tcr测序(方法，观察方案：200,000-300,000个读数/样品)。在80％的样品中，方法未能为产生200,000个读数/样品，这表明方法无法产生具有显著可靠性的tcr库。实例12：从pbmc和cd4阳性t细胞扩增tcr基因分别从来自三个独立样品的10^6个pbmc或10^6个cd4阳性t细胞中分离rna。然后将rna进行上述seqtr方法的步骤2至4(参见具体实施方式)。在琼脂糖凝胶上分离pcr产物，并使其可视化(参见图12)。仅观察到tcr特异性条带，这表明seqtr方法不仅可用于cd8阳性t细胞(参见实例7)，还可用于cd4阳性t细胞，甚至还用于作为其他pbmc的复杂混合物的一部分的t细胞。应当将前述实例和对实施例的描述视为说明，而不是限制由权利要求书限定的本发明。如将容易理解的，在不脱离如权利要求书中所阐述的本发明的情况下，可以利用上述特征的许多变化和组合。这些变化不被视为脱离本发明的范围，并且所有这些变化旨在包括在所附权利要求书的范围内。本文引用的所有参考文献均通过引用以其全文并入本文。如本文所述和要求保护的(包括附图中的)，对特定特征(包括方法步骤)作出参考。应理解，本说明书中的本发明的公开内容包括这些特定特征的所有可能组合。例如，在特定方面或实施例、或特定权利要求的上下文中公开了特定特征的情况下，该特征还可以(在可能的范围内)用于其他特定方面和实施例的上下文中和/或与其他特定方面和实施例的上下文组合，以及用于通常所公开的方法、系统和试剂盒中。在本文中对包括两个或更多个确定步骤的方法作出参考的情况下，所确定的步骤能以任何顺序或同时(除非上下文排除了这种可能性)进行，并且该方法可以包括一个或多个其他步骤，这些其他步骤在任何确定的步骤之前、在两个确定的步骤之间、或在所有确定的步骤之后(除非上下文排除了这种可能性)进行。序列表<110>路德维希癌症研究所有限公司（ludwiginstituteforcancerresearchltd.）<120>增强的免疫细胞受体测序方法<130>l0461.70192wo00<140>尚未指定<141>一并同时提交<150>us62/452,409<151>2017-01-31<160>360<170>patentin版本3.5<210>1<211>54<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<220><221>尚未归类的特征<222>(21)..(24)<223>n是a、c、g或t<220><221>尚未归类的特征<222>(26)..(29)<223>n是a、c、g或t<400>1tgtaatacgactcactatagnnnntnnnncttctacaggagctccagatgaaag54<210>2<211>54<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<220><221>尚未归类的特征<222>(21)..(24)<223>n是a、c、g或t<220><221>尚未归类的特征<222>(26)..(29)<223>n是a、c、g或t<400>2tgtaatacgactcactatagnnnntnnnncttttgaaggagctccagatgaaag54<210>3<211>51<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<220><221>尚未归类的特征<222>(21)..(24)<223>n是a、c、g或t<220><221>尚未归类的特征<222>(26)..(29)<223>n是a、c、g或t<400>3tgtaatacgactcactatagnnnntnnnntgctcatcctccaggtgcggga51<210>4<211>52<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<220><221>尚未归类的特征<222>(21)..(24)<223>n是a、c、g或t<220><221>尚未归类的特征<222>(26)..(29)<223>n是a、c、g或t<400>4tgtaatacgactcactatagnnnntnnnngaagaaaccatctgcccttgtga52<210>5<211>54<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<220><221>尚未归类的特征<222>(21)..(24)<223>n是a、c、g或t<220><221>尚未归类的特征<222>(26)..(29)<223>n是a、c、g或t<400>5tgtaatacgactcactatagnnnntnnnncctgccccgggtttccctgagcgac54<210>6<211>52<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<220><221>尚未归类的特征<222>(21)..(24)<223>n是a、c、g或t<220><221>尚未归类的特征<222>(26)..(29)<223>n是a、c、g或t<400>6tgtaatacgactcactatagnnnntnnnntctctgcgcattgcagacaccca52<210>7<211>52<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<220><221>尚未归类的特征<222>(21)..(24)<223>n是a、c、g或t<220><221>尚未归类的特征<222>(26)..(29)<223>n是a、c、g或t<400>7tgtaatacgactcactatagnnnntnnnnttgtttcatatcacagcctccca52<210>8<211>51<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<220><221>尚未归类的特征<222>(21)..(24)<223>n是a、c、g或t<220><221>尚未归类的特征<222>(26)..(29)<223>n是a、c、g或t<400>8tgtaatacgactcactatagnnnntnnnngcttgtacattacagccgtgca51<210>9<211>51<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<220><221>尚未归类的特征<222>(21)..(24)<223>n是a、c、g或t<220><221>尚未归类的特征<222>(26)..(29)<223>n是a、c、g或t<400>9tgtaatacgactcactatagnnnntnnnnatctgaggaaaccctctgtgca51<210>10<211>52<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<220><221>尚未归类的特征<222>(21)..(24)<223>n是a、c、g或t<220><221>尚未归类的特征<222>(26)..(29)<223>n是a、c、g或t<400>10tgtaatacgactcactatagnnnntnnnnacctgacgaaaccctcagcccat52<210>11<211>53<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<220><221>尚未归类的特征<222>(21)..(24)<223>n是a、c、g或t<220><221>尚未归类的特征<222>(26)..(29)<223>n是a、c、g或t<400>11tgtaatacgactcactatagnnnntnnnncctatgcctgtctttactttaatc53<210>12<211>53<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<220><221>尚未归类的特征<222>(21)..(24)<223>n是a、c、g或t<220><221>尚未归类的特征<222>(26)..(29)<223>n是a、c、g或t<400>12tgtaatacgactcactatagnnnntnnnncttgaggaaaccctcagtccatat53<210>13<211>53<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<220><221>尚未归类的特征<222>(21)..(24)<223>n是a、c、g或t<220><221>尚未归类的特征<222>(26)..(29)<223>n是a、c、g或t<400>13tgtaatacgactcactatagnnnntnnnngaaaccatcaacccatgtgagtga53<210>14<211>52<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<220><221>尚未归类的特征<222>(21)..(24)<223>n是a、c、g或t<220><221>尚未归类的特征<222>(26)..(29)<223>n是a、c、g或t<400>14tgtaatacgactcactatagnnnntnnnnacttggagaaagactcagt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