用于抑制男性型脱发靶基因表达的不对称siRNA的制作方法

本发明涉及用于抑制男性型脱发的靶基因表达的不对称sirna及其用途；并且更具体地涉及用于抑制3-氧代-5-α-类固醇4-脱氢酶1(srd5a1)基因、3-氧代-5-α-类固醇4-脱氢酶2(srd5a2)基因或雄激素受体(ar)基因表达的不对称sirna，以及包含所述不对称sirna的用于预防或治疗脱发的组合物。

背景技术：

人毛发在毛囊中形成。毛囊中有乳突，乳突中分布有为毛发生长提供必需营养的小血管，并且乳突的侧面上端分布有皮脂腺以分泌皮脂来保护毛发。真皮乳突调节毛发生长，是雄性激素在男性型脱发中起作用的部位。毛发基质是在真皮乳突的控制下发生细胞分裂并且毛发生长的部位。

男性脱发的主要因素是由于激素异常的影响。在青春期，性激素分泌活跃，并且出现第二性征。这些变化是由性激素，即雄激素(雄性激素)和雌激素(雌性激素)引起的。雄激素使眉毛以下的体毛形成，并且雌激素主要促进毛发生长。对于男性来说，脱发是由于雄激素的过度分泌，其导致过度分泌的雄激素抑制雌激素的作用。

具体而言，类固醇5-α还原酶参与雄性激素的男性脱发机制，并且类固醇5-α还原酶是将睾酮(雄性激素)还原为dht(二氢睾酮)的主要酶。已知所得的dht与雄激素受体结合，从而调节毛囊中的毛发生长并且参与皮脂腺的增殖。

雄激素受体是雄性激素(雄激素)受体，并且已知能够与睾酮和dht结合，但是与dht具有更强的结合亲和力。已知类固醇5-α还原酶和雄激素受体的抑制会增加毛发生长因子并且诱导毛发生长，然而类固醇5-α还原酶和雄激素受体的激活会抑制毛发生长，从而导致脱发的发生(chhipa,rr等人,prostate,73:1483,2013；azzouni,f等人,advancesinurology,2012:18,2012；winiarska,a.等人,skinpharmacologyandphysiology,19:311,2006)。

类固醇5-α还原酶有两种类型：1型和2型。类固醇5-α还原酶1型主要分布于整个皮肤，尤其是在皮脂腺中，并且类固醇5-α还原酶2型主要分布于毛囊的真皮乳突周围和外根鞘中。在药物开发的早期阶段，主要开发了仅靶向类固醇5-α还原酶2型的脱发治疗剂，但是自发现1型也会影响毛发的生长以来，最近开发了用于抑制类固醇5-α还原酶1型和2型的治疗剂。

其中，非那雄胺可以用作抑制类固醇5-α还原酶2型的药物。非那雄胺最初是作为良性前列腺肥大的治疗剂而开发的，由于证实非那雄胺可以促进所给药患者的毛发生长，其已被fda和韩国食品和药物管理局批准为男性型脱发治疗剂。已知度他雄胺是抑制类固醇5-α还原酶1型和2型的治疗成分。与雄激素受体结合并且因此作为阻碍雄激素受体与dht之间结合的拮抗剂的药物被称为抗雄激素药物，并且作为这些抗雄激素药物的甲氰咪胍、螺内酯、氟他胺、醋酸环丙孕酮等是已知的。

然而，这些治疗成分具有诸如性功能障碍、疲劳等问题，并且在育龄女性中使用受到限制。当暴露于孕妇时，这些治疗成分可能导致胎儿畸形。因此，需要开发一种没有此类副作用的脱发治疗剂。

在这些技术背景下，本发明的诸位发明人证实了使用抑制3-氧代-5-α-类固醇4-脱氢酶1(srd5a1)基因、3-氧代-5-α-类固醇4-脱氢酶2(srd5a2)基因或雄激素受体(ar)基因表达的sirna而开发出的具有最小副作用的新型rnai药物能够展现出预防或治疗脱发的所需效果，从而完成了本发明。

技术实现要素：

技术问题

本发明的一个目的是提供特异性地结合srd5a1编码基因、srd5a2编码基因或ar编码基因的不对称较短双链体sirna(asirna)。

本发明的另一个目的是提供一种包含所述asirna的用于预防或治疗脱发的组合物，或一种预防或治疗脱发的方法。

技术方案

为了实现上述目的，本发明提供了sirna，其特异性地结合3-氧代-5-α-类固醇4-脱氢酶1(srd5a1)编码基因的mrna、3-氧代-5-α-类固醇4-脱氢酶2(srd5a2)编码基因的mrna或雄激素受体(ar)编码基因的mrna，并且包含长度为15nt-17nt的有义链和长度为19nt或更长的与所述有义链互补的反义链，其中有义链的3'末端和反义链的5'末端形成平端。

本发明还提供了包含所述sirna的用于预防或治疗脱发的组合物。

本发明还提供了预防或治疗脱发的方法，包括将sirna给予受试者。

本发明还提供了sirna用于预防或治疗脱发的用途。

本发明还提供了sirna用于制备预防或治疗脱发的药物的用途。

附图说明

图1a和图1b展示了如下结果，其示出asirna(靶向srd5a1的100种序列)的基因抑制效率。用0.3nm的靶向srd5a1的asirna转染huh-7细胞，24小时后，用qrt-pcr测量srd5a1mrna的表达水平，并且图片显示两次重复实验的平均值和sd。

图2展示了如下结果，其示出asirna(靶向srd5a1的12种序列)的基因抑制效率。用0.3nm、1nm或10nm的靶向srd5a1的asirna转染huh-7细胞，48小时后，通过蛋白质印迹测量srd5a1蛋白的表达水平。

图3展示了如下结果，其通过两次重复实验示出靶向srd5a1并且添加了各种化学修饰的12种cp-asirna的基因抑制效率。将huh-7细胞与1μm或3μm的靶向srd5a1的cp-asirna一起孵育，48小时后，通过蛋白质印迹测量srd5a1蛋白的表达水平。

图4展示了如下结果，其示出靶向srd5a1并且添加了各种化学修饰的2种cp-asirna的基因抑制效率。将huh-7细胞与0.3μm、1μm或3μm的靶向srd5a1的cp-asirna一起孵育，24小时后，用实时pcr测量srd5a1mrna的表达水平，并且图片示出四次重复实验的平均值和sd。

图5a和图5b展示了如下结果，其示出asirna(靶向srd5a2的112种序列)的基因抑制效率。用0.3nm的靶向srd5a2的asirna转染huh-7细胞，24小时后，用qrt-pcr测量srd5a2mrna的表达水平，并且图片显示两次重复实验的平均值和sd。

图6a展示了如下结果，其示出asirna(靶向srd5a2的23种序列)的基因抑制效率，图6b展示了如下结果，其示出asirna(靶向srd5a2的6种序列和4种序列)的基因抑制效率。用3nm或10nm的靶向srd5a2的asirna转染huh-7细胞，48小时后，通过蛋白质印迹测量srd5a2蛋白的表达水平。

图7展示了如下结果，其通过两次重复实验示出靶向srd5a2并且添加了各种化学修饰的12种cp-asirna的基因抑制效率。将huh-7细胞与1μm的靶向srd5a2的cp-asirna一起孵育，48小时后，通过蛋白质印迹测量srd5a2蛋白的表达水平。

图8展示了如下结果，其示出2种选择的cp-asisrd5a2的基因抑制效率。将huh-7细胞与浓度范围为1.95nm至1,000nm的靶向srd5a2的cp-asirna一起孵育，24小时后，通过rt-pcr测量srd5a2mrna的表达水平。

图9展示了如下结果，其示出2种选择的cp-asisrd5a2的基因抑制效率。将huh-7细胞与0.1μm、0.3μm、1μm或3μm的靶向srd5a2的cp-asirna一起孵育，48小时后，通过蛋白质印迹测量srd5a2蛋白的表达水平。

图10a和10b展示了如下结果，其示出asirna(靶向ar的118种序列)的基因抑制效率。用0.3nm的靶向ar的asirna转染a549细胞，24小时后，通过qrt-pcr测量armrna的表达水平，图片显示两次重复实验的平均值和sd。

图11展示了如下结果，其示出asirna(靶向ar的20种序列)的在蛋白质水平的抑制效率。用0.3nm的靶向ar的asirna转染a549细胞，48小时后，通过蛋白质印迹测量ar蛋白的表达水平，并且实验重复三次。

图12展示了如下结果，其示出asirna(靶向ar的9种序列)的基因抑制效率的。用0.1nm的靶向每种核苷酸序列的asirna转染a549细胞，48小时后，分别通过qrt-pcr和蛋白质印迹测量armrna和ar蛋白的表达水平。

图13展示了如下结果，其示出靶向ar并且添加了各种化学修饰的9种cp-asirna的基因抑制效率。将a549细胞与1μm或3μm的靶向ar的cp-asirna一起孵育，48小时后，通过实时pcr测量armrna的表达水平，并且图片显示四次重复实验的平均值和sd。

图14展示了如下结果，其示出靶向ar并且添加了各种化学修饰的9种cp-asirna的基因抑制效率。将a549细胞与1μm的靶向ar的cp-asirna一起孵育，48小时后，用蛋白质印迹测定测量ar蛋白的表达水平。

具体实施方式

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。通常，本文中所用的命名法是熟知的并且是本领域中通常用的。

因此，一方面，本发明涉及sirna，其特异性地结合具有seqidno:678的3-氧代-5-α-类固醇4-脱氢酶1(srd5a1)编码基因的mrna、具有seqidno:679的3-氧代-5-α-类固醇4-脱氢酶2(srd5a2)编码基因的mrna、或具有seqidno:680的雄激素受体(ar)编码基因的mrna，并且包含长度为15nt-17nt的有义链和长度为19nt或更长的与所述有义链互补的反义链，其中有义链的3'末端和反义链的5'末端形成平端。

作为男性型脱发(例如雄激素源性脱发)的靶基因的srd5a1编码基因具有mrna登录号：nm_001047.3、nm_001324322.1或nm_001324323.1，其分别包括具有seqid:669、seqidno:670和seqidno:671的序列。srd5a2编码基因具有mrna登录号：nm_000348.3，并且包括具有seqidno:672的序列。ar编码基因具有mrna登录号：nm_001011645.2，并且包括具有seqidno:673的序列。

在本发明中，sirna是包括具有一般rna干扰(rnai)作用的所有物质的概念。rnai是1998年首次在秀丽隐杆线虫(caenorhabditiselegans)中发现的基因调控的细胞内机制，并且已知其机制作用是引入细胞中的双链rna的反义链与靶基因的mrna互补结合，从而诱导靶基因的降解。在这方面，小干扰rna(sirna)是体外抑制基因表达的方法之一。长度为19bp-21bp的sirna理论上能够选择性地抑制几乎所有基因，因此可以开发为用于例如癌症、病毒感染等各种基因相关疾病的治疗剂，并且是最近引起最多关注的新的候选药物开发技术。在哺乳动物中用sirna进行体内治疗的第一次尝试是在2003年中期，并且从那时起，由于许多应用研究的尝试，已经有许多体内治疗的报道。

然而，与体内治疗的可能性相反，sirna的副作用和缺点一直有报道。为了开发基于rnai的治疗剂，需要克服挑战例如：1)缺乏有效的递送系统；2)脱靶效应；3)诱导免疫应答；以及4)细胞内rnai机制饱和。尽管sirna是直接调节靶基因表达的有效方法，但是由于上述问题，难以使用此类sirna开发治疗剂。关于此方面，本发明的申请人开发了不对称较短双链体sirna(asirna)结构相关技术(wo2009/078685)。asirna是具有比现有sirna的19+2结构更短的双螺旋长度的不对称的rnai诱导结构。asirna是一种克服现有sirna结构技术已知问题(例如脱靶效应、rnai机制饱和、tlr3造成的免疫应答等)的技术，因此可用于开发具有最小副作用的新rnai药物。

基于此，本发明提供了不对称sirna，其包括长度为15nt-17nt的有义链和与所述有义链互补并且长度为19nt或更长的反义链，因此根据本发明的sirna可以稳定地保持高递送效率而不引起例如脱靶效应、rnai机制饱和、tlr3造成的免疫应答等问题，并且可以抑制5α-还原酶1型靶基因、5α-还原酶2型靶基因和雄激素受体靶基因的表达。

在本发明中，术语“有义链”是指具有与srd5a1、srd5a2或ar编码基因的核酸序列相同的核酸序列的多核苷酸，并且长度为15nt-17nt。在一个实施方案中，有义链的长度可以为15nt、16nt或17nt。

本申请的诸位发明人选择5α-还原酶1型、5α-还原酶2型和雄激素受体作为靶基因，这些靶基因在抑制男性型脱发中毛囊生长所需的蛋白质合成中以及在通过减少真皮乳突来诱导脱发中起主要作用。由于筛选100种或更多种靶向每种靶基因的sirna并且从中选择具有良好抑制效率的sirna，证实了包含选自seqidno:5、6、15、18、40、48、49、59、62、69、77、86、205、208、228、231、232、233、237、238、239、240、242、248、249、259、260、262、265、283、284、285、291、292、300、471、477、498、500、502、503、505、506、507、509、510、515、517、518、521、524、534、538、539和546的一者的有义链和与所述有义链互补的反义链的sirna有效地降低了srd5a1、srd5a2或ar编码基因的mrna的表达。

具体地，包含具有seqidno:5、6、15、18、40、48、49、59、62、69、77或86的有义链和与所述有义链互补的反义链的sirna可以降低srd5a1编码基因的mrna的表达，包含具有seqidno:205、208、228、231、232、233、237、238、239、240、242、248、249、259、260、262、265、283、284、285、291、292或300的有义链和与所述有义链互补的反义链的sirna可以降低srd5a2编码基因的mrna的表达，并且包含具有seqidno:471、477、498、500、502、503、505、506、507、509、510、515、517、518、521、524、534、538、539或546的有义链和与所述有义链互补的反义链的sirna可以降低ar编码基因的mrna的表达。

具体地，证实了包含具有选自seqidno:48、49、69、86、231、259、260、262、498、500、506、509、510、518、538、539和546的一者的有义链和与所述有义链互补的反义链的sirna也有效地抑制srd5a1蛋白、srd5a2蛋白或ar蛋白的表达。

有义链的3'末端和反义链的5'末端形成平端。例如，反义链的5'末端可以包括例如1nt、2nt、3nt、4nt、5nt、6nt、7nt或8nt的突出端。

在本发明中，反义链是与靶基因互补的多核苷酸，并且长度为19nt或更长(例如，20nt或更长、21nt或更长、22nt或更长、23nt或更长、24nt或更长、25nt或更长、26nt或更长、27nt或更长、29nt或更长、30nt或更长、或31nt或更长)。在一个实施方案中，反义链的长度可以在19nt与24nt之间，例如19nt、20nt、21nt、22nt、23nt或24nt。鉴于不对称结构，反义链可以具有与有义链部分互补的序列。

反义链可以例如选自seqidno:105、106、115、118、140、148、149、159、162、169、177、186、317、320、340、343、344、345、349、350、351、352、354、360、361、371、372、374、377、395、396、397、403、404、412、589、595、616、618、620、621、623、624、625、627、628、633、635、636、639、642、652、656、657和664。

具体地，证实了包含选自seqidnos:148、149、169、186、343、371、372、374、616、618、624、627、628、636、656、657和664的反义链的sirna也有效地抑制srd5a1蛋白、srd5a2蛋白或ar蛋白的表达。

在一些实施方案中，sirna的有义链或反义链可以包括一种或多种化学修饰。

由于例如高负电荷、高分子量等原因，一般sirna不能穿透细胞膜，并且在血液中快速降解和消除，使得sirna难以将足以用于rnai诱导的量递送至实际靶位点。目前，在体外递送的情况下，已经开发了许多使用阳离子脂质体和阳离子聚合物的高效递送方法，但是sirna的体内递送难以与其体外递送一样有效，并且通过存在于生物体内的各种蛋白质之间的相互作用降低了sirna递送效率。

因此，本申请的诸位发明人开发了具有自身转移能力的细胞穿透性asirna(cp-asirna)，其通过将化学修饰引入不对称sirna结构从而能够在没有单独递送媒介物的情况下进行有效的细胞内递送。

在有义链或反义链中的化学修饰可以包括例如选自以下的至少一种：

核苷酸中糖结构的2'碳位置处的-oh基团被-ch3(甲基)、-och3(甲氧基)、-nh2、-f(氟)、-o-2-甲氧基乙基-o-丙基、-o-2-甲硫基乙基、-o-3-氨基丙基或-o-3-二甲基氨基丙基取代的修饰；

核苷酸中糖结构中的氧被硫取代的修饰；

核苷酸键变为硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯或甲基膦酸酯的修饰；

变为肽核酸(pna)、锁核酸(lna)或解锁核酸(una)的修饰；以及

结合胆固醇或细胞穿透肽。

在一个实施方案中，所述有义链或反义链中的化学修饰可以是核苷酸中糖结构的2'碳位置处的-oh基团被-ch3(甲基)取代，核苷酸键变为硫代磷酸酯的修饰、或结合胆固醇。这可以增强sirna的体内稳定性。

当糖结构的2'碳位置处的-oh基团被-ch3(甲基)取代时或当核苷酸键被修饰成硫代磷酸酯时，可以增加对核酸酶的抗性，并且通过结合胆固醇而与细胞膜的结合可以促进sirna的细胞内递送。

具体而言，所述化学修饰可以包括选自以下的至少一种修饰：有义链的5'末端或3'末端核苷酸中糖结构的2'碳位置处的-oh基团被-ch3(甲基)取代的修饰；有义链或反义链的两个或更多个核苷酸中糖结构的2'碳位置处的-oh基团被-ch3(甲基)取代的修饰；有义链或反义链中核苷酸键的25％或更多变为硫代磷酸酯的修饰；以及在有义链的3'末端处结合胆固醇。

关于核苷酸中糖结构的2'碳位置处的-oh基团被-ch3(甲基)取代的修饰，可以用-ch3(甲基)取代位于有义链的5'末端处的核苷酸中糖结构的2'碳位置处的-oh基团。此外，2'-o-甲基化核苷(其中糖结构的2'碳位置处的-oh基团被-ch3(甲基)取代)可以连续或不连续地被包括于有义链的5'末端至3'末端方向。2'-o-甲基化核苷和未修饰的核苷可以可选地被包括于有义链中。2、3、4、5、6、7或8个连续的2'-o-甲基化核苷和未修饰的核苷可以可选地被包括于有义链中。例如，两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、2到8个或8个2'-o-甲基化核苷可以存在于有义链中。

2'-o-甲基化核苷可以连续或不连续地被包括于反义链的5'末端至3'末端。2'-o-甲基化核苷和未修饰的核苷可以可选地被包括于反义链中。2、3、4、5、6、7或8个连续的2'-o-甲基化核苷和未修饰的核苷可以可选地被包括于反义链中。例如，两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个或2-7个2'-o-甲基化核苷可以存在于反义链中。

关于核苷酸键变为硫代磷酸酯的修饰，有义链中核糖核苷酸之间至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的键可以被修饰成硫代磷酸酯。在一些实施方案中，有义链中核糖核苷酸之间的所有(100％)键可以被修饰成硫代磷酸酯。

反义链中核糖核苷酸之间至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的键可以被修饰成硫代磷酸酯。在一些实施方案中，反义链中核糖核苷酸之间的总(100％)键可以被修饰成硫代磷酸酯。

另一方面，本发明涉及包含所述sirna的用于预防或治疗脱发的组合物。

本文所用的术语“治疗”意指减少给予所述组合物的受试者的脱发症状或脱发严重程度或防止其加重，并且在一些情况下可以包括使毛发生长继续。本文所用的术语“预防”意指防止或延迟脱发的开始，或降低脱发的可能性。

除了作为活性成分的sirna之外，可以进一步制备包括一种或多种药学上可接受的载体的组合物。药学上可接受的载体必须与本发明的活性成分相容，并且可以是选自以下的药学上可接受的载体：生理盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、右旋糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇、和这些组分中的两种或更多种的混合物。如有必要，组合物可以包括其他一般添加剂，例如抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂等。另外，通过进一步添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘结剂和润滑剂，可以将组合物配制成可注射制剂，例如水溶液、悬浮液、乳液等。具体而言，组合物可以配制成冻干制剂。可以使用本发明所属技术领域中常用的方法配制冻干制剂，并且还可以添加用于冻干的稳定剂。

组合物的给予方法可以由本领域普通技术人员基于患者的一般症状和疾病的严重程度来确定。另外，可以将组合物配制成各种形式，例如粉末、片剂、胶囊、液体、注射剂、软膏、糖浆等，并且还可以按单位剂量或多剂量容器(例如密封安瓿和小瓶)等提供。

可以将组合物口服或肠胃外给予。根据本发明的组合物的给药途径可以是，但不限于，例如口服给予、静脉内给予、肌内给予、动脉内给予、髓内给予、硬膜内给予、心内给予、透皮给予、皮下给予、腹膜内给予、肠给予、舌下给药或局部给予。根据本发明的组合物的剂量根据患者的体重、年龄、性别和健康状况、饮食、给药时间、给药方法、排泄率、疾病严重程度等而变化，并且可以由本领域普通技术人员容易地确定。另外，对于临床给药，使用已知技术可以将本发明的组合物配制成合适的形式。

在本发明的另一方面，还提供了预防或治疗脱发的方法，所述方法包括将sirna给予受试者。

在另一方面，本发明涉及sirna用于预防或治疗脱发的用途。

在另一方面，本发明涉及sirna用于制备预防或治疗脱发的药物的用途。

包括在根据本发明的预防或治疗方法中的配置与包括在上述实施方案中的配置相同，因此前述描述可以同样地应用于所述预防或治疗方法。

在下文中，将参考以下实施例进一步详细描述本发明。对于本领域普通技术人员将显而易见的是，提供这些实施例仅用于说明目的，而不应限制本发明的范围。

[实施例1]筛选靶向srd5a1的100种rnai诱导双链核酸分子

为了获得靶向srd5a1的高效rnai诱导双链核酸分子，选择srd5a1基因的靶序列，然后设计asirna。asirna结构不同于通常已知的sirna的结构，因此当使用通用sirna设计程序设计asirna的核苷酸序列时，设计优化的asirna可能有些困难。因此，通过以下方法构建asirna。使用ncbidb搜索获得关于srd5a1基因(mrna登录号：nm_001047.3、nm_001324322.1、nm_001324323.1)(其为与男性型脱发(雄激素性脱发)有关的靶基因)的信息。对于后续的动物实验，鉴于与小鼠的核苷酸序列同源性确定核苷酸序列，然后根据设计方法(例如排除gc含量为30％-62％并且具有4个或更多个g或c连续碱基的序列)设计100种asirna，然后由olix公司(韩国)合成。通过在37℃下孵育1小时，将合成的有义链和反义链rna寡核苷酸在95℃下退火2分钟，并且使用uv透射仪确认通过10％聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)退火的asirna。

[表1]

100种靶向3-氧代-5-α-类固醇4-脱氢酶1的asirna核苷酸序列

[实施例2]筛选靶向srd5a1的rnai诱导双链核酸分子

为了确认在mrna水平的基因抑制效率，将100种选择的asirna以0.3nm的浓度转染到huh-7细胞系中，并进行qrt-pcr以测量srd5a1mrna的表达水平。

将huh-7细胞系在含有10％胎牛血清(fbs，gibco)和100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素的杜氏改良伊格尔培养基(dmem，gibco)中培养。将huh-7细胞以5x10³个细胞/孔的密度接种于96孔板中，并且根据invitrogen的方案，在opti-mem中(总体积为100μl)，使用(0.3nm，olix公司)和lipofectamine2000(1μl/ml，invitrogen公司)进行反向转染实验。24小时后，根据toyobosuperprep提供的基本方案进行rna纯化和cdna合成，使用bio-radcfx-4000机器用srd5a1taqman探针(hs00602694_mh)检查srd5a1基因的表达水平，并且结果在图1a和图1b中展示。

从筛选100种asirna的结果中，选择了排名前12种的asirna(表1中，编号5、6、15、18、40、48、49、59、62、77和86)，然后用0.3nm、1nm、3nm或10nm的asirna处理并且进行蛋白质印迹以分析其蛋白表达抑制作用。将huh-7细胞以2.5x10⁵个细胞/孔的密度接种于6孔板中，然后根据invitrogen的方案，在opti-mem(总体积2ml)中，使用asirna和lipofectamine2000(1μl/ml，invitrogen公司)进行反向转染实验。48小时后，使用哺乳动物蛋白质提取缓冲液(gehealthcare)裂解细胞，然后使用bradford测定来定量蛋白质。使用12％sds-page将每个样品的10μg蛋白质在80v下电泳20分钟并在120v下电泳1小时，然后在300ma下转移到pvde膜(bio-rad)上持续1小时20分钟。转移后，将膜在5％脱脂乳中封闭1小时，并使其与srd5a1抗体(abcam，ab110123)以1:2000的比率反应12小时。第二天，使所得的膜与抗山羊hrp(santacruz)以1:10000的比率反应1小时，然后使用chemidoc(bio-rad)相互比较srd5a1蛋白的表达水平。从图2的结果中，选择能够抑制srd5a1蛋白表达的4种asirna(表1中，编号48、49、69和86)。

[实施例3]靶向srd5a1基因并且具有自身细胞穿透能力的16种cp-asirna

根据2’ome(甲基)、硫代磷酸酯键(ps)和胆固醇的数量和位置，通过对4种靶向srd5a1的asirna(表1中，编号48、49、69和86)应用三种修饰模式来设计srd5a1cp-asirna(共16条链)，然后由olix公司(韩国)合成。cp-asirna增强内吞效率和稳定性，因此可以在没有递送媒介物的辅助下高效穿透细胞膜从而抑制靶基因表达。通过在37℃下孵育1小时，将合成的有义链和反义链rna寡核苷酸在95℃下退火2分钟，并且通过uv透射仪确认通过10％聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)退火的cp-asirna。

[表2]

靶向srd5a1的16条cp-asirna核苷酸序列

[实施例4]筛选靶向srd5a1基因并且具有自身细胞穿透能力的cp-asirna

检查表2中所示的12种cp-asirna对srd5a1表达的抑制作用。将huh-7细胞系与1μm或3μm的12种cp-asirna在opti-mem培养基中孵育24小时，然后将培养基更换为含有10％胎牛血清(gibco)和100单位/ml青霉素100μg/ml链霉素的杜氏改良伊格尔培养基(gibco)，并且在培养基更换后24小时，在蛋白质水平检查srd5a1表达。如图3所示，重复进行两次实验的结果是，证实了srd5a1cp-asirna#49(2,4)和#86(7,4)展现出50％或更高的基因抑制效率。

在huh-7细胞系中检查两种选择的cp-asirna对srd5a1表达的抑制作用。将huh-7细胞系在opti-mem培养基中与两种cp-asirna中0.3μm、1μm或3μm的每一种孵育24小时，然后在mrna水平检查srd5a1表达。重复进行四次实验的结果是，证实了srd5a1cp-asirna#49(2,4)和#86(7,4)在1μm或更高的浓度下展现出50％或更高的基因抑制效率(参见图4)。

[实施例5]筛选靶向srd5a2的112种rnai诱导双链核酸分子

为了获得靶向srd5a2的高效rnai诱导双链核酸分子，选择srd5a2基因的靶序列，然后设计asirna。asirna结构不同于通常已知的sirna的结构，因此当使用通用sirna设计程序设计asirna的核苷酸序列时，设计优化的asirna可能有些困难。因此，通过以下方法构建asirna。使用ncbidb搜索获得关于被认为是靶向男性型脱发(雄激素性脱发)的srd5a2基因(mrna登录号：nm_000348.3)的信息。对于后续的动物实验，确保与小鼠的核苷酸序列具有至少80％同源性的核苷酸序列，然后根据设计方法(例如排除gc含量为30％-62％并且具有4个或更多个g或c连续碱基的序列)设计100种asirna，然后由olix公司(韩国)合成。通过在37℃下孵育1小时，将合成的有义链和反义链rna寡核苷酸在95℃下退火2分钟，并且使用uv透射仪确认通过10％聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)退火的asirna。

[表3]

112条靶向3-氧代-5-α-类固醇4-脱氢酶2的asirna核苷酸序列

[实施例6]筛选靶向srd5a2的rnai诱导双链核酸分子

为了确认在mrna水平的基因抑制效率，将112种选择的asirna以0.3nm的浓度转染到huh-7细胞系中，并进行qrt-pcr以测量srd5a1mrna的表达水平。将huh-7细胞系在含有10％胎牛血清(fbs，gibco)和100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素的杜氏改良伊格尔培养基(dmem，gibco)中培养。将huh-7细胞以5x10⁴个细胞/孔的密度接种于24孔板中，并且根据invitrogen的方案，在opti-mem中(总体积为500μl)，使用(0.3nm，olix公司)和lipofectamine2000(1μl/ml，invitrogen公司)进行反向转染实验。24小时后，使用trizol(takapa)提取总rna，然后使用高容量cdna逆转录试剂盒(appliedbiosystems)合成cdna，并且使用powersybrgreenpcrmastermix(appliedbiosystems)、以下引物和stepone实时pcr系统检查srd5a2基因的表达水平(参见图5a和图5b)。

实验中使用的引物的核苷酸序列示于下表4中。

[表4]

引物核苷酸序列

从筛选112种asirna的结果中，选择排名前23种的asirna(表3中，编号5、8、28、31、32、33、37、38、39、40、42、48、49、59、60、62、65、83、84、85、91、92和100)，并且以10nm的浓度进行蛋白质印迹。将huh-7细胞以2.5x10⁵个细胞/孔的密度接种于6孔板中，然后根据invitrogen的方案，在opti-mem(总体积2ml)中，使用asirna和lipofectamine2000(1μl/ml，invitrogen公司)进行反向转染实验。48小时后，使用哺乳动物蛋白质提取缓冲液(gehealthcare)裂解细胞，然后使用bradford测定来定量蛋白质。使用12％sds-page将每个样品的10μg蛋白质在80v下电泳20分钟并在120v下电泳1小时，然后在300ma下转移到pvde膜(bio-rad)上持续1小时20分钟。转移后，将膜在5％脱脂乳中封闭1小时，然后使其与srd5a2抗体(abcam，ab124877)以1:2000的比率反应12小时。第二天，使所得的膜与抗兔hrp(santacruz)以1:10000的比率反应1小时，然后使用chemidoc(bio-rad)相互比较srd5a2蛋白的表达水平。在本实验中，选择能够抑制约50％或更高的srd5a2蛋白表达的4种asirna(表3中，编号31、59、60和62)(参见图6a和图6b)。

[实施例7]靶向srd5a2基因并且具有自身细胞穿透能力的16种cp-asirna

根据2’ome(甲基)、硫代磷酸酯键(ps)和胆固醇的数量和位置，通过对4种靶向srd5a2的asirna(表3中，编号31、59、60和62)应用三种修饰模式来设计srd5a2cp-asirna(共16条链)，然后由olix公司(韩国)合成。cp-asirna增强内吞效率和稳定性，因此可以在没有递送媒介物的辅助下高效穿透细胞膜从而抑制靶基因表达。通过在37℃孵育1小时，将合成的有义链和反义链rna寡核苷酸在95℃下退火2分钟，并且使用uv透射仪确认通过10％聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)退火的cp-asirna。

[表5]

靶向srd5a2的16条cp-asirna核苷酸序列

[实施例8]筛选靶向srd5a2基因并且具有自身细胞穿透能力的cp-asirna

检查表5中所示的12种cp-asirna对srd5a2表达的抑制作用。将huh-7细胞系与1μm或3μm的12种cp-asirna在opti-mem培养基中孵育24小时，然后将培养基更换为含有10％胎牛血清(gibco)和100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素的杜氏改良伊格尔培养基(gibco)，并且在更换培养基后24小时，在蛋白质水平检查srd5a2表达。重复进行两次实验的结果是，证实了srd5a2cp-asirna#59(4,4)和#62(4,4)展现出50％或更高的基因抑制效率(参见图7)。

[实施例9]确认2种选择的cp-asirna对靶基因srd5a2表达的抑制效率

在huh-7细胞系中检查两种上文选择的cp-asirna对srd5a2表达的抑制作用。将huh-7细胞系在opti-mem培养基中与两种cp-asirna中1.95nm、3.9nm、7.8nm、15.6nm、31.3nm、62.5nm、125nm、250nm、500nm或1,000nm的每一种孵育24小时，然后在mrna水平检查srd5a2表达。重复进行三次实验的结果是，证实了srd5a2cp-asirna#59(4,4)和#62(4,4)的ic50值分别是22.37nm和27.18nm(参见图8)。

在huh-7细胞系中检查两种上文选择的cp-asirna对srd5a2表达的抑制作用。将huh-7细胞系与0.1μm、0.3μm、1μm或3μm的两种cp-asirna在opti-mem培养基中孵育24小时，然后将培养基更换为含有10％胎牛血清(gibco)和100单位/ml青霉素100μg/ml链霉素的杜氏改良伊格尔培养基(gibco)，并且在更换培养基后24小时，在蛋白质水平检查srd5a2表达。重复进行两次实验的结果是，证实了随着cp-asisrd5a2#59(4,4)和#62(4,4)的处理浓度的增加，靶基因srd5a2的蛋白质表达降低(参见图9)。

[实施例10]筛选靶向ar的118种rnai诱导双链核酸分子

为了获得靶向ar的高效rnai诱导双链核酸分子，选择ar基因的靶序列，然后设计asirna。asirna结构不同于通常已知的sirna的结构，因此当使用通用sirna设计程序设计asirna的核苷酸序列时，设计优化的asirna可能有些困难。因此，通过以下方法构建asirna。使用ncbidb搜索获得关于ar基因(mrna登录号：nm_001011645.2)(其为与男性型脱发(雄激素性脱发)有关的靶基因)的信息。对于后续的动物实验，确保与小鼠的核苷酸序列具有至少80％同源性的核苷酸序列，然后根据设计方法(例如排除gc含量为30％-62％并且具有4个或更多个g或c连续碱基的序列)设计100种asirna，然后由olix公司(韩国)合成。通过在37℃下孵育1小时，将合成的有义链和反义链rna寡核苷酸在95℃下退火2分钟，并且使用uv透射仪确认通过10％聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)退火的asirna。

[表6]

靶向雄激素受体的118条asirna核苷酸序列

[实施例11]筛选靶向ar的rnai诱导双链核酸分子

为了确认在mrna水平的基因抑制效率，将118种选择的asirna以0.3nm的浓度转染到a549细胞系中，并进行qrt-pcr以测量armrna的表达水平。

将a549细胞系在含有10％胎牛血清(fbs，gibco)和100单位/ml青霉素100μg/ml链霉素的杜氏改良伊格尔培养基(dmem，gibco)中培养。将a549细胞以5x10³个细胞/孔的密度接种于96孔板中，并且根据invitrogen的方案，在opti-mem(总体积为100μl)中，使用asirna(0.3nm，olixpharmaceuticals公司)和rnaimax(1μl/ml，invitrogen公司)进行转染实验。24小时后，根据toyobosuperprep提供的基本方案进行rna纯化和cdna合成，使用bio-radcfx-4000机器用artaqman探针(t)检查ar基因的表达水平。首先，使118种asirna中的88种asirna经受asirna筛选实验，并且基于对靶基因表达的抑制功效选择排名前13种的asirna(表6中，编号43、49、67、70、72、74、75、77、78、79、81、82和87)，并且使13种选择的asirna和30种剩余的asirna(表6中，编号88至118)经受二次asirna筛选实验(参见图10a和图10b)。

基于对靶基因表达的抑制功效选择已经通过二次asirna筛选的排名前20种的asirna(表6中，编号43、49、70、72、74、75、77、78、79、81、82、87、89、90、93、96、106、110、111和118)，并且进行了实验以证实20种选择的asirna在蛋白质水平对ar表达的抑制作用。将a549细胞以5x10⁴个细胞/孔的密度接种于12孔板中，然后根据invitrogen的方案，在opti-mem(总体积为1ml)中，使用asirna(0.3nm，olixpharmaceuticals公司)和rnaimax(1μl/ml，invitrogen公司)进行转染实验。48小时后，使用哺乳动物蛋白质提取缓冲液(gehealthcare)裂解细胞，然后使用bradford测定来定量蛋白质。使用10％sds-page将每个样品的20μg蛋白质在80v下电泳20分钟并且在120v下电泳1小时，然后在300ma下转移到pvde膜(bio-rad)上持续1小时。转移后，将膜在5％脱脂乳中封闭1小时，并使其与ar抗体(abcam，ab133273)以1:2000的比率反应12小时。第二天，使所得的膜与抗兔hrp(santacruz)以1:5000的比率反应1小时，然后使用chemidoc(bio-rad)相互比较ar蛋白的表达水平。从结果中，选择能够更有效地抑制ar蛋白表达的排名前9种的asirna(编号70、72、78、81、82、90、110、111和118)(参见图11)。

基于对靶基因表达的抑制功效选择已经通过asirna筛选的排名前9种的asirna候选物(表6中，编号70、72、78、81、82、90、110、111和118)，并且进行了实验以证实9种选择的asirna候选物在mrna和蛋白质水平以及较低的浓度(0.1nm)下对ar表达的抑制作用。将a549细胞以5x10⁴个细胞/孔的密度接种于12孔板中，然后根据invitrogen的方案，在opti-mem(总体积0.5ml)中，使用asirna和rnaimax(1μl/ml，invitrogen公司)进行转染实验。48小时后，使用trizol(takapa)提取总rna，然后使用高容量cdna逆转录试剂盒(appliedbiosystems)合成cdna，并且使用powersybrgreenpcrmastermix(appliedbiosystems)、示于下表7中的引物和stepone实时pcr系统检查ar基因的表达水平。

[表7]

引物核苷酸序列

另外，将a549细胞以5x10⁴个细胞/孔的密度接种于12孔板中，然后根据invitrogen的方案，在opti-mem(总体积0.5ml)中，使用asirna和rnaimax(1μl/ml，invitrogen公司)进行转染实验。48小时后，使用哺乳动物蛋白质提取缓冲液(gehealthcare)裂解细胞，然后使用bradford测定来定量蛋白质。使用10％sds-page将每个样品的20μg蛋白质在80v下电泳20分钟并且在120v下电泳1小时，然后在300ma下转移到pvde膜(bio-rad)上持续1小时。转移后，将膜在5％脱脂乳中封闭1小时，并使其与ar抗体(abcam，ab133273)以1:2000的比率反应12小时。第二天，使所得的膜与抗兔hrp(santacruz)以1:5000的比率反应1小时，然后使用chemidoc(bio-rad)相互比较ar蛋白的表达水平。9种选择的asirna的实验的结果是，证实asirna#72、78和110即使在0.1nm的浓度下也展现出50％或更高效的基因抑制效率(参见图12)。

[实施例12]靶向ar基因并且具有自身细胞穿透能力的9种cp-asirna

根据2’ome(甲基)、硫代磷酸酯键(ps)和胆固醇的数量和位置，通过对3种靶向ar的asirna应用三种修饰模式设计arcp-asirna(共9种)，然后由dharmacon合成。cp-asirna增强胞吞效率和稳定性，因此可以在没有递送媒介物的帮助下高效穿透细胞膜从而抑制靶基因表达。通过在37℃孵育1小时，将合成的有义链和反义链rna寡核苷酸在95℃下退火2分钟，并且使用uv透射仪确认通过10％聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)退火的cp-asirna。

[表8]

9种靶向ar的cp-asirna核苷酸序列

[实施例13]筛选靶向ar基因并且具有自身细胞穿透能力的cp-asirna

检查表8中所示的9种cp-asirna对ar表达的抑制作用。将a549细胞系在opti-mem培养基中与9种cp-asirna中1μm或3μm的每种孵育24小时，然后将培养基更换为含有10％胎牛血清(gibco)和100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素的杜氏改良伊格尔培养基(gibco)，并且24小时后，在mrna水平检查ar表达。重复进行四次实验的结果是，证实了9种arcp-asirna在3μm的浓度下展现出50％的基因抑制效率(参见图13)。

在相同的实验条件下，在a549细胞系中在蛋白质水平检查9种cp-asirna对ar表达的抑制作用。将a549细胞系在opti-mem培养基中与9种cp-asirna中1μm或3μm的每种孵育24小时，然后将培养基更换为含有10％胎牛血清(gibco)和100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素的杜氏改良伊格尔培养基(gibco)，并且24小时后，在蛋白质水平检查ar表达。其中，基于无处理(nt)样品和1/2nt样品的条带强度(参见图14)，cp-asirna#72(7,4)、#78(7,4)(4,4)(2,4)和#110(7,4)(4,4)在1μm浓度下展现出50％或更高的靶基因蛋白表达抑制效率。

虽然已经参考本发明的具体实施方案详细描述了本发明，但是对于本领域普通技术人员来说显而易见的是，提供这些具体实施方案仅用于说明性目的，并不旨在限制本发明的范围。因此，本发明的实际范围将由所附权利要求及其等效物限定。

实用性

选择5α-还原酶1型编码基因、5α-还原酶2型编码基因和雄激素受体编码基因作为靶基因，这些靶基因在抑制男性型脱发中的毛囊生长所需蛋白质的合成中以及在通过减小真皮乳突大小而诱导脱发中起主要作用；并且选择对每个靶基因具有高抑制效率的不对称sirna。根据本发明的sirna展现出抑制5α-还原酶1型、5α-还原酶2型或雄激素受体的靶基因表达的能力，因此可以有效地用作预防或治疗脱发的药剂。

虽然已经参考本发明的具体实施方案详细展示和描述了本发明，但是对于本领域普通技术人员来说显而易见的是，提供此类实施方案仅用于说明性目的，并不旨在限制本发明的范围。因此，本发明的实际范围应由所附权利要求及其等效物限定。

序列表自由文本

附电子文件。

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<120>用于抑制男性型脱发靶基因表达的不对称sirna

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<212>rna

<213>人工序列

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<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<211>16

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<213>人工序列

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<211>16

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<211>16

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<211>16

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<211>16

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<211>16

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<212>rna

<213>人工序列

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<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<212>rna

<213>人工序列

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<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<213>人工序列

<220>

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<213>人工序列

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<211>16

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<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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cuguaccuguuaucaa16

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<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<212>rna

<213>人工序列

<220>

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cauacacugcacaauggcuca21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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auccaguaucuccugguuuuc21

<210>120

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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gccuccccuugguauuuugua21

<210>121

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

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cuccccuugguauuuuguauc21

<210>122

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

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uauucaaauaagccuccccuu21

<210>123

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

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ccaaaauaguuggcugcaguu21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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aauaguuggcugcaguuacgu21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

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uaguuggcugcaguuacguau21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

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guuggcugcaguuacguauuc21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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agccacaccacuccaugauuu21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

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ccacaccacuccaugauuucu21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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acaccacuccaugauuucucc21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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accacuccaugauuucuccaa21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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cacuccaugauuucuccaaaa21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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agcuggccagggcauagccac21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

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cuggccagggcauagccacac21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>136

gagguaccacucaugaugcuc21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

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gguaccacucaugaugcucuu21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>138

ucuucaaauuuccggagguac21

<210>139

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<212>rna

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

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<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<212>rna

<213>人工序列

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<211>16

<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<211>16

<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<211>16

<212>rna

<213>人工序列

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<211>16

<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<211>16

<212>rna

<213>人工序列

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<211>16

<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<211>16

<212>rna

<213>人工序列

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<211>16

<212>rna

<213>人工序列

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<211>16

<212>rna

<213>人工序列

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<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<211>16

<212>rna

<213>人工序列

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<211>16

<212>rna

<213>人工序列

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auagguucuaccucaa16

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>356

gcuccagaaacauacguaaac21

<210>357

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>357

ugagguagaaccuaugguggu21

<210>358

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>358

uugagguagaaccuauggugg21

<210>359

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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cuugagguagaaccuauggug21

<210>360

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>360

ucuugagguagaaccuauggu21

<210>361

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>361

aucuugagguagaaccuaugg21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

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caucuugagguagaaccuaug21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<210>370

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>370

gaugaauggaauaagggcuuu21

<210>371

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>371

agaugaauggaauaagggcuu21

<210>372

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>372

aagaugaauggaauaagggcu21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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aaagaugaauggaauaagggc21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

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uaaaagaugaauggaauaagg21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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uuaaaagaugaauggaauaag21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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ggaaacaaagugagaaaaaug21

<210>379

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<210>380

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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aaacaaagugagaaaaaugca21

<210>381

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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aacaaagugagaaaaaugcaa21

<210>382

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>382

acaaagugagaaaaaugcaaa21

<210>383

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

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<210>384

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

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aguggcgcugccugccagcac21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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gcggcgcgggcuggcaggcgg21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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ccuacauuacuuccacaggac21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<210>390

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<210>391

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<210>392

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>392

uguguaccacccaucagggua21

<210>393

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>393

cuguguaccacccaucagggu21

<210>394

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>394

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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gucuguguaccacccaucagg21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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ugucuguguaccacccaucag21

<210>397

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

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augucuguguaccacccauca21

<210>398

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

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<210>399

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

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uaagaagacacccaagcuaaa21

<210>400

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>400

aagaagacacccaagcuaaac21

<210>401

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<400>401

agaagacacccaagcuaaacc21

<210>402

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>402

gaagacacccaagcuaaaccg21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>403

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<210>404

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>404

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>405

cuuccugagcuggcgcaauau21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>406

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<210>407

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>407

aaggaaacaaagugagaaaaa21

<210>408

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>408

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<210>409

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>409

gagguagaaccuaugguggug21

<210>410

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>410

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<210>411

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>411

gguagaaccuaugguggugaa21

<210>412

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>412

guagaaccuaugguggugaaa21

<210>413

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>413

uagaaccuaugguggugaaaa21

<210>414

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>414

agaaccuaugguggugaaaag21

<210>415

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>415

agauuugggguaguccucaaa21

<210>416

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>416

gauuugggguaguccucaaac21

<210>417

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>417

auuugggguaguccucaaaca21

<210>418

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>418

uuugggguaguccucaaacau21

<210>419

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>419

uugggguaguccucaaacauc21

<210>420

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>420

ugggguaguccucaaacaucu21

<210>421

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>421

gcuuuccgagauuugggguag21

<210>422

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>422

gaauggaauaagggcuuuccg21

<210>423

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>423

aauggaauaagggcuuuccga21

<210>424

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>424

uggccagggcauagccgaucc21

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>primer

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>primer

<400>426

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>primer

<400>427

tgaacctgggtggcttatga20

<210>428

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>primer

<400>428

gaaaggaaagttgcttggg19

<210>429

<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>429

gagaugaagcuucugg16

<210>430

<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>430

ggagaugaagcuucug16

<210>431

<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>431

guggagaugaagcuuc16

<210>432

<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>432

uguggagaugaagcuu16

<210>433

<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>433

ucuguggagaugaagc16

<210>434

<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>434

ugaucuguggagauga16

<210>435

<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>435

cugaucuguggagaug16

<210>436

<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>436

aagaccugccugaucu16

<210>437

<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>437

uuuccaccccagaaga16

<210>438

<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>438

acuuuccaccccagaa16

<210>439

<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>439

aagggaaacagaagua16

<210>440

<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>440

gaagggaaacagaagu16

<210>441

<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>441

cugaagggaaacagaa16

<210>442

<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>442

caaaagagccgcugaa16

<210>443

<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>443

ucaaaagagccgcuga16

<210>444

<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>444

cuucaaaagagccgcu16

<210>445

<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>445

cuucuucaaaagagcc16

<210>446

<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>446

ucuucuucaaaagagc16

<210>447

<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>447

aggucuucuucaaaag16

<210>448

<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>448

aagcagggaugacucu16

<210>449

<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>449

ugaagcagggaugacu16

<210>450

<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>450

uuaugaagcagggaug16

<210>451

<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>451

uguuaugaagcaggga16

<210>452

<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>452

auguuaugaagcaggg16

<210>453

<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>453

gcuaugaaugucagcc16

<210>454

<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>454

ggcuaugaaugucagc16

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<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>455

gaaggcuaugaauguc16

<210>456

<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>456

uugaaggcuaugaaug16

<210>457

<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>457

gaagccauugagccag16

<210>458

<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>458

cuggcuuccgcaacuu16

<210>459

<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>459

ugccuggcuuccgcaa16

<210>460

<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>460

agugggccaaggccuu16

<210>461

<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>461

ccaggaugcucuacuu16

<210>462

<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>462

uccaggaugcucuacu16

<210>463

<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>463

aacuccaggaugcucu16

<210>464

<211>16

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<213>人工序列

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<211>16

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<211>16

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<213>人工序列

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<211>16

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<211>16

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<211>16

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<211>16

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<211>16

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<213>人工序列

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<211>16

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<213>人工序列

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<211>16

<212>rna

<213>人工序列

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<211>16

<212>rna

<213>人工序列

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<211>16

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<211>16

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<211>16

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<212>rna

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<211>16

<212>rna

<213>人工序列

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<211>16

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<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<211>16

<212>rna

<213>人工序列

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<211>16

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<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<211>16

<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

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caucuccacagaucaggcagg21

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

<220>

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gcugacauucauagccuucaa21

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<212>rna

<213>人工序列

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<223>asirna

<400>573

gacauucauagccuucaaugu21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>574

cauucauagccuucaaugugu21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

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cuggcucaauggcuuccagga21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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aaguugcggaagccaggcaag21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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uugcggaagccaggcaaggcc21

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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agagcauccuggaguugacau21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<400>583

uugugcaugcgguacucauug21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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uggagccauccaaacucuuga21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

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gagccauccaaacucuugaga21

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<211>21

<212>rna

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cgaucgaguuccuugauguag21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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<212>rna

<213>人工序列

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uuccuugauguaguucauucg21

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<211>21

<212>rna

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uguaguucauucgaaguucau21

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<212>rna

<213>人工序列

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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cauucgaaguucaucaaagaa21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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uuugauuuuucagcccaucca21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

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gauuuuucagcccauccacug21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

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auccacuggaauaaugcugaa21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

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ccacuggaauaaugcugaaga21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

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cuggaauaaugcugaagagag21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

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gaauaaugcugaagagagcag21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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gaagagagcagugcuuucaug21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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agagagcagugcuuucaugca21

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<212>rna

<213>人工序列

<220>

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gagcagugcuuucaugcacag21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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cagugcuuucaugcacaggaa21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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cuuucaugcacaggaauuccu21

<210>610

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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ucaugcacaggaauuccuggg21

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<212>rna

<213>人工序列

<220>

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augcacaggaauuccuggggg21

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<212>rna

<213>人工序列

<220>

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uccaggagcuuggugagcugg21

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<212>rna

<213>人工序列

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agcuuggugagcugguagaag21

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<212>rna

<213>人工序列

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cuuggugagcugguagaagcg21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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gacuugauuagcaggucaaaa21

<210>616

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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acuugauuagcaggucaaaag21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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ugauuagcaggucaaaaguga21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

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auuagcaggucaaaagugaac21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

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agcaggucaaaagugaacuga21

<210>620

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

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gcaggucaaaagugaacugau21

<210>621

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<400>621

ggucaaaagugaacugaugca21

<210>622

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>622

caaaagugaacugaugcagcu21

<210>623

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>623

aagugaacugaugcagcucuc21

<210>624

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>624

agugaacugaugcagcucucu21

<210>625

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>625

guguggaaauagaugggcuug21

<210>626

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>626

uguggaaauagaugggcuuga21

<210>627

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>627

uggaaauagaugggcuugacu21

<210>628

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>628

aaauagaugggcuugacuuuc21

<210>629

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

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augggcuugacuuucccagaa21

<210>630

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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ggcuugacuuucccagaaagg21

<210>631

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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<400>631

uugacuuucccagaaaggauc21

<210>632

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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acuuucccagaaaggaucuug21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>633

ccagaaaggaucuugggcacu21

<210>634

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>634

gaaaggaucuugggcacuugc21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>635

aggaucuugggcacuugcaca21

<210>636

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

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aucuugggcacuugcacagag21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>637

ggcacuugcacagagaugauc21

<210>638

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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acuugcacagagaugaucucu21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

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ugcacagagaugaucucugcc21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

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acagagaugaucucugccauc21

<210>641

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>641

uuuuuuagugccagugaacau21

<210>642

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>642

uuuuuagugccagugaacaua21

<210>643

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>643

uuuagugccagugaacauaca21

<210>644

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>644

agugccagugaacauacauaa21

<210>645

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>645

ugccagugaacauacauaaaa21

<210>646

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>646

ccagugaacauacauaaaaau21

<210>647

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>647

accucagcaacuacccaaagg21

<210>648

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

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ccucagcaacuacccaaagga21

<210>649

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>649

cagcaacuacccaaaggacag21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

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agcaacuacccaaaggacaga21

<210>651

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

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aucauguggaugguggacaua21

<210>652

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>652

caaagaggcacuaaugcuugc21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>653

aaagaggcacuaaugcuugcu21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>654

aagaggcacuaaugcuugcuc21

<210>655

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>655

agaggcacuaaugcuugcucc21

<210>656

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>656

auaagcuaacaugggcacuag21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>657

ccaacaaacaaguuucugcca21

<210>658

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>658

acaaacaaguuucugccauuu21

<210>659

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>659

aacaaguuucugccauuuuua21

<210>660

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>660

acaaguuucugccauuuuuaa21

<210>661

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>661

agcaacaaaagauuccaagau21

<210>662

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

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gcaacaaaagauuccaagauu21

<210>663

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>663

agagaacagaacacuagcgcu21

<210>664

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>asirna

<400>664

gagaacagaacacuagcgcuu21

<210>665

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>primer

<400>665

gagtcaacggatttggtcgt20

<210>666

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>primer

<400>666

gacaagcttcccgttctcag20

<210>667

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>primer

<400>667

ggggctagactgctcaactg20

<210>668

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>primer

<400>668

gccaagttttggctgaagag20

<210>669

<211>2350

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>ncbireferencesequencenm_001047.3

<400>669

ttactgcggccccggcgtgggtggggcgcttgcaggtccctccccgcgcaagtgctcgcc60

ccgcccccggggccgcacccacagccccggctaccccggagaagcctgacttgagaaccc120

tttctgcagagtcccggcagtgcgggactccggtagccgcccctccggtagccgcccctc180

ctgcccccgcgccgccgccctatatgttgcccgccgcggcctctggggcatggagcacgc240

tgcccagccctggcgatggcaacggcgacgggggtggcggaggagcgcctgctggccgcg300

ctcgcctacctgcagtgcgccgtgggctgcgcggtcttcgcgcgcaatcgtcagacgaac360

tcagtgtacggccgccacgcgctgcccagccacaggctccgagtgccggcgcgggccgcc420

tgggtggtgcaggagctgccctcgctggccctgccgctctaccagtacgccagcgagtcc480

gccccgcgtctccgcagcgcgcccaactgcatcctcctggccatgttcctcgtccactac540

gggcatcggtgcttaatttacccatttctgatgcgaggaggaaagcctatgccactgttg600

gcgtgtacaatggcgattatgttctgtacctgtaacggctatttgcaaagcagatacttg660

agccattgtgcagtgtatgctgatgactgggtaacagatccccgttttctaataggtttt720

ggcttgtggttaacgggcatgttgataaacatccattcagatcatatcctaaggaatctc780

agaaaaccaggagatactggatacaaaataccaaggggaggcttatttgaatacgtaact840

gcagccaactattttggagaaatcatggagtggtgtggctatgccctggccagctggtct900

gtccaaggcgcggcttttgctttcttcacgttttgttttttatctggtagagcaaaagag960

catcatgagtggtacctccggaaatttgaagagtatccaaagttcagaaaaattataatt1020

ccatttttgttttaagtgcgtttttcatgaaattatcttcaacttgaagctttccaatgg1080

cgcttctctatggactttgtaaataagttatatctttgtaattttcctgctactttatca1140

ttttcaagatgtcctctaggaattttttttctagtaattttgcaatctacctaataagta1200

cctaaatacgctgaaatggaggttgaatatcctactgtgtaacaggtcagaatttcaagc1260

tctgggtaataactgctgatattttttctaatttcaaatttacctcttttggctatgtct1320

tgccaagtgtgtatgagactagactttacaactgtctttgatggcattttcagaacaata1380

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