一种用于快速鉴定鸽性别的引物、试剂盒及其方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速鉴定鸽性别的引物、试剂盒及其方法。

背景技术：

鸽子属于单态鸟，其雌雄外貌形态差别甚微，无论是雏鸽还是成年鸽都很难从外观形态或其他行为上加以区分。性别鉴定在鸽子育种和控制养殖成本中尤为重要。如果性别比例不当，不利于产业化饲养管理与繁殖育种；不同性别的个体其营养需求也不同，尤其在“双母配对”模式的蛋鸽产业中更为突出。因此，早期的性别鉴定将有助于满足生产需求，具有重要实践意义和经济价值。

目前用于鸽子性别鉴定的传统方法主要有翻肛法、腹腔镜检法、体尺测量法和粪便类固醇检测等，鉴别准确率低，耗时耗力，且伤害性大。现有技术中存在的一些鉴定鸽子性别的引物和方法，但公开的引物一些仅仅是扩增出一条带，有的引物的两条扩增条带太近，不易分辨，特异性不好，甚至出现假阴性的可能，给规模养鸽生产造成极大损失。

技术实现要素：

为了解决上述鉴定鸽子性别的引物和方法的特异性不好，不易分辨及易出现假阴性等技术问题，本发明提供一种用于快速鉴定鸽性别的引物、试剂盒及其方法。本发明还提供了一种快速的样品裂解dna提取试剂。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

一种用于快速鉴定鸽性别的引物，该引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物序列如seqidno.1所示，所述下游引物序列如seqidno.2所示。

一种用于快速鉴定鸽性别的试剂盒，其包括如上所述的引物。

如上所述的试剂盒，优选地，还包括pcr反应液、dna提取液。

如上所述的试剂盒，优选地，所述dna提取液包括裂解液a和裂解液b，所述裂解液a为np40-pbs缓冲液，所述裂解液b为te缓冲液。

np40-pbs缓冲液中的np40的体积浓度为1％，pbs的ph值7.4，其配制方法为0.01mol/lna2hpo4，0.8％nacl，0.02％kcl，0.024％kh2po4，1％np40；

te缓冲液的te的ph值为8.0，其的配制方法为10mmol/ltris.cl,1mmol/ledta。

一种用于鉴定鸽性别的pcr试剂，由seqidno.1和seqidno.2所示的引物对、2×permixtaq、双蒸水组成，其中所述引物对中各引物在所述的pcr试剂中的终浓度均为0.2μmol/l，所述2×permixtaqmix在所述的pcr试剂中终浓度为1×permixtaq。

采用该pcr试剂只需要再加入鸽的羽毛或血液提取的dna，进行pcr扩增，即可对待测鸽的性别进行鉴定。

一种用于快速鉴定鸽性别的方法，包括以下步骤：

s1、提取鸽的羽髓或血液样品中的dna；

s2、采用如上所述上游引物和下游引物，对步骤s1获得的dna进行pcr扩增反应；

s3、对步骤s2获得的pcr扩增产物采用凝胶电泳分析进行结果判定：

若扩增产物在448bp和635bp位置同时出现两条电泳条带、或在448bp位置出现一条电泳条带，则为雌性；

若扩增产物只在635bp位置出现一条电泳条带，则为雄性。

如上所述的方法，优选地，所述步骤s1的操作包括选择鸽子羽毛样品，则收集羽髓，或鸽子血液样品，并与裂解液a混合，95℃，加热10分钟，再加入裂解液b，取上清液即获得鸽的羽髓或血液样品的基因组dna；其中，所述裂解液a为np40-pbs缓冲液，所述裂解液b为te缓冲液。该提取dna的方法不需要离心完成样品的裂解前处理，上清即为样品基因组dna，取上清1.5μl用于pcr扩增，其余贮存在-20℃备用。本发明的提取dna的处理方法使得耗时耗力的dna提取工作变得简单，且不需要离心，可以同时处理大批样品，处理成本极低，对室温或冷藏下保存的临床样品在48-72小时均有效。该方法的可操作性显著增强。需要说明的是血液样品适合于任何日龄的鸽子，只要10μl血液即可；羽毛样适用于乳鸽，这两种采样方式都不会造成动物较大的应激，对鸽子造成的危害较小。

如上所述的方法，优选地，在步骤s2中，所述pcr扩增反应的体系包括：1.5μldna模板，10μl2×permixtaq、如上所述引物终浓度为0.2μmol/l，用双蒸水补齐，反应体系的总体积为20μl。

如上所述的方法，优选地，在步骤s2中，所述pcr扩增反应的程序为：95℃，预变性5min；延伸按94℃，10s，50℃，30s，72℃，40s进行30个循环；72℃，保温7min，16℃结束。

扩增获得的pcr产物可用琼脂糖浓度1.5％，120伏特，20分钟进行琼脂糖凝胶电泳判断。

如上所述的方法，优选地，在步骤s2中，同时采用如seqidno.3所示序列作为雌性阳性对照；和/或采用如seqidno.4所示序列作为雄性阳性对照。

也就是说，做pcr扩增时，同时采用seqidno.3所示序列作为dna模板，作为雌性阳性对照，其扩增结果为仅在448bp有一条扩增条带。

采用如seqidno.4所示序列作为雄性阳性对照，其扩增结果应为在635bp有一条条带。阳性对照扩增出条带，说明所用设计的体系没有问题，不会出现假阴性或不准确问题。如果阳性对照没有扩增出来，说明检测试剂被污染或失效，应重新配置体系或重新合成引物进行检测。

如上所述的方法，优选地，在步骤s2中，同时采用无菌水作为阴性对照，进行pcr扩增，扩增结果应为阴性，即没有条带出现。这样检测结果是可靠准确的。如果出现有条带，说明检测试剂已经被污染，检测结果会出现假阳性，结果是不准确的，应重新采用新的检测试剂进行检测。

本发明的有益效果在于：

本发明通过对多组引物对的比较，筛选出了一种用于鉴定鸽子性别的引物对，所述引物的序列如seqidno.1和seqidno.2所示，该引物具有特异性好，分辨率高，扩增结果直观可辨等优点。

本发明利用雌雄鸽子性染色体zw(雌性)和zz(雄性)上chd基因长度及同源序列的差异，使用对鸽子伤害小且零污染的材料，如羽毛、血液等，运用pcr(聚合酶链式反应)扩增和琼脂糖凝胶电泳分离等技术对鸽子进行性别鉴定。从而降低检测成本，提高检测率，降低技术门槛，在鸽子的育种和繁殖中具有极强的创新性。

本发明应用的羽髓dna提取裂解液，快捷简单，更为重要的是省掉了商品化dna提取试剂盒的提取步骤，节约了成本，减少了对环境的污染，是一种绿色环保的组织dna获取方法。

本发明提供的pcr扩增-琼脂糖电泳技术和基因分型方法确定鸽性别的方法和试剂盒，不需进行酶切，只需要琼脂糖凝胶电泳一步法判定，而且，相对于一条特异性产物，两条特异性产物具有更高的辨识度，且扩增片段大小差异大，使得扩增结果直观清晰可辨。

本发明还提供了一种简化样品裂解的前处理过程，缩短了鉴定鸽子性别的时间成本，降低了经济成本、操作简单、鉴别速度快、适合规模养鸽业大样本的快速鉴定，具有广泛的市场利用前景。

附图说明

图1为利用引物chd450扩增雄鸽和雌鸽的pcr结果，其中，m为marker，1～4为雌鸽样本，5～8为雄鸽样本。

图2为利用引物chd243扩增雄鸽和雌鸽的pcr结果，其中，1～5为雌鸽样本。

图3为利用引物chd635扩增血液样品雄鸽和雌鸽的pcr结果，其中，m为marker，1为阳性对照，2为空白对照，3～5为雌鸽样本，6～8为雄鸽样本。

图4为利用引物chd635扩增羽髓样品雄鸽和雌鸽的pcr结果，其中，1～4为雌鸽样本，m为marker，5～7为雄鸽样本，2为空白对照。

图5为快速样品裂解液筛选实验结果，其中，1～5为本发明裂解液所处理雌鸽样本，6～10为其他裂解液所处理的雌鸽样本。

图6和图7为本发明裂解液处理样品得到的pcr扩增结果，其中，雄鸽样本；chd-z片段长度635bp；雌鸽样本：chd-z片段长度635bp和chd-w片段长度448bp或chd-w片段长度448bp。

图8为雄鸽解剖图。

图9和图10为本发明所述的裂解液处理临床羽毛部分样品的pcr扩增结果，其中，结果判定是雄性；chd-z片段长度：635bp；雌性：chd-z片段长度635bp和chd-w片段长度448bp或chd-w片段长度448bp。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1血液或羽髓样品dna的提取

(1)羽毛毛囊中羽髓样品dna的提取方法：由于鸽子羽毛中富含蛋白成分，有效地扩增带来很大的难度；发明人在研究前期摸索了多种羽毛样裂解液，通过大量实验验证，最终确定有效可行羽毛样裂解液。将新采摘的羽毛沿根部按压出羽髓置于1.5mlep管中，封装并标记鸽子编号，加入300微升裂解液a，95℃，加热10分钟，再加入30微升裂解液b，完成样品的提取处理，上清即为羽毛羽髓样品基因组dna，取上清1.5μl用于pcr扩增，其余贮存在-20℃备用。血液或羽毛样品样品在室温或冷藏下48-72小时均有效。此方法用于15-30日龄的乳鸽更方便。其中裂解液a为np40-pbs缓冲液，其配制方法为0.01mol/lna2hpo4，0.8％nacl，0.02％kcl，0.024％kh2po4，1％np40；即pbs的ph值7.4，np40浓度为1％；裂解液b为te缓冲液，配制方法为10mmol/ltris.cl,1mmol/ledta，ph值为8.0。

(2)血液样品dna的提取方法：本发明人将裂解液a和b用于提取血液样品的dna时，发现提取效果等同于采用商用dna提取试剂盒的效果，但比商用试剂盒更节省时间，操作更简单，且费用低，经济实用。具体操作方法为：用移液器取血液10微升或用棉签蘸取一滴血，用1.5mlep管封装并标记鸽子编号，按照1：9的体积比加入裂解液a，95℃，加热10分钟，再加入1/10体积的裂解液b，完成样品的提取处理，上清即为血液样品基因组dna，取上清1.5μl用于pcr扩增，其余贮存在-20℃备用。血液样品在室温或冷藏下48-72小时均有效。

实施例2chd基因扩增引物筛选和特异性实验

本发明中筛选chd基因作为靶基因进行pcr扩增检测，设计了多组扩增引物，下面分别以扩增片段大小为450bp，243bp，635bp为例来进行筛选说明。

样品处理方法同实施例1。

1.pcr扩增如下：

(1)按实施例1中所述的羽髓或血液样品的处理方法得到样品上清，取1.5μl作为pcr反应的模板，pcr反应体系(20μl)：1.5μl样品dna模板和18.5μlpcr反应试剂。其中pcr反应试剂包括：引物对、2×permixtaq(可采天根生物技术有限公司试剂)、双蒸水组成；引物对包括上游引物和下游引物；所述引物对中各引物在所述的pcr试剂中的浓度均为0.2μmol/l，所述在所述的pcr试剂中为。具体pcr反应体系含量如下：10μl2×permixtaq；0.4μl上游引物(0.1μmol/l)；0.4μl下游引物(0.1μmol/l)；7.7μl去离子水。

(2)pcr反应程序为：95℃，5min，30个循环(94℃，10s，50℃，30s，72℃，40s)，72℃，7min，16℃结束。基因型判定用琼脂糖浓度1.5％，120伏特，20分钟进行琼脂糖凝胶电泳判断。

2.chd基因扩增引物筛选和特异性实验

按实施例1中所述的羽髓或血液样品dna提取方法，对已知的公母鸽获得样品dna用于以下试验。

chd450的上、下游引物的序列分别为seqidno：5和seqidno：6。chd450扩增的目的片段分别为chd-z和chd-w，其长度分别为450bp和380bp，其pcr扩增结果如图1，其中，m为marker，1～4为雌鸽样本，5～8为雄鸽样本。从图1中可以看出，无论是公鸽样品，还是母鸽样品均扩增出了二条条带，且条带长度相近，不能准确地区分公母鸽，可能引物中存在非特异性结合，产生错误扩增，该引物不宜作为鸽子性别鉴定的引物。

chd243的上、下游引物的序列分别为seqidno：7和seqidno：8。chd243扩增的目的基因片段为chd-w，其长度为243bp，该引物是根据chd1基因在zw染色体上序列的不同，设计一条母鸽特异的引物进行扩增，公鸽无扩增条带，母鸽在243bp处有一条条带，从而鉴定鸽子性别。本发明用母鸽样品进行对比试验，结果如图2，其中，1～5为雌鸽样本。从图2中可以看出，该引物在最适温度下的扩增结果并不理想，其对低浓度质量较差的复杂模板dna的扩增效率比较低，这可能与引物本身有关，该引物的不足是未扩增出条带的样本不能直接进行判定，既有可能是公鸽也有可能是未能有效扩增的母鸽。有明显的非特异性扩增，因此不适合作为鸽子性别鉴定的引物。

chd635的上、下游引物的序列分别为seqidno：1和seqidno：2所示。chd635(引物为seqidno：1和seqidno：2所示)扩增的目的片段分别为chd-z和chd-w，其长度分别为635bp和448bp，其pcr扩增结果如图3和图4所示，其中图3中采用的是血液样品条带m为marker，1为阳性对照，2为空白对照，3～5为雌鸽样本，6～8为雄鸽样本；图4中为羽髓样品其中，条带1～4为雌鸽样本，m为marker，5～7为雄鸽样本，2为空白对照。pcr扩增结果表明：利用该对引物pcr扩增，母鸽样品可在琼脂糖凝胶电泳上显示两条长度分别为635bp与448bp的条带，而公鸽样品只能扩增出一条长度为635bp的条带，且两条带间距较大，因此易于判断出待测样品的性别。

实施例3快速样品裂解液筛选实验

利用鸽子羽毛无损伤采样方式进行性别鉴定，很易于在生产中推广，但是羽毛中所含有效核酸部分较少，这给有效地核酸扩增带来很大的难度。本发明人在前期摸索了多种羽毛样裂解液，最后发现本发明的快速样品裂解液，包括dna提取裂解液a(np40-pbs缓冲液，配置方法见实施例1)和裂解液b(te缓冲液，配置方法见实施例1)，裂解效果最好，能够有效地满足扩增试验，实现性别快速分子鉴定的可行性。将本发明的快速裂解液和其他裂解液做了比较，用seqidno：1和seqidno：2作为引物，分别用雌鸽羽毛样品验证试验，采用pcr扩增反应的体系包括：1.5μldna模板，10μlpcr反应液、如上所述引物终浓度为0.4μmol/l，用双蒸水补齐反应体系的总体积为20μl；pcr扩增反应的程序为：95℃，预变性5min；延伸按94℃，10s，50℃，30s，72℃，40s进行30个循环；72℃，保温7min，16℃结束。电泳结果如图5所示，其中，条带1～5为本发明裂解液所处理雌鸽样本，6～10为其他裂解液所处理的雌鸽样本。具体的，6-10分别为1×te缓冲液、ph＝8.0的pbs缓冲液、1％sds溶液、2.5mol/lnacl、1mol/ldtt(二硫苏糖醇)作为样品裂解液。

由图5可以知道，使用本发明的裂解液处理羽毛样品之后经过pcr反应，琼脂糖凝胶电泳，可以扩增出分辨性别的两条清晰条带，且条带的大小符合预期；而对照裂解液只扩出一条，甚至无条带扩出。由此可以认为，本发明提供的快速裂解液处理的样品进行pcr扩增，能够取得较理想的扩增效果，能够满足鸽子无损伤快速性别鉴定试验要求。

实施例4基因型与性别验证预实验

实验前用60只鸽子羽毛羽髓按照实施例3中pcr扩增步骤进行基因型鉴别，羽髓样品经样品dna提取液a和b处理，扩增结果较好，所有的样品都扩增出了清晰明显的两条条带，且条带的长度均符合预期，结果见图6和图7所示，结果为33只雌鸽，27只雄鸽。同时经解剖检验全部对应，图8为例举一例雄鸽解剖图，雄鸽有一对睾丸(箭头所示)，准确率100％，出现错误的概率6×10^-5，因此用本发明所提供的裂解液处理样品，进行pcr扩增来鉴定鸽性别，鉴定结果具有准确率近百分之百且重复性良好的特点，可以用于大规模鸽性别鉴定。

实施例5试剂盒的组装田间样品批量鉴定鸽性别试验

用于鉴定鸽子性别的试剂盒包含pcr反应液(如2×permixtaq)、样品dna提取液(裂解液a、裂解液b)以及如seqidno：1和seqidno：2所示的引物对，其中，样品dna提取液包括裂解液a(np40-pbs缓冲液)，裂解液b(te缓冲液)，所述试剂盒的pcr反应体系为：2×permixtaq10μl；上游引物(seqidno：1)和下游引物(seqidno：2)10μmol/l各0.4μl；去离子水7.7μl；1.5μl样品dna模板；总体积为20μl。同时采用seqidno.3所示序列作为dna模板，作为雌性阳性对照，采用如seqidno.4所示序列作为雄性阳性对照，无菌水作为阴性对照。

用所述组装的鉴定鸽子性别的试剂盒对共6000羽乳鸽进行性别鉴定，其中母鸽2860只,公鸽2925只，未检出样品215份，鉴定率100％，雌性样品在448bp和635bp各有一条条带，或仅在448bp有一条扩增条带雄性样品，仅在635bp有一条条带，阴性对照没有条带出现，准确检出率约96.4％，有误差的主要原因可能有三点，一是鸽子羽毛采集过程中没有真正把羽毛毛囊部分采集下来；二是羽髓采集后放置时间过长，或存放温度不合适，样品变性；三是羽髓组织分离过大，杂质含量过高使dna析出困难。由图9和图10可以知道，使用本发明所述的样品dna提取液处理羽毛样品之后经过pcr反应，琼脂糖凝胶电泳，可以获得清晰的扩增条带，易于分辨性别。不过，其中部分样品的电泳图显示有比较明显的拖带，这可能是由于鸽子羽毛中含有更复杂的成分，以及由于贮藏的时间过久，样品有一定程度上的变质。但是并不影响分辨待测样品的性别。同理，在图9和图10中的母鸽样品中，存在有部分未能扩增出635bp条带的样品，这是由于样品的dna浓度低，优先扩增了较短的片段。在实际操作中。可以直接认定扩增出448bp条带的待测样品即为雌性，故上述方法均可以有效的鉴别鸽子性别。

总之，使用本发明所述的样品dna提取液处理血液，尤其是羽毛样品，并用pcr扩增chd基因用于鸽子的性别鉴定是可以实际应用的。这种方法所需要仪器简单，使用的试剂也是常规生物试剂，非常方便，易于推广应用。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明做其它形式的限制，任何本领域技术人员可以利用上述公开的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。