枸杞多糖提取分离和纯化方法、枸杞糖肽及制备方法与流程

本发明属于提取；分离；纯化技术领域，尤其涉及一种枸杞多糖提取分离和纯化方法、枸杞糖肽及制备方法。

背景技术：

目前，业内常用的现有技术是这样的：枸杞，枸杞子的性味甘、平；枸杞叶的性味为苦、甘；性凉。功能上枸杞子可以养肝，滋肾，润肺。枸杞叶具体补虚益精，清热明目的功效。而枸杞多糖是一种水溶性多糖，是枸杞中最主要的活性成分，相对分子质量为68-200；枸杞多糖是枸杞中主要有效成分之一，具有增强免疫力、防衰老、增强造血功能、防止遗传损伤等作用，大多数现有技术利用的都是枸杞多糖的粗品；目前现有工艺的提纯方法都是用传统的醇沉水提工艺，导致提纯枸杞类产品的产率不足1％，而且混合物结构复杂，并不能得到满足功效的产品。现有技术的工艺不稳定，每次得到的产品的结构均不确定，每次的测试结果千差万别，而且产率非常低；因此，对于枸杞多糖的提取分离和纯化方法以及其组成成分和结构的分析研究报道甚少。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)现有工艺的提纯方法都是用传统的醇沉水提工艺，导致提纯枸杞类产品的产率不足1％，而且混合物结构复杂，并不能得到满足功效的产品；

(2)现有技术的工艺不稳定，每次得到的产品的结构均不确定，每次的测试结果千差万别，而且产率非常低。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种枸杞多糖提取分离和纯化方法、枸杞糖肽及制备方法。

本发明是这样实现的，一种枸杞多糖提取分离和纯化方法，所述枸杞多糖提取分离和纯化方法包括以下步骤：

步骤一：收获后，枸杞果实经干燥处理，备用；

步骤二：干果碎粉用氯仿：甲醇(2:1)混合物回流，在80℃中用80％乙醇回流提取低聚糖和小分子；在特定装置装置中，用石油醚在90℃下得到低聚糖；

步骤三：在亚临界条件下，使用加压水结合超声辅助处理得到低聚糖，在100℃下用5mpa压力和26ml×g·1的液固比，在超声功率下53分钟，得到粗lbp；

步骤四：根据不同的方法对粗lbp提取物进行去蛋白处理；

步骤五：采用亲和性和反相高效液相色谱(rphplc)的组合对产品进行纯化，纯化后将获得的过滤浓缩的水提取物加入四体积95％乙醇，沉淀多糖组分；

步骤六：利用无水乙醇和丙酮洗涤，将过滤的粗lbp沉淀冻干并储存；

进一步，步骤二中，将超声波(80w)与纤维素酶(中温)(56℃)结合，培养时间20分钟后在进行处理

进一步，步骤四中，粗lbp提取物根据不同的方法进行去蛋白处理，如酶解、sevag法、或三嵌段共聚物盐双水相萃取和透析膜。

进一步，步骤五中，沉淀多糖组分，通常在4℃下过夜培养。

进一步，步骤六中，冷冻时间一般为90小时以上。

进一步，步骤六中，用无水乙醇和丙酮洗涤后，将过滤的粗lbp沉淀冻干并储存，然后用热风干燥、真空干燥和喷雾干燥进行处理粗品lbp，方法选用喷雾干燥。

本发明的另一目的在于提供一种由所述枸杞多糖提取分离和纯化方法得到的枸杞多糖，所述枸杞多糖分离纯化得到枸杞糖肽；

所述枸杞多糖分子质量为1.524×10⁵，由阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖6种中性单糖和半乳糖醛酸及18种氨基酸组成。

进一步，所述枸杞多糖是酸性杂多糖同多肽或蛋白质构成的复合性多糖；存在glycan-o-ser的糖肽结构。

本发明的另一目的在于提供一种包含所述枸杞糖肽的抗肿瘤药物。

本发明的另一目的在于提供一种所述抗肿瘤药物的制备方法，所述抗肿瘤药物的制备方法包括：直接将药物按照10g/100ml的浓度和注射用水配置，按照动物的体重100mg/kg通过静脉注射给药。

本发明的另一目的在于提供一种由所述枸杞糖肽制备的抗肿瘤胶囊。

本发明的另一目的在于提供一种由所述枸杞糖肽制备的抗肿瘤片剂。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：枸杞多糖具有增强免疫力、防衰老、增强造血功能、防止遗传损伤等作用；枸杞多糖(lbp)是酸性杂多糖同多肽或蛋白质构成的的复合性多糖，且存在glycan-o-ser的糖肽结构；枸杞糖肽的抗肿瘤作用通过极其复杂的调控方式完成：诱导肿瘤细胞的凋亡表达；增强了身体对于肿瘤细胞的免疫能力。枸杞多糖能显著改善荷瘤小鼠的状况，使腹腔积液型荷瘤小鼠的生命延长41％～85％，并显著地抑制这两种实体瘤的生长，抑制率达81.0％和72.9％。

本发明可以将产品提纯的产率提高8倍，而且产品的纯度得以保证，功效得以保证。

附图说明

图1是本发明实施例提供的枸杞多糖提取分离和纯化方法流程图。

图2是本发明实施例提供的提取低聚糖和小分子原理装置图。

图3是本发明实施例提供的h的核磁共振图谱

图4是本发明实施例提供的c13的核磁共振图谱

图5是本发明实施例提供的ir红外光谱

图6是本发明实施例提供的tga热重分析仪(thermalgravimetricanalyzer)是一种利用热重法检测物质温度-质量变化关系示意图。

图7是本发明实施例提供的xrd(x-raydiffraction，x射线衍射)示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在利用的都是枸杞多糖的粗品；对于枸杞多糖的提取分离和纯化方法以及其组成成分和结构的分析研究报道甚少的问题；枸杞多糖具有增强免疫力、防衰老、增强造血功能、防止遗传损伤等作用。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的枸杞多糖提取分离和纯化方法包括以下步骤：

s101：收获后，枸杞果实经干燥处理，备用；

s102：干果碎粉后，用氯仿：甲醇(2:1)混合物回流，在80℃中用80％乙醇回流提取低聚糖和小分子；在特定装置装置中，用石油醚在90℃下得到低聚糖；

s103：在亚临界条件下，使用加压水结合超声辅助处理得到低聚糖，在100℃下用5mpa压力和26ml×g·1的液固比，在超声功率下53分钟，得到粗lbp；

s104：根据不同的方法对粗lbp提取物进行去蛋白处理；

s105：采用亲和性和反相高效液相色谱(rphplc)的组合对产品进行纯化，纯化后将获得的过滤浓缩的水提取物加入四体积95％乙醇，沉淀多糖组分；

s106：利用无水乙醇和丙酮洗涤，将过滤的粗lbp沉淀冻干并储存。

步骤s102中，本发明实施例提供的超声波(80w)与纤维素酶(中温)(56℃)结合，培养时间20分钟后在进行处理。

步骤s104中，本发明实施例提供的粗lbp提取物根据不同的方法进行去蛋白处理，如酶解、sevag法、或三嵌段共聚物盐双水相萃取和透析膜。

步骤s105中，本发明实施例提供的沉淀多糖组分，通常在4℃下过夜培养。

步骤s106中，本发明实施例提供的冷冻时间一般为90小时以上。

步骤s106中，本发明实施例提供的用无水乙醇和丙酮洗涤后，将过滤的粗lbp沉淀冻干并储存，然后用热风干燥、真空干燥和喷雾干燥进行处理粗品lbp，方法选用喷雾干燥。

本发明进一步从枸杞多糖(lbp)中分离纯化得到5种免疫活性较强的糖缀合物，统称为枸杞糖肽(简称lbgp)，lbp纯品含有4个级分，lbp的分子质量约为1.524×105，由阿拉伯糖(ara)，鼠李糖(rha)，木糖(xyl)，甘露糖(man)，半乳糖(gal)和葡萄糖(glc)6种中性单糖和半乳糖醛酸及18种氨基酸组成。枸杞多糖(lbp)是酸性杂多糖同多肽或蛋白质构成的的复合性多糖，且存在glycan-o-ser的糖肽结构。

下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步详细说明；

实施例1；

在所有的枸杞果实成分中，lbp(一种多糖)是被研究最多的，因为它被认为主要负责不同的生物效应，具有潜在的健康益。设计合适的程序以获得高收率的纯lbp提取物，并且可以通过体外、体内和临床研究进行化学表征和测试lbp实际的功效。

本发明的详细工艺是：收获后，枸杞果实经干燥、冷冻和粉状后储存。

收获和贮藏预处理之间的时间间隔对最终lbp产品的质量定量特性有着深刻的影响。在本工艺的处理中，冷冻可以防止细胞内酶的作用，从而可以改变多糖底物，因此在提取前的所有阶段，此过程被认为是最重要的，一般冷冻90小时以上。

如图2所示，本发明提供的提取低聚糖和小分子原理装置图；

(1)干果碎粉可以用氯仿：甲醇(2:1)混合物回流，然后在80℃中用80％乙醇回流提取低聚糖和小分子。在特定装置装置中(如图2所示)，用石油醚在90℃下得到低聚糖。

(2)在亚临界条件下使用加压水结合超声辅助处理得到的低聚糖，在100℃下用5mpa压力和26ml×g·1的液固比，在超声功率下53分钟，得到lbp的8.7％产率。

为了防止超声处理导致磷脂膜的破坏，导致所有细胞组分的泄漏，包括多糖，将超声波(80w)与纤维素酶(中温)(56℃)结合，培养时间20分钟后在进行处理。所得产品的产率以及后期的功效可以得到很好的保证。

(3)粗lbp提取物根据不同的方法进行去蛋白处理，如酶解、sevag法、或三嵌段共聚物盐双水相萃取和透析膜。

(4)几种去蛋白方法均可，然后采用亲和性和反相高效液相色谱(rphplc)的组合对产品进行纯化，纯化后将获得的过滤浓缩的水提取物加入四体积95％乙醇，沉淀多糖组分，通常在4℃下过夜培养。

(5)最后，用无水乙醇和丙酮洗涤后，将过滤的粗lbp沉淀冻干并储存，然后用三种方法进行处理粗品lbp，方法选用喷雾干燥。

喷雾干燥工艺是工业生产中最理想的喷雾干燥工艺。应用这种方法，lbp粉末的透明度和形态，由均匀的空心球表征，表明产品具有最佳的质量。此外，喷雾干燥的lbp样品表现出最高的自由基清除活性。

下面结合实验对本发明的应用效果做详细的描述。

本发明做了高中低三个剂量的乳腺癌的动物学实验，计量分别为40mg/ml，60mg/ml，80mg/ml实验结果非常震惊，具有相当高的抑制肿瘤的活性，并且毒效比达400以上，使用安全性非常的高。

本发明的枸杞糖肽的调控方式：

(1)诱导肿瘤细胞的凋亡表达。一方面细胞的相关基因表达受到影响，使细胞停滞g0/gi期不能分裂增多，从而诱导肿瘤细胞凋亡；另一方面，lbp可能能通过对钙离子浓度的调控来达到诱导凋亡的过程。

(2)增强了身体对于肿瘤细胞的免疫能力。首先lbp能够促进t免疫细胞的增多，其次lbp能够促进肿瘤细胞表面配体的表达，促使身体的免疫系统找到肿瘤细胞。抑制肿瘤细胞的转移，lbp能够通过抑制肿瘤细胞间血管的生成和抑制fasl基因的表达来阻止肿瘤细胞的逃逸和转移。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。