本申请属于微生物发酵工程技术领域，具体涉及链霉菌中与聚酮类化合物放线紫红素（act）产量相关的基因。
背景技术：
现有研究普遍认为，微生物次级代谢所产生的小分子化合物对人类健康具有重要意义。统计表明，目前60%以上fda批准的抗感染和抗肿瘤的药物来源于微生物次级代谢产物。而随着越来越多微生物基因组测序工作的进行，基因组序列分析显示微生物具有产生各种次级代谢产物的巨大潜力，但部分研究表明，实验室培养条件下许多微生物次级代谢产物均无法表达，而且多数环境微生物无法在实验室条件下进行有效培养，因此严重的阻碍了微生物次级代谢物的开发。
现有研究中，链霉菌是重要的抗生素产生菌，其抗生素的产生受环境信号和自身调控基因的控制。其中天蓝色链霉菌是研究链霉菌分化和次级代谢的模式菌株，它能产生两种有颜色的抗生素放线紫红素（act蓝色）和十一烷基灵菌红素（red红色），而act和red合成酶分别属于i型聚酮合酶（i-pks）和ii型聚酮合酶（ii-pks）。天蓝色链霉菌中的这2种次级代谢产物被作为研究链霉菌次级代谢合成调控的模型，针对这2种次级代谢产物调控基因的筛选，可为抗生素产生菌遗传改造、抗生素工业菌株的产量提高或沉默基因簇的激活表达奠定良好基础。
现有技术中，发明人早期利用转座诱变技术对天蓝色链霉菌a3（2）的功能基因组进行了研究，并初步构建了天蓝色链霉菌a(3)2突变体库（具体可参见：徐钟，利用转座诱变研究天蓝色链霉菌a3（2）的功能基因组，华中农业大学2011年硕士论文），但是由于相关基因调节功能的复杂性和不确定性，因此具体哪些基因与次级代谢产物调节相关则尚需进一步深入研究和讨论。
技术实现要素：
本申请目的在于提供筛选所得的部分与微生物中act代谢调控相关的基因，从而为链霉菌次级代谢产物研究和新型药物开发奠定基础。
本申请所采取的技术方案详细介绍说明如下。
链霉菌中影响act产量的基因，所述基因在链霉菌聚酮类化合物act的合成中具有调控作用；所述微生物具体例如天蓝色链霉菌（streptomycescoelicolor）；所述基因依据其现有基因注释，分为四大类，具体而言：
细胞被合成调控类：
共7个，包括基因sco1525、sco2097、sco2132、sco3150、sco4440、sco4878、sco5174；依据现有基因注释，具体而言：
sco1525和sco2132参与细胞壁磷脂酰肌醇甘露糖基化修饰；
sco2097参与细胞壁合成；
sco3150参与细胞裂解；
sco4440参与细胞膜磷脂酰肌醇信号调控；
sco4878和sco5174参与细胞壁糖基化修饰；
本申请中，该类基因突变后（基因缺失或失活）后，act表达量（产量）下降，换言之，该类基因对于act表达量（产量）具有正向调控作用；也即，该类基因在突变后（基因缺失或失活）后，调控act表达量（产量）下降，而在将该类基因拷贝数增加或超表达后，具有调控act表达量（产量）增加的潜能；
氨基酸代谢类：
共7个；包括与氨基酸代谢相关的sco2241、sco2528、sco3345、sco5281、sco5512、sco2999、sco3962；依据现有基因注释，具体而言：
sco2241参与谷氨酸合成；
sco2528参与亮氨酸合成；
sco3345参与缬氨酸和异亮氨酸的合成；
sco5281α-酮戊二酸脱羧酶；
sco5512参与分支氨基酸代谢；
sco2999参与谷氨酸代谢，
sco3962参与预苯酸代谢；
本申请中，该类基因突变后（基因缺失或失活）后，对act表达量（产量）具有不确定性调控影响，进一步而言：
sco2241、sco2528、sco3345、sco5281和sco5512这5个基因中任一个突变后（基因缺失或失活）后，act表达量（产量）下降，换言之，这5个基因具有正向调控作用；也即，这5个基因中任一个在突变后（基因缺失或失活）后，调控act表达量（产量）下降，而在将该类基因拷贝数增加或超表达后，具有调控act表达量（产量）增加的潜能；
sco2999和sco3962这2个基因中任一个突变后（基因缺失或失活）后，act表达量（产量）上升，换言之，这2个基因具有负向调控作用；也即，这2个基因中任一个在突变后（基因缺失或失活）后，调控act表达量（产量）上升，而在将该类基因拷贝数增加甚至超表达后，具有调控act表达量（产量）下降的可能性；
胁迫、信号和转录调控类：
共14个，其中包括基因：sco0871、sco1663、sco2832、sco2987、sco3571、sco4204、sco4215、sco4358、sco6994、sco1728、sco2686、sco3008、sco5220、sco6636；
依据现有基因注释，具体而言：
sco0871参与信号调控，
sco1663、sco4204和sco2987参与环境胁迫调控，
sco2832、sco3571、sco4215、sco4358、sco6994、sco1728、sco2686、sco3008、sco5220和sco6636为转录调控蛋白；
本申请中，该类基因突变后（基因缺失或失活）后，对act表达量（产量）具有不确定性调控影响，进一步而言：
sco0871、sco1663、sco2832、sco2987、sco3571、sco4204、sco4215、sco4358和sco6994这9个基因中任一个突变后（基因缺失或失活）后，act表达量（产量）下降，换言之，这9个基因具有正向调控作用；也即，这9个基因中任一个在突变后（基因缺失或失活）后，调控act表达量（产量）下降，而在将该类基因拷贝数增加或超表达后，具有调控act表达量（产量）增加的潜能；
sco1728、sco2686、sco3008、sco5220和sco6636这5个基因中任一个突变后（基因缺失或失活）后，act表达量（产量）上升，换言之，这5个基因具有负向调控作用；也即，这5个基因中任一个在突变后（基因缺失或失活）后，调控act表达量（产量）上升，而在将该类基因回补、拷贝数增加或超表达后，具有调控act表达量（产量）下降的可能性；
转运蛋白类：
共6个；包括：sco2254、sco2534、sco3765、sco6160、sco2519、sco3185；依据现有基因注释，具体而言：
sco2254为跨膜通道蛋白；
sco2534、sco3765和sco3185参与离子转运；
sco2519参与脂质转运和抗生素外排；
sco6160参与蛋白转运；
本申请中，该类基因突变后（基因缺失或失活）后，对act表达量（产量）具有不确定性调控影响，进一步而言：
sco2254、sco2534、sco3765和sco6160这4个基因中任一个突变后（基因缺失或失活）后，act表达量（产量）下降，换言之，这4个基因具有正向调控作用；也即，这4个基因中任一个在突变后（基因缺失或失活）后，调控act表达量（产量）下降，而在将该类基因拷贝数增加或超表达后，具有调控act表达量（产量）增加的潜能；
sco2519和sco3185这2个基因中任一个突变后（基因缺失或失活）后，act表达量（产量）上升，换言之，这2个基因具有负向调控作用；也即，这2个基因中任一个在突变后（基因缺失或失活）后，调控act表达量（产量）上升，而在将该类基因回补、拷贝数增加或超表达后，具有调控act表达量（产量）下降的可能性。
本申请中，为系统的挖掘抗生素产生菌模式菌株天蓝色链霉菌中影响调控放线紫红素（act，actinorhodin）产量的系列基因，发明人采用一个基于mini-tn5的体内转座系统对天蓝色链霉菌m145进行了诱变，进一步对放线紫红素产量变化的菌株进行了筛选。实验结果表明：该诱变系统使用的载体（phl734）不含有链霉菌复制子和整合位点，通过接合转移进入链霉菌细胞后，只能发生一次转座事件，所以筛选出的每个阳性克隆子基因组上只含有一个随机插入的mini-tn5拷贝。进一步对筛选出的阳性克隆子通过酶切、自连和测序定位出转座子在基因组上的位置，并以多次筛选定位同一基因的原则排除自发突变基因，最终确定影响放线紫红素产量的基因。进一步以野生型菌株为参照，通过发酵培养，最终确定相关基因对放线紫红素产量造成了影响。而基于这些筛选结果，进一步通过基因工程技术手段可为相关代谢产物产量调节或者新的次生代谢产物的合成奠定基础。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。
生物材料：
天蓝色链霉菌m145（streptomycescoelicolorm145）（原养野生型菌株a3(2)），作为转座诱变出发菌株；
大肠杆菌et12567/puz8002（escherichiacoliet12567/puz8002）用于将质粒phl734导入天蓝色链霉菌m145；
质粒phl734携带转座原件mini-tn5及转座酶，用于天蓝色链霉菌m145的转座诱变；
实验试剂：
lb培养基用于37℃培养大肠杆菌；
yeme培养基和tsby培养基用于链霉菌液体培养，
sfm培养基加入mgso4（20mm）用于链霉菌的接合转移；
ybp培养基用于链霉菌固体培养和发酵，链霉菌培养温度为30℃；
阿泊拉霉素（apramycin，apr），抗性基因acc(3)iv，使用浓度50μg/ml；
三甲氧苄氨嘧啶（trimethoprim，tmp），使用浓度50μg/ml。
实施例1
本实施例主要就利用mini-tn5转座系统对天蓝色链霉菌m145的诱变过程简要介绍如下。需要说明的是，未详述过程可参见《利用转座诱变研究天蓝色链霉菌a3（2）的功能基因组》（徐钟，华中农业大学2011年硕士论文）。
（一）转座子对天蓝色链霉菌进行转座诱变
首先，参考现有技术，将转座子质粒phl734通过大肠杆菌菌株et12567/puz8002与天蓝色链霉菌的接合转移导入链霉菌中，受体菌和供体菌的比例为1:1；
理论上，进入链霉菌后转座酶tnp(5)开始表达，mini-tn5片段剪切、随机插入到链霉菌的基因组上，由于该质粒无法在链霉菌中复制和整合位点，质粒在转座发生后即消失；
接合转移后12~14小时左右，用tmp和apr覆盖（通过mini-tn5内部的阿泊拉霉素抗性基因筛选发生转座插入的突变子），培养4~5天左右；将得到的接合转移克隆子转接到ybp培养基上（每个突变子含有一个转座插入），筛选次级代谢物产量变化的突变株。
（二）突变菌株的转座插入定位
分别提取步骤（一）中次级代谢物产量变化突变菌株的总dna，并用apai限制性内切酶对总dna进行酶切；
酶切后的dna样品经过自连、化学转化导入大肠杆菌dh5α中；
用阿泊拉霉素筛选含有mini-tn5片段的克隆、测序，获取mini-tn5及其转座插入位点两端的基因组序列，通过序列比对定位出转座插入在染色体上的位置。
（三）突变菌株回补
选取其中5个与转录调控相关的基因sco2832、sco4215、sco4358、sco2686和sco3008进行回补验证，
pcr扩增这些基因的cds及其上游250bp启动子区序列，连接到链霉菌整合载体pmt3上，测序验证正确后，转化大肠杆菌et12567/puz8002，通过大肠杆菌与链霉菌的接合转移进入链霉菌突变菌株中；
这个5个基因的突变菌株基因组中分别导入相应的正常基因拷贝后，其放线紫红素产量都恢复到野生型的水平，说明这些多次重复筛选出的基因，对放线紫红素产量的调控100%正确。
（四）测定突变菌株的act产量
转座突变子和出发菌株分别在固体ybp中30℃培养84小时，每个培养产物取0.5g用于act产量测定；act产量测定：
0.5ml的1mnaoh加入到0.5g培养产物中，用匀质机打碎（5,000rpm,15s；两次），离心（12000×g，5min）取上清，633nm紫外线测定上清的吸光度，根据吸光度比值得出突变菌株act的相对产量（mutant633/wt633）。
实施例2
本实施例就实施例1的相关筛选结果简要介绍说明如下。
在实施例1的筛选方法基础上，结果从50000个突变子中筛选出988个放线紫红素产量变化的菌株，这些菌株的转座插入位点定位显示这些突变菌株涉及551个基因；其中部分对于放线紫红素产量具有调控影响的基因具体解释说明如下。
细胞被合成调控类：
共7个，包括基因sco1525、sco2097、sco2132、sco3150、sco4440、sco4878、sco5174；
注（下述表格数据含义相同，不再说明）：表中act相对产量表示突变菌株与野生型菌株act产量比值，小于1说明突变菌株act产量降低，0表示没有检测到act产生，多个值用“，”隔开，表示同一基因的多个突变菌株，这些突变菌株的mini-tn5在该基因上的插入位点不同。
需要说明的是，上述表格数据中，注释内容根据strepdb数据(http://strepdb.streptomyces.org.uk)和文献报道综合所得；act相对产量根据每个突变株平均值计算所得（下述表格数据含义相同，不再说明）。
对上表数据分析可以看出，7个细胞被合成相关的基因失活后，其放线紫红素产量均降低，说明细胞被的完整性是act的合成所必须的，这类基因的突变（失活）与放线紫红素产量具有正相关作用。
氨基酸代谢类：
共7个；包括与氨基酸代谢相关的sco2241、sco2528、sco3345、sco5281、sco5512、sco2999、sco3962；
分析可以看出：
sco2241、sco2528、sco3345、sco5281和sco5512基因的所有突变菌株act产量均降低，说明这些基因编码产物有利于act合成，
而sco2999和sco3962基因的所有突变菌株act产量都升高，说明这些基因的编码产物不利于act合成。
胁迫、信号和转录调控类：
共14个，其中包括基因sco0871、sco1663、sco2832、sco2987、sco3571、sco4204、sco4215、sco4358、sco6994、sco1728、sco2686、sco3008、sco5220、sco6636；
分析可以看出：
sco0871、sco1663、sco2832、sco2987、sco3571、sco4204、sco4215、sco4358和sco6994基因的所有突变菌株act产量均降低，说明这些基因的编码产物有利于act合成；
sco1728、sco2686、sco3008、sco5220和sco6636基因的所有突变菌株act产量均升高，说明这些基因的编码产物不利于act合成。
转运蛋白类：
共6个，其中包括基因sco2254、sco2534、sco3765、sco6160、sco2519、sco3185；
分析可以看出：
sco2254、sco2534、sco3765和sco6160基因的所有突变菌株act产量均降低，说明这些基因的编码产物有利于act合成；
sco2519和sco3185基因的所有突变菌株act产量均升高，说明这些基因的编码产物不利于act合成。
综上，基于上述不同基因对于act产量影响，可分别对其中一个或几个基因进行单独突变或联合突变使其失活，或者利用转基因工程进行超表达，从而有针对性调节act产量，进而进一步改善抗生素的生产性能。