一种检测苯硫酚的近红外荧光探针及其合成方法与应用与流程

本发明属于化学分析检测技术领域，具体涉及一种近红外trun-on型高选择性检测苯硫酚的荧光探针及其合方法和在检测苯硫酚方面的应用。

背景技术：

苯硫酚(c6h5sh,phsh)是一种具有高反应活性的芳基硫化物，在合成工业中有着广泛的应用，如磺胺类药物、农药及高分子的合成。但另一方面苯硫酚具有很高的毒性，呼吸及皮肤的摄入会导致各种病症，如呼吸困难、肌无力、中枢神经损伤甚至死亡。美国职业安全健康局限定了苯硫酚的工作环境最高浓度为0.1ppm。随着苯硫酚的大量工业使用排放及毒害作用，开发高灵敏、高选择检测苯硫酚的方法对环境检测与保护是非常必要的。

基于分子探针的荧光法检法具有样品处理简洁、成本低廉及操作简便快速等优点，近年来得到了发展与利用。但目前开发的用于检测苯硫酚的荧光探针分子大部分发射波长都不在近红外光区或者探针的斯托克斯位移值小(zhangw.j.dyesandpigments2016,133,248；pagidis.langmuir2018,34,8170；gengay.sensors&actuators:b.chemical2018,273,1670.)，由于较短波段的光对生物穿透能力弱且存在生物损伤性，且小的斯托克斯位移值会带来激发光的干扰，因此，这类探针分子不利于复杂样品背景干扰的消除，从而不利于复杂环境样品及生物样品的检测。而具有较大斯托克斯位移值的近红外荧光探针能很好的克服上述问题。

技术实现要素：

对于上述情况，本发明目的是提供一种易于制备、性能稳定、具有较大斯托克斯位移值的新型近红外荧光分子探针，并提供该探针的合成方法，还在此基础开发出对苯硫酚进行高选择性和高灵敏度的检测方法。

为实现本发明目的，本发明利用苯硫酚具有较强的亲核反应特性，能与缺电子分子或基团发生反应，而2,4-二硝基苯醚能与苯硫酚发生特异性的反应，本专利采用2,4-二硝基苯醚为苯硫酚的响应基团。另一方面，二氰基异佛尔酮-久洛尼定大π体系具有很好的长波长荧光发射性能，且通过在酚羟基位引入不同的吸电子基团能改变原荧光分子的推拉电子体系的特性从而改变其荧光性质，本专利设计大π共轭推拉体系骨架作为发光团，合成用于检测苯硫酚的荧光分子探针。

所述检测苯硫酚的荧光分子探针，结构式如下：

其合成反应流程如下：

其合成方法具体如下：

有机溶剂中，加入碱性化合物，将化合物2与2,4-二硝基氟苯反应，分离纯化后得到最终目标产物探针分子1。

所述有机溶剂选自乙腈、四氢呋喃、二甲基甲酰胺、n-甲基吡咯烷酮其中之一。

所述碱性化合物选自碳酸钾、碳酸钠、醋酸钠、三乙胺、n,n-二异丙基碳二亚胺其中之一。

反应时间为2-24h。

反应温度为50-120℃。

反应条件更进一步优选如下：

反应有机溶剂选自乙腈。

反应碱选自碳酸钾。

反应时间为8h。

反应温度为80℃。

利用该分子探针对苯硫酚进行定性和定量测定，用于水体、土壤或生物体系中苯硫酚的检测。

采用比色法或荧光法检测时，分子探针溶解于水与二甲基亚砜的混合缓冲溶液中，对苯硫酚进行测试。当加入苯硫酚后，苯硫酚能亲核进攻苯氧基，并进一步通过脱除反应，使荧光团的酚羟基游离出来，从而产生强烈的分子内电荷转移(ict)效应，使探针溶液的吸收光谱发生红移，并伴随产生强的近红外荧光发射特性。

采用荧光法检测时，所述荧光分子探针对苯硫酚的检测浓度为1–60μmol·l^-1，检测限为0.13μmol·l^-1。

本发明荧光探针分子具有如下特点和优点：

该荧光探针分子具有良好的稳定性和光学性质，反应前最大吸收波长为～550nm，单独溶液呈红色，无荧光发射；随着苯硫酚的加入，探针分子在紫外吸收峰红移至～685nm，溶液呈蓝色，在～730nm处有强的荧光发射性质。

本发明所述的探针分子原料易得，合成产率较高，达86％以上，光学性能稳定(探针母液能在室内稳定存放三个月以上，其光谱性质保持不变)，高选择性和高灵敏度，对苯硫酚识别能力强，响应速度较快，响应范围为1–60μmol·l^-1，检测限低(0.13μmol·l^-1)，因此，该类型探针可用于水体、土壤以及生物体系中苯硫酚的检测。

附图说明

图1为本发明合成的分子探针的核磁共振氢谱；

图2为本发明分子探针与苯硫酚反应前后的紫外谱图a与荧光光谱图b，其中，a图中，1-反应前，2-反应后；b图中，1-反应前，2-反应后；

图3为本发明10μmol·l^-1分子探针在加入不同浓度苯硫酚后荧光发射光谱图，从a至w，苯硫酚浓度分别为0、1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、150、180、100μmol·l^-1，溶液体系为水与二甲基亚砜的磷酸缓冲溶液(h2o/dmso＝1/1,v/v,10mm,ph7.4)，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

图4为苯硫酚的浓度标准曲线图，即10μmol·l^-1本发明分子探针，反应前后在730nm处荧光发射强度的和苯硫酚浓度的线性关系；横坐标为苯硫酚的浓度，纵坐标为荧光强度。

图5为本发明分子探针对苯硫酚选择性；即10μm本发明分子探针，加入200μmol·l^-1不同物质(半胱氨酸、谷胱甘肽、高半胱氨酸、s^2-、苯酚、苯胺、aco^-、clo^-、co3^2-、f^-、i^-、n3^-、no3^-、so3^2-)后，在730nm处荧光发射强度的变化；横坐标为测试的干扰物质，纵坐标为荧光强度。

图6为本发明分子探针检测hela细胞内苯硫酚的成像图片。(a,b)分别是本发明分子荧光探针(10μmol·l^-1)培养的hela的明场图片和荧光图片；(c,d)分别是本发明分子荧光探针(10μmol·l^-1)和苯硫酚(50μmol·l^-1)培养的hela细胞的明场图片和荧光图片。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：荧光分子探针的合成

将化合物2(0.385g,1mmol)，2,4-二硝基氟苯(0.186g,1mmol)加入k2co3(0.685g,5mmol)，溶剂乙腈(20ml)中80℃反应8h。待反应结束后，减压蒸馏除去溶剂，柱层析柱分离(洗脱剂为二氯甲烷)得到产物红黑色固体0.473g(收率：86％)。产物结构式如下:

¹hnmr(400hz,cdcl3):δ8.70(d,j＝8.1hz,1h),8.05(d,j＝8.7hz,1h),7.98(d,j＝7.8hz,1h),7.68(ddd,j＝32.6,20.0,11.5hz,5h),7.50(d,j＝8.5hz,2h),7.23(d,j＝16.2hz,1h),6.64(d,j＝8.4hz,2h),2.86(s,6h).ms[esi]:m/z,calcdfor[m+h]⁺552.22；found522.14。

实施例2：探针对苯硫酚的荧光检测

将上述制得分子探针溶解于水与二甲基亚砜的磷酸缓冲溶液(h2o/dmso＝1/1,v/v,10mm,ph7.4)，配制成10μmol·l^-1的探针溶液。在3ml的比色皿中加入2ml配制的10μmol·l^-1的本发明探针溶液，然后分别加入不同浓度的苯硫酚均匀混合，测试其荧光光谱，结果如图3所示。以溶液在730nm处荧光发射强度对苯硫酚的浓度作图，苯硫酚浓度在1–60μmol·l^-1范围内时，两者之间呈现良好的线性关系(图4)，能实现该浓度范围内苯硫酚的定量检测，而且溶液从红色变为蓝色，也适用于裸眼检测。并且此探针不受其它一些常见物质的影响，如半胱氨酸、谷胱甘肽、高半胱氨酸、s^2-、苯酚、苯胺、aco^-、clo^-、co3^2-、f^-、i^-、n3^-、no3^-、so3^2-。在上述干扰物存在的条件下，探针对含苯硫酚仍具有良好的选择性和灵敏度(图5)。

将细胞与含本发明探针培养液培养后，再加入苯硫酚，与含苯硫酚的溶液中培养。细胞荧光成像可观测到红色荧光(图6)。

可以看出，本发明能实现对苯硫酚的定性、定量检测，灵敏度高，检测限达0.13μmol·l^-1，且抗干扰强，并能实现细胞内的苯硫酚的检测。