本发明涉及生物医药工程的技术领域，更具体地说，涉及一种抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体、制备法和应用。
背景技术：
非洲猪瘟(africanswinefever,asf)是由非洲猪瘟病毒(africanswinefevervirus,asfv)引起的一种急性、烈性传染病，具有高度的传染性，发病率高，死亡率更高达100％；不但严重危害我国和全球的养猪业，还连带严重影响生猪产业相关的国际贸易和相关的其他行业。世界动物卫生组织(officeinternationaldesépizooties，oie)将asf列为必须报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病，是重点防控的外来病。
鉴于非洲猪瘟是一种复杂的疾病，会向四周快速传播并侵入食物链而引起重大的社会经济问题。以西班牙为例，政府为扑灭asf的项目(1985-1995)花费了将近1亿美元，有些国家为了消灭非洲猪瘟曾将全国的猪只全部扑杀。
非洲猪瘟病毒在组织和环境中的抵抗能力强，现在既没有治疗措施，也没有有效的疫苗来控制该病，全球最有效的方法就是杀死疫区及附近地区的所有猪只；从而，给养猪企业和猪农带来灾难性的后果。
近年来，世界各国科学家不断攻关，已研制出一些非洲猪瘟疫苗；但是，这些非洲猪瘟疫苗虽然能诱导产生一定水平的抗体，却不具备中和非洲猪瘟病毒的能力，无法达到有效防控非洲猪瘟的目的。这主要由于非洲猪瘟病毒是一个非常独特的dna虫媒病毒,其独特主要表现在以下几个方面:一是主要以猪的单核吞噬细胞为感染靶细胞,直接和间接破坏宿主的免疫组织,并造成严重的免疫抑制，使疫苗失效；二是病毒吸附和进入靶细胞不仅由多个蛋白分子介导,而且受体介导的胞吞作用不是唯一的机制；三是少有的遗传多变性dna病毒,具体表现在不同分离株基因组长度的多样性、感染同一头猪病毒克隆的异质性和感染及传代过程中病毒抗原的易变性；四是编码数量众多、机制复杂的抗宿主蛋白,被称为dna“艾滋病毒”。因此，使非洲猪瘟的防控技术成为世界大难题。
现在非洲猪瘟已传入我国，而且疫情不断扩散和蔓延；这一致命的猪瘟病毒可能会随时传播至亚洲其他国家，联合国粮农组织警告，对于中国爆发的此次疫情，即时的响应措施是尽快消灭它。
因此，研究开发一种可有效预防和治疗非洲猪瘟的药物，消除这种烈性传染病的祸害，是对我国医药科学界最严重的挑战，也是一項最为紧迫的任务。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体、制备法和应用，以解决现有技术无法对抗非洲猪瘟的侵染和扩散，导致无法预防更无法治疗非洲猪瘟的问题。
本发明解决上述技术问题的方案为，提供一种抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体制备法，包括如下步骤：
s1、制备获得鼠-猪嵌合抗体轻链全长基因序列和鼠-猪嵌合抗体重链全长基因序列；
s2、将所述鼠-猪嵌合抗体轻链全长基因序列和所述鼠-猪嵌合抗体重链全长基因序列克隆于载体，表达获得抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体。
在本发明的制备方法，在步骤s1之前还包括：
s0、制备杂交瘤细胞：将非洲猪瘟病毒抗原重组蛋白，或者表达非洲猪瘟病毒抗原蛋白的重组病毒，与猪cd重组蛋白一起免疫小鼠，然后细胞融合，制得可分泌抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体的杂交瘤细胞。
鉴于非洲猪瘟病毒vp73蛋白是主要结构蛋白且具有稳定的免疫原性，p54在逃避宿主防御系统的机制中起关键作用，p72参与病毒与细胞的吸附和进入；a238l是一种双功能蛋白,是强有力的免疫抑制剂，具有促细胞凋亡作用；cd2v是病毒粘附蛋白，在病毒扩散及损伤淋巴细胞过程中起重要作用。因此，本发明有的放矢优选这五种蛋白作为有代表性抗原蛋白，以此为靶点，有针对性地进行多项创新，解决“免疫抑制”和“免疫逃逸”两大根本性难题。
利用非洲猪瘟病毒vp73、p54、p72、a238l、cd2v等五种代表性抗原蛋白或者非洲猪瘟病毒其它蛋白表达于真核细胞或原核细胞中并加以纯化，或者将非洲猪瘟病毒vp73、p54、p72、a238l、cd2v等五种代表性抗原蛋白的基因或者非洲猪瘟病毒其它蛋白的基因分别插入到乳多空病毒、腺病毒、疱疹病毒、痘病毒、rna病毒等病毒载体的基因组中，构建同时表达vp73、p54、p72、a238l、cd2v或者非洲猪瘟病毒其它蛋白的重组病毒并加以纯化，得到纯化的重组病毒；
例如，利用大肠杆菌表达猪cd3重组蛋白或其它种类猪cd重组蛋白(如cd2和cd8)并纯化猪cd3重组蛋白或其它种类猪cd重组蛋白(如cd2和cd8)；
将重组蛋白中的其中一种(真核细胞或原核细胞表达并纯化的vp73、p54、p72、a238l、cd2v等五种代表性抗原蛋白或者非洲猪瘟病毒其它蛋白中的任意一种重组蛋白)，或者表达vp73、p54、p72、a238l、cd2v或者非洲猪瘟病毒其它蛋白并纯化的重组病毒，与猪cd3重组蛋白或其它种类猪cd(如cd2和cd8)重组蛋白中的一种混合均匀再加上佐剂，按常规方法免疫小鼠，然后细胞融合，制得可分泌其中一种抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体的杂交瘤细胞。
本发明将采用vp73重组蛋白与猪cd3重组蛋白作为复合抗原免疫获得的杂交瘤细胞命名为1a，将采用vp73重组蛋白与猪cd2重组蛋白作为复合抗原免疫获得的杂交瘤细胞命名为1b，将采用vp73重组蛋白与猪cd8重组蛋白作为复合抗原免疫获得的杂交瘤细胞命名为1c；将采用p54重组蛋白与猪cd3重组蛋白作为复合抗原免疫获得的杂交瘤细胞命名为2a，将采用p54重组蛋白与猪cd2重组蛋白作为复合抗原免疫获得的杂交瘤细胞命名为2b，将采用p54重组蛋白与猪cd8重组蛋白作为复合抗原免疫获得的杂交瘤细胞命名为2c；将采用p72重组蛋白与猪cd3重组蛋白作为复合抗原免疫获得的杂交瘤细胞命名为3a，将采用p72重组蛋白与猪cd2重组蛋白作为复合抗原免疫获得的杂交瘤细胞命名为3b，将采用p72重组蛋白与猪cd8重组蛋白作为复合抗原免疫获得的杂交瘤细胞命名为3c；将采用a238l重组蛋白与猪cd3重组蛋白作为复合抗原免疫获得的杂交瘤细胞命名为4a，将采用a238l重组蛋白与猪cd2重组蛋白作为复合抗原免疫获得的杂交瘤细胞命名为4b，将采用238l重组蛋白与猪cd8重组蛋白作为复合抗原免疫获得的杂交瘤细胞命名为4c；将采用cd2v重组蛋白与猪cd3重组蛋白作为复合抗原免疫获得的杂交瘤细胞命名为5a，将采用cd2v重组蛋白与猪cd2重组蛋白作为复合抗原免疫获得的杂交瘤细胞命名为5b，将采用cd2v重组蛋白与猪cd8重组蛋白作为复合抗原免疫获得的杂交瘤细胞命名为5c；依此类推。
在本发明的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体制备法，所述非洲猪瘟病毒抗原重组蛋白为真核细胞或原核细胞表达并纯化的非洲猪瘟病毒代表性抗原蛋白；将非洲猪瘟病毒代表性抗原蛋白的基因插入病毒载体的基因组中，获得所述表达非洲猪瘟病毒抗原蛋白的重组病毒；所述非洲猪瘟病毒代表性抗原蛋白包括vp73、p54、p72、a238l、cd2v中的至少一种。
在本发明的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体制备法，所述猪cd重组蛋白为真核细胞或原核细胞表达并纯化的代表性猪cd蛋白，所述代表性猪cd蛋白包括猪cd3蛋白、猪cd2蛋白、猪cd8蛋白中的至少一种。
在本发明的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体制备法，在步骤s1中，具体包括步骤：
s101、提取杂交瘤细胞的总rna，反转录制备cdna，分别扩增鼠源抗体轻链可变区和鼠源抗体重链可变区的序列；取猪淋巴细胞提取其总rna，反转录制备cdna，分别扩增猪源抗体轻链恒定区和猪源抗体重链恒定区序列；
s102、重叠延伸所述鼠源抗体轻链可变区和所述猪源抗体轻链恒定区，获得鼠-猪嵌合抗体轻链全长基因序列；重叠延伸所述鼠源抗体重链可变区和所述猪源抗体重链恒定区，获得鼠-猪嵌合抗体重链全长基因序列。
在本发明的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体制备法，在步骤s102中还具体包括：
根据鼠源抗体轻链可变区和鼠源抗体重链可变区序列及猪源抗体轻链恒定区和猪源抗体重链恒定区序列，设计引物；
利用引物lv-f/lv-r与hv-f/hv-r分别扩增鼠源抗体轻链可变区和鼠源抗体重链可变区的序列；利用引物hc-f/hc-r与lc-f/lc-r分别扩增猪源抗体轻链恒定区和猪源抗体重链恒定区的序列；
利用引物lv-f/lc-r重叠延伸扩增所述鼠源抗体轻链可变区和所述猪源抗体轻链恒定区；利用引物hv-f/hc-r重叠延伸扩增所述鼠源抗体重链可变区和所述猪源抗体重链恒定区。
在本发明的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体制备法，在步骤s2中，具体包括：
所述鼠-猪嵌合抗体轻链全长基因序列和所述鼠-猪嵌合抗体重链全长基因序列，以病毒类基因载体或非病毒基因载体进行克隆，通过昆虫细胞或其它细胞大规模发酵生产，经纯化后获得基因型的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体；
或者，将所述鼠-猪嵌合抗体轻链全长基因序列和所述鼠-猪嵌合抗体重链全长基因序列分别克隆于表达载体的两个启动子之下获得重组质粒；将所述重组质粒转染cho细胞或在昆虫细胞表达系统中表达，获得蛋白i型的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体；
或者，将所述鼠-猪嵌合抗体轻链全长基因使用限制酶双酶切克隆于表达载体的一个启动子之下；将所述鼠-猪嵌合抗体重链全长基因使用限制酶双酶切的另一个启动子之下，获得蛋白ii型的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体。
本发明将针对vp73重组蛋白与猪cd3重组蛋白由“1a杂交瘤细胞”制得的三种双靶标抗体分别命名为1a基因型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体，1a蛋白i型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体，1a蛋白ii型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体；将针对vp73重组蛋白与猪cd2重组蛋白由“1b杂交瘤细胞”制得的三种双靶标抗体分别命名为1b基因型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体，1b蛋白i型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体，1b蛋白ii型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体；将针对vp73重组蛋白与猪cd8重组蛋白由“1c杂交瘤细胞”制得的三种双靶标抗体分别命名为1c基因型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体，1c蛋白i型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体，1c蛋白ii型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体；将针对p54重组蛋白与猪cd3重组蛋白由“2a杂交瘤细胞”制得的三种双靶标抗体分别命名为2a基因型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体，2a蛋白i型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体，2a蛋白ii型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体；将针对p54重组蛋白与猪cd2重组蛋白由“2b杂交瘤细胞”制得的三种双靶标抗体分别命名为2b基因型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体，2b蛋白i型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体，2b蛋白ii型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体；将针对p54重组蛋白与猪cd8重组蛋白由“2c杂交瘤细胞”制得的三种双靶标抗体分别命名为2c基因型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体，2c蛋白i型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体，2c蛋白ii型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体；将针对p72重组蛋白与猪cd3重组蛋白由“3a杂交瘤细胞”制得的三种双靶标抗体分别命名为3a基因型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体，3a蛋白i型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体，3a蛋白ii型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体；将针对p72重组蛋白与猪cd2重组蛋白由“3b杂交瘤细胞”制得的三种双靶标抗体分别命名为3b基因型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体，3b蛋白i型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体，3b蛋白ii型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体；将针对p72重组蛋白与猪cd8重组蛋白由“3c杂交瘤细胞”制得的三种双靶标抗体分别命名为3c基因型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体，3c蛋白i型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体，3c蛋白ii型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体；将针对a238l重组蛋白与猪cd3重组蛋白由“4a杂交瘤细胞”制得的三种双靶标抗体分别命名为4a基因型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体，4a蛋白i型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体，4a蛋白ii型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体；将针对a238l重组蛋白与猪cd2重组蛋白由“4b杂交瘤细胞”制得的三种双靶标抗体分别命名为4b基因型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体，4b蛋白i型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体，4b蛋白ii型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体；将针对a238l重组蛋白与猪cd8重组蛋白由“4c杂交瘤细胞”制得的三种双靶标抗体分别命名为4c基因型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体，4c蛋白i型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体，4c蛋白ii型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体；将针对cd2v重组蛋白与猪cd3重组蛋白由“5a杂交瘤细胞”制得的三种双靶标抗体分别命名为5a基因型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体，5a蛋白i型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体，5a蛋白ii型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体；将针对cd2v重组蛋白与猪cd2重组蛋白“5b杂交瘤细胞”制得的三种双靶标抗体分别命名为5b基因型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体，5b蛋白i型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体，5b蛋白ii型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体；将针对cd2v重组蛋白与猪cd8重组蛋白由“5c杂交瘤细胞”制得的三种双靶标抗体分别命名为5c基因型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体，5c蛋白i型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体，5c蛋白ii型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体；依此类推。
在实际应用时，可将以上抗体任意组合成全价基因型复合抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体以及全价蛋白型(分i、ii)复合抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体(由以上15种抗体组合而成)；优五价(含1a、2a、3a、4a、5a)基因型或蛋白型(分i、ii)抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体；优三价(含1a、2a、3a)基因型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体或蛋白型(分i、ii)抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体；多价(含1a、1b、1c和2a、2b、2c以及3a、3b、3c等)基因型或蛋白型(分i、ii)复合抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体。另外，可生产一种普及型的单价(仅含1a)基因型或蛋白型(分i、ii)抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体产品。
鉴于cd3存在猪全部t细胞上，因此，优五价(含1a、2a、3a、4a、5a)基因型或蛋白型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体是最经济有效的选择。
本发明还提供一种抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体，使用前述制备方法制得。
本发明还提供一种抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体的应用，使用前述制备方法制得的抗体，作为制备阻止和清除非洲猪瘟病毒对猪的侵染、和/或用于预防和治疗非洲猪瘟的药物、消毒产品中的应用。
本发明还提供一种组合物，包含上述的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体和药学上可接受的辅料。
本发明还提供一种载体，包括克隆于载体的鼠-猪嵌合抗体轻链全长基因序列和鼠-猪嵌合抗体重链全长基因序列，所述鼠-猪嵌合抗体轻链全长基因序列通过相关抗原免疫后得到的抗体轻链测序获取，所述鼠-猪嵌合抗体重链全长基因序列通过相关抗原免疫后得到的抗体重链测序获取。所述载体为基因载体或表达载体。
实施本发明，具有以下五个方面的有益效果：
1.改变疫苗预防的传统方式，解决影响疫苗效果的难题：目前世界各国主要都是在研究如何采用疫苗预防非洲猪瘟，但是，第一，非洲猪瘟病毒是少有的遗传多变性dna病毒，基因类型多，数量庞大，疫苗只能针对几种型号，对大部分型号无效；第二，非洲猪瘟病毒易变异，疫苗研制的速度跟不上病毒变异速度，加上非洲猪瘟病毒在感染及传代过程中病毒抗原的易变性，使疫苗的作用大打折扣；第三，非洲猪瘟病毒是一种特殊病毒，主要以猪的单核吞噬细胞为感染靶细胞,直接和间接破坏宿主的免疫组织,并造成严重的免疫抑制，导致疫苗不起作用，其所含凋亡蛋白可使靶细胞(巨噬细胞和其它免疫细胞)凋亡，无论是自然感染或人工感染，非洲猪瘟病毒均不产生典型的中和抗体，最近世界各国科学家研究改进的疫苗虽然能诱导产生一定水平的抗体，但并不具备中和非洲猪瘟病毒的能力，无法达到有效防控非洲猪瘟的目的，这是疫苗研制的最大障碍；第四，非洲猪瘟病毒免疫逃逸机制复杂多样，会干扰免疫调节基因的表达，逃避宿主免疫细胞的清除，这也是影响疫苗实际效果的重要因素；第五，疫苗只有预防作用，没有治疗作用，猪一旦发病注射疫苗只能雪上加霜。本发明改变了注射疫苗刺激猪体内产生抗体的传统方式，而采用直接向猪体内输入高活性抗体的被动免疫方式。本发明的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体能杀灭进入体内的非洲猪瘟病毒，阻止病毒损坏猪的器官并封闭其扩散，同时输入的大剂量双靶标抗体可裂解溶化受感染细胞并激活吞噬细胞将其清除，达到治疗效果；从而解决病猪大面积死亡的问题。由于本发明的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体属于单克隆抗体一类，单克隆抗体的效价比注射疫苗在体内产生的抗体的效价普遍高200倍以上(注：注射疫苗在体内产生抗体的效价﹥1:40即合格，双靶向抗体效价1:1万-1:100万)；从而，可从一个角度解决疫苗诱导产生的抗体不具备中和非洲猪瘟病毒的能力的难题。因此，本发明提供的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体是超越疫苗的更佳选择，是对传统预防方式的创新。
2.双靶标抗体激活受损免疫系统：双靶标抗体与普通抗体相比增加了一个特异性抗原结合位点，在治疗方面表现出了以下优势：两个抗原结合位点分别结合非洲猪瘟病毒和免疫细胞而产生桥接作用，发挥两大功能，第一个功能是可直接与非洲猪瘟病毒作用，(一)攻击并抑灭参与病毒吸附和侵入细胞的p72蛋白，阻止非洲猪瘟病毒吸附和侵入猪体内细胞，(二)攻击并抑灭作为免疫抑制剂且具有促细胞凋亡作用的a238l，消除免疫抑制，恢复免疫功能，(三)攻击和抑灭在免疫逃逸中起关键作用的p54蛋白，消除免疫逃逸，(四)攻击并抑灭在病毒扩散及损伤淋巴细胞过程中起重要作用的cd2v蛋白，阻断非洲猪瘟病毒扩散侵染其它健康细胞，保护淋巴细胞不受非洲猪瘟病毒攻击，健全免疫系统；第二个功能是激活t细胞和nk细胞等免疫细胞的功能，提高局部nk细胞或t细胞浓度，增强效应分子杀伤能力，启动细胞免疫，更有效杀死非洲猪瘟病毒及裂解、清除受感染细胞，一方面发挥免疫细胞和抗原递呈细胞的协调刺激作用，释放细胞因子，用细胞免疫抑灭和清除非洲猪瘟病毒；另一方面通过双靶标抗体在猪体内的adcc作用(抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用)裂解和溶化受非洲猪瘟病毒感染的细胞，达到治疗的效果，使病猪康复而不必宰杀和毁灭。由于非洲猪瘟病毒以猪的单核吞噬细胞为感染靶细胞,会破坏宿主的免疫组织造成严重的免疫抑制，因此，激活免疫系统是关键；本发明的双靶标抗体使导致“免疫抑制”和“免疫逃逸”的a238l和p54以及cd2v抗原蛋白失活，從而，有效激活免疫细胞。同時，两个抗原结合域可显著增强抗体的特异性和功效，治疗效果是普通抗体的100-1,000倍。因此，从另一个角度解决疫苗诱导产生的抗体不具备中和非洲猪瘟病毒能力的难题。
双靶向抗体与传统抗体相比在组织渗透率、杀灭非洲猪瘟病毒效率、脱靶毒性发生率和临床适应症等指标方面都具有明显优势。鉴于其使用剂量降为原来的1/2,000，还可显著降低治疗成本。
3.抗体猪源化延长抗体作用时间：本发明将双靶标抗体猪源化，保留鼠源抗体活性区基因序列使结合抗原能力不变，用猪源恒定区基因序列代替鼠源恒定区基因序列，避免了猪体内对异种蛋白抗体的排斥。
鼠源性的单克隆抗体虽然具有很强的抗体效应，但是如果将鼠源性的单克隆抗体直接注射到猪体内会诱发抗鼠抗体反应(指鼠源性单抗对其他动物体具有异种蛋白的免疫原性)，在猪体内的循环系统中会很快被清除掉，造成在体内半衰期较短。本发明将所制备的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体进行改造，保留抗原与抗体结合的高亲和力的基础上，去除大部分鼠源基因序列，以人猪源化基因序列代替，这样就减少了鼠单抗的异物性和免疫原性，降低了鼠源性抗体在人体内的抗抗体反应并且加强了抗体在猪体内的adcc作用(抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用)，增加了其半衰期的时长。使得本发明的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体的作用时间与作用效果都得到了增强。
4.抗体纳米脂质体化提高治疗指数：本发明将所制成的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体制成微胶囊和纳米微囊或微乳或纳米脂质体，可提高抗体的生物利用度，并产生延效作用；当将这种抗体制成口服剂或添加到饲料中供猪只食用，以口服施药方式用于预防和治疗非洲猪瘟时，纳米脂质体剂型可减少胃和消化道酶对抗体生物活性的破坏。同时，制成微胶囊和纳米微囊或微乳或者纳米脂质体化的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体可增强进入微循环血管和渗透细胞间隙的能力，使抗体更有效地渗透进入病灶部位抑灭非洲猪瘟病毒病原体，并通过胞吞作用进入受非洲猪瘟病毒感染的细胞发挥细胞免疫作用；从而，进一步提升治疗指数。
5.多种抗体优化组合全方位防治：本发明提供了15种基因型和15种蛋白型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体，既有全价的，也有多价的，更有普及型单价的。在实际应用中可根据当地流行的非洲猪瘟病毒的型号特点以及疫情和发病猪群的病情进行优化选择，采用最经济的手段，达到有效防治的目的。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体及其组合物、制备方法和应用作进一步说明：
本发明把上述双靶向抗体猪源化，然后通过cho细胞进行规模化发酵生产抗体蛋白，或在昆虫细胞表达系统中表达并大量生产高纯度含有抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体的载体，再采用蛋白或基因形式的高纯度抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体抑灭非洲猪瘟病毒，从而达到消除非洲猪瘟病毒，预防和治疗非洲猪瘟的目的。
上述抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体的制备方法如下所述。
制备双靶向抗体的方法有杂交瘤技术、化学交联法和基因工程技术等。本发明以杂交瘤技术和基因工程技术为例说明，但不限于以下说明。
s0、制备双杂交瘤细胞：
利用非洲猪瘟病毒vp73、p54、p72、a238l、cd2v等五种代表性抗原蛋白或者非洲猪瘟病毒其它蛋白表达于真核细胞或原核细胞中并加以纯化，或者将非洲猪瘟病毒vp73、p54、p72、a238l、cd2v等五种代表性抗原蛋白的基因或者非洲猪瘟病毒其它蛋白的基因分别插入到乳多空病毒、腺病毒、疱疹病毒、痘病毒、rna病毒等病毒载体的基因组中，构建同时表达vp73、p54、p72、a238l、cd2v或者非洲猪瘟病毒其它蛋白的重组病毒并加以纯化，得到纯化的重组病毒；
利用大肠杆菌表达猪cd3重组蛋白或其它种类猪cd重组蛋白(如cd2和cd8)并纯化猪cd3重组蛋白或其它种类猪cd重组蛋白(如cd2和cd8)；
将重组蛋白中的其中一种(真核细胞或原核细胞表达并纯化的vp73、p54、p72、a238l、cd2v等五种代表性抗原蛋白或者非洲猪瘟病毒其它蛋白中的任意一种重组蛋白)，或者表达vp73、p54、p72、a238l、cd2v或者非洲猪瘟病毒其它蛋白并纯化的重组病毒，与猪cd3重组蛋白或其它种类猪cd(如cd2和cd8)重组蛋白中的一种混合均匀再加上佐剂，按常规方法免疫小鼠，然后细胞融合，制得可分泌其中一种抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体的杂交瘤细胞。
s1、可变区序列与恒定区序列的克隆：提取所述双杂交瘤细胞的总rna，反转录制备cdna，分别扩增鼠源抗体可变区的轻链、重链的序列；取淋巴细胞提取其总rna，反转录制备cdna，分别扩增猪源抗体恒定区的轻链、重链序列；
轻链与重链全长基因的克隆：重叠延伸所述鼠源抗体轻链可变区和所述猪源抗体轻链恒定区，获得鼠-猪嵌合抗体轻链全长基因序列；重叠延伸所述鼠源抗体重链可变区和所述猪源抗体重链恒定区，获得鼠-猪嵌合抗体重链全长基因序列；
其中，根据鼠源抗体可变区的轻链和重链序列及猪源抗体恒定区的轻链和重链序列，设计特异性引物；
利用引物lv-f/lv-r与hv-f/hv-r分别扩增鼠源抗体可变区的轻链、重链的序列；利用引物hc-f/hc-r与lc-f/lc-r分别扩增猪源抗体恒定区的轻链、重链序列；
利用引物lv-f/lc-r重叠延伸扩增所述鼠源抗体轻链可变区和所述猪源抗体轻链恒定区；利用引物hv-f/hc-r重叠延伸扩增所述鼠源抗体重链可变区和所述猪源抗体重链恒定区。
s2、制备抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体：将所述鼠-猪嵌合抗体轻链全长基因序列和所述鼠-猪嵌合抗体重链全长基因序列克隆于基因载体，扩增后纯化获得基因型的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体；或者，将所述鼠-猪嵌合抗体轻链全长基因序列和所述鼠-猪嵌合抗体重链全长基因序列克隆于表达载体并在表达系统中表达，获得蛋白型的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体。
采用常规的分子生物学的基因克隆方法设计并构建、表达可同时靶向非洲猪瘟病毒和cd(猪cd3重组蛋白或cd2和cd8等其它种类猪cd重组蛋白)的猪源化双靶标抗体。
其中，基因型的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体的制备过程包括：所述鼠-猪嵌合抗体轻链全长基因序列和所述鼠-猪嵌合抗体重链全长基因序列，以病毒类基因载体或非病毒基因载体进行克隆，通过昆虫细胞发酵大规模生产，经纯化后获得基因型的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体；
所述病毒类基因载体包括杆状病毒；所述非病毒基因载体包括质粒dna、微环dna、裸dna、脂质体和脂质体复合物、阳离子高聚物、配体介导的靶向载体、游离载体。
其中，蛋白型的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体的制备过程包括：将所述鼠-猪嵌合抗体轻链全长基因序列和所述鼠-猪嵌合抗体重链全长基因序列分别克隆于表达载体pfast-bac-dual的两个启动子之下获得重组质粒；将所述重组质粒转染cho细胞或在昆虫细胞表达系统中表达，经纯化后获得蛋白型的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体。
也可以将所述鼠-猪嵌合抗体轻链全长基因使用bamhⅰ/ecorⅰ双酶切克隆于表达载体pfast-bac-dual的一个启动子之下；将所述鼠-猪嵌合抗体重链全长基因使用xhoⅰ/nheⅰ双酶切的另一个启动子之下。
在本发明提供的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体制备方法中，还包括：
扩大培养：挑选高表达的稳定转染细胞株，通过逐级放大的细胞反应器发酵，过滤收集上清液并去除细胞和碎片；
抗体纯化：将所述上清液通过阳离子交换层析法捕获基因型或蛋白型的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体，通过阴离子交换层析法进一步纯化和精制，再通过超滤方法进行缓冲液置换，制成高纯度基因型或蛋白型的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体。
在本发明提供的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体的制备方法中，采用如下操作处理制得的基因型或蛋白型的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体：加入保护剂制备成抗体或抗体蛋白液体制剂，或者脂质体化处理制备成纳米脂质体抗体或抗体蛋白，或者干燥成抗体或抗体蛋白干粉。
其中納米脂质体的制作可采用以下方法，本发明以此为例，但不限于这种方法：
先将基因型或蛋白型的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体低温干燥制成干粉，再加入超微粉碎机中碾磨粉碎，加工成大小在1-100nm之间、粒度超过≥15000目的超微粒子。然后，把卵磷脂和胆固醇溶于乙醚中，再将纳米化基因型或蛋白型的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体加入4mmol/l磷酸盐缓冲液(pbs)配成抗体溶液，超声处理2min(每处理0.5min，间歇.0.5min)，立即在水浴中减压旋转蒸发至呈凝胶状，漩涡振荡使凝胶转相，再继续蒸发除尽乙醚，进而超速离心(35000r/min，30min)分离除去未包入的抗体，沉淀用水洗二次，离心，得沉淀，用10mmol/lpbs稀释，即制得基因型或蛋白型的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体纳米脂质体。
另外，本发明还提供一种组合物，该组合物包含前述的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体以及药学上可接受的辅料。需要说明的是，该组合物可以是由前述的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体加上辅料制备的各种药物制剂等，也可以是制备的动保产品和消毒产品等。
前述的基因型或蛋白型的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体或纳米脂质体化的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体可以制成各种稳定制剂，包括但不限于下述制剂：
优选地，辅料包括赋形剂、填充剂、溶剂、助溶剂、表面活性剂和胶囊辅料中一种或多种。
优选地，该制剂为注射剂、喷雾剂(供环境和运输工具消毒以及养猪场和屠宰场消毒和净化)、粉剂(可制成猪饲料添加剂)、片剂、口服液剂、猪用口喷剂、鼻喷剂或胶囊等。
前述的基因型或蛋白型的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体或纳米脂质体化的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体制成注射用水针剂和粉针剂中的至少一种。其可用于以下用途：预防和治疗非洲猪瘟，养猪场猪群的净化，已受到非洲猪瘟病毒感染猪群的治疗。
或者，前述的基因型或蛋白型的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体或纳米脂质体化的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体添加辅料或基料制成水针剂和粉针剂、凝胶、洗液、片剂、泡腾片、胶囊剂、软胶囊中的至少一种，可制备用于消除非洲猪瘟病毒感染以及预防和治疗非洲猪瘟病的生物药。由于非洲猪瘟病毒可在饲料原料中存活超过30天，因此，可将抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体干粉添加到猪饲料中，生产一种预防非洲猪瘟的生物安全饲料和饲料添加剂。
下面通过具体实施例进行详细说明。
实施例1：抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体对vp73、p54、p72、a238l、cd2v等五种代表性抗原蛋白的抗体结合效价检测。
分别采用vp73、p54、p72、a238l、cd2v作为检测抗原，用“elisa”方法(酶联免疫法)检测所制得的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体的抗体效价，结果如下表所示：
注：测试样本中的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体溶液浓度为1mg/ml。
从以上检测结果可看出，所制备的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体对有代表性vp73、p54、p72、a238l、cd2v蛋白抗原都有很高的抗体结合效价。
实施例2：抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体对cd的抗体结合效价检测。以cd3抗原为例。
采用cd3作为检测抗原，用“elisa”方法(酶联免疫法)检测所制得的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体的抗体效价，结果如下表所示：
注：测试样本中的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体
溶液浓度为1mg/ml。
从以上检测结果可看出，所制备的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体对cd3抗原有很高的抗体结合效价。
实施例3：【抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体针剂】预防和治疗非洲猪瘟病毒感染的动物试验。
1.试验动物：非洲猪瘟病毒抗原和抗体双阴性的30日龄(12kg)仔猪30头，随机分为三组，空白对照组、生理盐水对照组、抗体预防组、抗体治疗组。
2.试验环境要求：在生物安全防护实验室(室内处于负压状态)进行。
3.试验用药物：1.抗体预防组和抗体治疗组使用【抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体针剂】；2.生理盐水对照组用生理盐水针剂。
4.试验方法：
(1)病毒稀释方法对非洲猪瘟病毒阳性血清用pbs稀释,使得毎毫升血清稀释液所含原血清量为1ul，经荧光定量pcr分析,所含非洲猪瘟病毒拷贝数为20,000，每头猪只攻毒剂量为1ml血清稀释液。
(2)攻毒方法每头猪只按注射原血清量1ul进行攻毒。
空白对照组(不攻毒)、生理盐水对照组(攻毒后第二天和第七天各注射一次生理盐水，每头猪每次注射2ml)、抗体预防组(攻毒前一天注射【抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体针剂】，每头猪每次注射2ml)、抗体治疗组(攻毒后第二天和第七天各注射一次【抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体针剂】，每头猪每次注射2ml)。
(3)采血检测在攻毒前一天和攻毒后的第1、2、7、10、21天进行采血和检测。
5.试验结果
(1)症状观察
(2)非洲猪瘟病毒抗原检测
6.结论：
(1)【抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体针剂】可预防仔猪受非洲猪瘟病毒感染，保护率达100％；
(2)【抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体针剂】可治疗已受到非洲猪瘟病毒感染的仔猪，治愈率达100％。
实施例4：生产抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体注射剂
将所制得的优五价(含1a、2a、3a、4a、5a)蛋白型抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体制成一种新型注射剂，用于预防和治疗非洲猪瘟。具体配方和生产工艺如下：
配方
工艺
(1)将配方量注射用水加0.1％针用活性炭，60℃搅拌15min；脱炭过滤；滤液密闭加热100℃30min，冷却至室温备用；
(2)一边搅拌一边分别将配方量磷酸二氢钠一水合物和磷酸氢二钠七水合物以及氯化钠加入占配方量90％的经活性炭处理过的灭菌注射用水中，加热溶解；另取聚山梨醇酯-80，加入peg400混匀；在搅拌下加入上述混合液中；再加0.1％针用活性炭，60℃搅拌15min,脱炭过滤；滤液密闭加热100℃30min，冷却至室温备用，得混合液a；
(3)一边搅拌一边将抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体纯化液加入占配方量10％的经活性炭处理过的灭菌注射用水，充分溶解，得抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体溶液b。
(4)一边搅拌一边将抗体溶液b以细流加于混合液a中，充分溶解，得溶液c。
(5)用0.1mol的naoh溶液调节溶液c的ph值至6.0～7.5。
(6)采用已灭菌的0.45μm串联0.22μm微孔滤膜将溶液c过滤除菌。于无菌灌封机中灌封于无菌容器中；灯检、检漏、印字、包装出厂。
实施例5：生产抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体消毒用喷雾剂溶液(供猪场、屠宰场、运输车辆消毒以及猪场净化用，也可分装在喷雾罐，制作猪用口喷剂和鼻喷剂用于猪群预防和治疗非洲猪瘟病毒感染)。
配方
工艺
(1)将配方量海藻精华、医药级甘油、香精以及403、503发泡剂用紫外光照射灭菌消毒24小时，无菌密封备用；
(2)将配方量蒸馏水加热至90℃，停留15分钟；再冷却至60℃，一边搅拌一边先后加入海藻精华和医药级甘油，低速揽拌30分钟，直至完全溶解，冷却至室温，得溶液a；
(3)一边搅拌一边将香精(玫瑰花香精)加入溶液a中，低速搅拌60min，直至完全溶解，得溶液b；
(4)将403加热至80℃，然后一边搅拌一边将503徐徐滴加入到403中，低速搅拌30min，得到溶液c；
(5)保持溶液c温度在80℃，一边搅拌一边将薄荷油徐徐滴加入到溶液c中，低速搅拌60min，得到溶液d；
(6)将溶液d加热至90℃高温灭菌5min，然后冷却至室温；
(7)一边搅拌一边将溶液b缓慢地加到溶液d中，低速搅拌60min；如未形成均质稳定的乳状溶液，则需延长搅拌时间，制得溶液e；
(8)一边搅拌一边将抗人乳头瘤病毒(hpv)和抗cd3人源化的双靶向抗体缓慢地加到溶液e中，低速搅拌60min；如未形成均质稳定的乳状溶液，则需延长搅拌时间，制得溶液f；
(9)用ph计测量溶液f的ph值，采用柠檬酸或ph4.5磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液调节ph值至4.5±0.1；
(10)静置一夜，直至上部泡沫全部消溶后，再将溶液f液分装在清洗消毒过的塑料容器中，贴上标签出厂。
实施例6：生产抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体片剂(用受非洲猪瘟病毒感染病猪的紧急救治)
配方
工艺
(1)山梨糖醇过60目筛两次备用；
(2)羧甲基纤维素分散于30％乙醇中制成1％乙醇溶液；
(3)将(1)项用适量(2)项制软材，14目筛网制粒，60℃通风干燥，18目筛整粒；用40目筛筛出适量细粉与蛋白型的抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体充分混匀；
(4)再拌入硬脂酸镁，一起与整批颗粒混合均匀，密闭4小时以上；
(5)压片机压片，每片600mg；
(6)检验合格后，包装，全验出厂。
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