针对HDAC6-cat1区域的纳米抗体及其应用的制作方法
本发明涉及生物技术或生物医学领域，涉及针对hdac6-cat1区域的纳米抗体及其应用。
背景技术：
抗体(ab)，也称为免疫球蛋白(ig)，是主要由免疫系统用于中和致病菌和病毒等病原体的浆细胞产生的大型y型蛋白质。抗体由适应性免疫系统的b细胞分泌，大部分由称为浆细胞的分化b细胞分泌，属于免疫球蛋白超家族的糖蛋白，它们构成血液蛋白质的大部分γ球蛋白部分。我们目前最常用的是igg型抗体，这类抗体在人体内也是含量最高的抗体，约9.5-12.5g/l。常规抗体通常由两条大的重链和两条小的轻链构成，重链与轻链之间通过二硫键结合形成对称的y型抗体。由于抗体可以高效地与体内和体外各种抗原特异性结合，使得抗体不仅应用于调节免疫系统方面，还能够用作医学治疗的生物工具和医学诊断方面的高灵敏的检测工具。目前，抗体药物的开发是生物技术药物研发的重要组成部分，抗体试剂的应用也是生物学实验中最常用的研究方法。因此，抗体相关产品的开发具有很大的应用前景和商业价值。
组蛋白脱乙酰基酶6(hdac6)是组蛋白去乙酰化酶家族中的一员。区别于其他家族成员，hdac6具有两个串联的催化活性结构域，并且在细胞质滞留信号(se14)和核输出信号(nes)的作用下，hdac6主要定位在胞浆中。hdac6具有非组蛋白的底物特异性，可以催化多种胞质蛋白的去乙酰化反应，具有重要的生理功能。hdac6表达或活性的异常与许多疾病的发生相关。针对hdac6的研究集中在hdac6催化区域晶体结构的解析及hdac6选择性抑制剂的研究上，有研究已对hdac6催化区域的晶体结构进行了解析，目前开发出针对hdac6的选择性抑制剂，都是一些小分子化学类药物，抗体类药物还未见报道。
研究表明，骆驼的血液中存在一种天然缺失轻链只含重链的抗体，称为重链抗体。克隆重链抗体的可变区可得到只由一个重链可变区组成的单域抗体，称为vhh抗体。vhh抗体的晶体直径仅有2.5nm，长4nm，因此又被称为纳米抗体(nanobody)。纳米抗体的大小约为12-15kda，只有传统igg型抗体的十分之一，是天然存在的可与抗原结合的最小片段。纳米抗体因其独特的结构特征和特性，相比于小分子药物特异性更高。相比于单抗类药物研发周期长，生产成本高，易降解等难题。纳米抗体具有良好的环境耐受性，稳定性高，易表达，分子量小，组织渗透性高等特性，使其具备更好的临床应用效果，在生物医疗应用方面具有很好的发展前景。
技术实现要素：
为了解决现有技术中缺少针对hdac6的选择性抑制剂(抗体类药物)的问题，本发明制备并筛选出能识别hdac6的特异性纳米抗体，基于纳米抗体相对于普通抗体的优势，为hdac6在药物开发及疾病治疗领域提供有效的理论支持。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：针对hdac6-cat1区域的纳米抗体，所述的纳米抗体的序列包括互补决定区cdr；所述互补决定区cdr包括cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列；
所述的纳米抗体的互补决定区cdr的序列包括下述(1)-(16)中的至少一种：
(1)seqidno:5所示cdr1，seqidno:6所示cdr2，seqidno:7所示cdr3；
(2)seqidno:11所示cdr1，seqidno:12所示cdr2，seqidno:13所示cdr3；
(3)seqidno:17所示cdr1，seqidno:18所示cdr2，seqidno:19所示cdr3；
(4)seqidno:23所示cdr1，seqidno:24所示cdr2，seqidno:25所示cdr3；
(5)seqidno:29所示cdr1，seqidno:30所示cdr2，seqidno:31所示cdr3；
(6)seqidno:35所示cdr1，seqidno:36所示cdr2，seqidno:37所示cdr3；
(7)seqidno:41所示cdr1，seqidno:42所示cdr2，seqidno:43所示cdr3；
(8)seqidno:47所示cdr1，seqidno:48所示cdr2，seqidno:49所示cdr3；
(9)seqidno:53所示cdr1，seqidno:54所示cdr2，seqidno:55所示cdr3；
(10)seqidno:59所示cdr1，seqidno:60所示cdr2，seqidno:61所示cdr3；
(11)seqidno:64所示cdr1，seqidno:65所示cdr2，seqidno:66所示cdr3；
(12)seqidno:69所示cdr1，seqidno:70所示cdr2，seqidno:71所示cdr3；
(13)seqidno:74所示cdr1，seqidno:75所示cdr2，seqidno:76所示cdr3；
(14)seqidno:80所示cdr1，seqidno:81所示cdr2，seqidno:82所示cdr3；
(15)seqidno:85所示cdr1，seqidno:86所示cdr2，seqidno:87所示cdr3；
(16)seqidno:91所示cdr1，seqidno:92所示cdr2，seqidno:93所示cdr3。
上述(1)-(16)的所有序列，可以替换为与该序列具有“至少80％同源性”的序列或仅一个或少数几个氨基酸替换的序列；优选为“至少85％同源性”，更优选为“至少90％同源性”，更优选为“至少95％同源性”，最优选为“至少98％同源性”。
所述纳米抗体具有seqidno:94、seqidno:95、seqidno:96、seqidno:97、seqidno:98、seqidno:99、seqidno:100、seqidno:101、seqidno:102、seqidno:103、seqidno:104、seqidno:105、seqidno:106、seqidno:107、seqidno:108或seqidno:109所示的氨基酸序列的vhh链，其编码核苷酸序列分别如seqidno:110、seqidno:111、seqidno:112、seqidno:113、seqidno:114、seqidno:115、seqidno:116、seqidno:117、seqidno:118、seqidno:119、seqidno:120、seqidno:121、seqidno:122、seqidno:123、seqidno:124或seqidno:125所示。所述的纳米抗体为vhh。
作为优选，所述vhh链包括框架去fr和互补决定去cdr；
所述框架区fr包括fr1、fr2、fr3、fr4的氨基酸序列，其氨基酸序列分别为(分别与上述的(1)-(16)对应)：
seqidno:1所示fr1，seqidno:2所示fr2，seqidno:3所示fr3，seqidno:4所示fr4；
或seqidno:8所示fr1，seqidno:9所示fr2，seqidno:10所示fr3，seqidno:4所示fr4；
或seqidno:14所示fr1，seqidno:15所示fr2，seqidno:16所示fr3,，seqidno:4所示fr4；
或seqidno:20所示fr1，seqidno:21所示fr2，seqidno:22所示fr3，seqidno:4所示fr4；
或seqidno:20所示fr1，seqidno:21所示fr2，seqidno:22所示fr3，seqidno:4所示fr4；
或seqidno:26所示fr1，seqidno:27所示fr2，seqidno:28所示fr3，seqidno:4所示fr4；
或seqidno:32所示fr1，seqidno:33所示fr2，seqidno:34所示fr3，seqidno:4所示fr4；
或seqidno:38所示fr1，seqidno:39所示fr2，seqidno:40所示fr3，seqidno:4所示fr4；
或seqidno:44所示fr1，seqidno:45所示fr2，seqidno:46所示fr3，seqidno:4所示fr4；
或seqidno:50所示fr1，seqidno:51所示fr2，seqidno:52所示fr3，seqidno:4所示fr4；
或seqidno:56所示fr1，seqidno:57所示fr2，seqidno:58所示fr3，seqidno:4所示fr4；
或seqidno:62所示fr1，seqidno:63所示fr2，seqidno:46所示fr3，seqidno:4所示fr4；
或seqidno:62所示fr1，seqidno:67所示fr2，seqidno:68所示fr3，seqidno:4所示fr4；
或seqidno:56所示fr1，seqidno:72所示fr2，seqidno:73所示fr3，seqidno:4所示fr4；
或seqidno:77所示fr1，seqidno:78所示fr2，seqidno:79所示fr3，seqidno:4所示fr4；
或seqidno:56所示fr1，seqidno:83所示fr2，seqidno:84所示fr3，seqidno:4所示fr4；
或seqidno:88所示fr1，seqidno:89所示fr2，seqidno:90所示fr3，seqidno:4所示fr4。
上述所有fr1、fr2、fr3和fr4的序列可替换为其保守序列变体。
本发明还提供dna分子(即核苷酸)，它用以编码上述针对hdac6-cat1区域的纳米抗体的vhh链，其核苷酸序列如seqidno:110、seqidno:111、seqidno:112、seqidno:113、seqidno:114、seqidno:115、seqidno:116、seqidno:117、seqidno:118、seqidno:119、seqidno:120、seqidno:121、seqidno:122、seqidno:123、seqidno:124或seqidno:125所示。
本发明还提供表达载体，其包含前述的核苷酸序列(dna分子)。
本发明还提供宿主细胞或非人生物体，其表达所述针对hdac6-cat1区域的纳米抗体，或者包含前述的表达载体。
本发明提供了针对hdac6-cat1区域纳米抗体与目标抗原在原核水平识别的应用。
本发明提供了针对hdac6-cat1区域纳米抗体用于hdac6-cat1区域抗原表位的分析鉴定的应用。
本发明提供了针对hdac6-cat1区域纳米抗体用于抗hdac6-cat1纳米抗体的特异性分析的应用。
本发明还提供了将该纳米抗体构建入pcdna/frt质粒，用于构建稳定表达抗hdac6-cat1纳米抗体细胞系，用于抗hdac6-cat1纳米抗体的功能分析的应用。
本发明还提供了前述的针对hdac6-cat1区域的纳米抗体作为hdac6的选择性抑制剂的用途。
本发明还提供了前述的针对hdac6-cat1区域的纳米抗体、前述的核苷酸序列、前述的宿主细胞、细胞系或非人生物体在制备hdac6选择性抑制剂药物中的应用。
相对于现有技术，本发明的有益效果是：本发明采用hdac6-cat1区域的片段免疫新疆双峰驼，随后利用该骆驼外周血淋巴细胞建立针对hdac6-cat1区域的纳米抗体基因文库，将hdac6全长的蛋白偶联在酶标板上，以此为抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫性的纳米抗体基因库，从而获得了针对hdac6-cat1的高结合能力及高特异性的纳米抗体基因，将此基因转入大肠杆菌中，建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株，根据序列比对软件分析各个克隆株的基因序列，获得针对hdac6-cat1区域的纳米抗体vhh链的氨基酸序列，并证明该纳米抗体可以和hdac6-cat1特异性结合，同时也获得针对hdac6-cat1的纳米抗体vhh链的氨基酸序列。并证明该纳米抗体可用于hdac6-cat1区域抗原表位的分析鉴定，同时也证明该纳米抗体可用于构建稳定表达的细胞系，用于其功能分析的应用。本发明显著的优势为目前开发出的针对hdac6的选择性抑制剂都是一些小分子化学类药物，抗体类药物还未见报道。而纳米抗体因其独特的结构特征和特性，相比于小分子药物特异性更高，相比于单抗类药物研发周期长，生产成本高，易降解等难题，纳米抗体具有良好的环境耐受性，稳定性高，易表达，分子量小，组织渗透性高等特性，使其具备更好的临床应用效果，在生物医疗应用方面具有很好的发展前景。
附图说明
图1是hdac6-cat1免疫用抗原表达纯化后sds-page分析结果图，其中泳道1：marker；泳道2：复性成功后蛋白质，说明蛋白条带大小正确且纯度高；
图2是免疫后血清效价检测图，免疫后血清效价达到104以上，证明免疫成功；
图3是两轮筛选后文库富集结果统计图，从结果可知阳性克隆数与阴性克隆数比值达到28:1，p/n比值远大于10，投入噬菌体数目与产出噬菌体数目的比值逐渐减小，证明阳性克隆得到有效的富集，筛选成功；
图4是elisa鉴定阳性克隆结果图，实验设计为一列阳性孔，一列阴性对照孔。可以看出阳性孔显色的同时阴性对照不显色，说明此次elisa实验结果数值可信；
图5是表达纯化的针对hdac6-cat1区域纳米抗体sds-page电泳图，其中两株纳米抗体seqidno:97、seqidno:99未纯化成功，其余14株纳米抗体的纯化成功，大小约15kd左右；
图6是纯化出的纳米抗体与hdac6-wt及hdac6-cat1识别效果elisa结果图，其中9株纳米抗体与hdac6-wt及hdac6-cat1都有很好的结合效果，分别是seqidno:95、seqidno:96、seqidno:98、seqidno:101、seqidno:104、seqidno:105、seqidno:107、seqidno:108和seqidno:109；
图7是细胞水平上抗hdac6-cat1纳米抗体特异性分析免疫荧光结果图，a图为未加药处理的对照组，b图为加药处理的实验组，如图所示：箭头位置为纳米抗体识别hdac6的位置，蓝色为细胞核位置；
图8是构建成功的pcdna5/frt-vhh重组真核质粒转染293fit细胞系后鉴定稳定表达wb结果示意图，泳道1:marker；2:seqidno:95；3:seqidno:104；4:seqidno:107；5:seqidno:108；6:seqidno:109；7:293fit细胞阴性对照。
具体实施方式
下面结合说明书附图，对本发明作进一步的说明。
针对hdac6-cat1区域的纳米抗体
单域抗体(sdab，也被研发者ablynx称为纳米抗体或vhh)是本领域技术人员公知的。单域抗体为其互补决定区是单域多肽的一部分的抗体。因此，单域抗体包含单个互补决定区(cdr)1(cdr1)、单个cdr2和单个cdr3。单域抗体的实例为仅有重链的抗体(该抗体天然不包含轻链)、衍生自常规抗体的单域抗体和工程化抗体。
单域抗体可以衍生自任何物种，包括小鼠、人、骆驼、美洲驼、山羊、兔和牛。例如，天然存在的vhh分子可以衍生自骆驼科物种(例如骆驼、单峰骆驼、美洲驼和原驼)提供的抗体。像完整的抗体一样，单域抗体能够选择性地结合特定抗原。单域抗体可以仅含有免疫球蛋白链的可变结构域，该结构域具有cdr1、cdr2和cdr3以及框架区。纳米抗体的分子量仅为约12-15kda，比由两条重链和两条轻链组成的普通抗体的分子量(150-160kda)小得多。
在一些实施例中，针对hdac6-cat1区域的纳米抗体复合物，其含有两种或两种以上的单链抗体，该复合物是二价抗体或多价抗体，二价或多价可以使抗体以高亲合力结合多聚体抗原。在一些实施例中，针对hdac6-cat1区域的纳米抗体只含有(1)-(16)所述的单链抗体。
值得一提的是，本发明中，与本发明公开的cdr1-3的序列同源性高的序列，也可以得到针对hdac6-cat1区域的纳米抗体。在一些实施例中，与(1)-(16)中的序列具有“至少80％同源性”的序列，或者“至少85％同源性”、“至少90％同源性”、“至少95％同源性”、“至少98％同源性”的序列都可以实现发明目的(即衍生蛋白)。
在一些实施例中，与(1)-(16)中的序列相比仅仅替换一个或少数几个氨基酸的序列，例如，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸的替换，也可以实现发明目的。实际上，在确定两个氨基酸序列之间的序列同一性程度或在确定单域抗体中的cdr1、cdr2和cdr3组合时，技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，在取代情况下，所述取代将优选为保守氨基酸取代，所述保守氨基酸，其通常可以被描述为氨基酸残基被具有相似化学结构的另一个氨基酸残基替代的氨基酸取代，并且该取代对多肽的功能、活性或其它生物学性质几乎没有或基本上没有影响。所述保守氨基酸取代在本领域是通用的，例如保守氨基酸取代是以下(a)-(d)组内的一个或少数几个氨基酸被同一组内另一个或少数几个氨基酸所取代：(a)极性带负电残基及其不带电酰胺：asp、asn、glu、gln；(b)极性带正电残基：his、arg、lys；(c)芳香族残基：phe、trp、tyr；(d)脂肪族非极性或弱极性残基：ala、ser、thr、gly、pro、met、leu、ile、val、cys。特别优选的保守氨基酸取代如下：asp被glu取代；asn被gln或his取代；glu被asp取代；gln被asn取代；his被asn或gln取代；arg被lys取代；lys被arg、gln取代；phe被met、leu、tyr取代；trp被tyr取代；tyr被phe、trp取代；ala被gly或ser取代；ser被thr取代；thr被ser取代；gly被ala或pro取代；met被leu、tyr或ile取代；leu被ile或val取代；ile被leu或val取代；val被ile或leu取代；cys被ser取代。另外，本领域技术人员知晓，单域抗体的创造性体现在cdr1-3区，而框架区序列fr1-4并非是不可改变的，fr1-4的序列可以采取本发明公开的序列的保守序列变体。
本发明采用hdac6-cat1区域免疫新疆双峰驼，经过6次免疫之后提取该双峰驼外周血淋巴细胞并建立针对hdac6-cat1区域特异的纳米抗体文库。将hdac6全长抗原偶联在酶标板上，展示正确的空间结构，使得hdac6-cat1区域的抗原表位得以暴露出来，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选hdac6-cat1区域免疫性的纳米抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库)，而获得了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：针对hdac6-cat1区域的纳米抗体文库的构建：
(1)将200μghdac6-cat1抗原(图1)与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只新疆双峰驼，每周一次，共连续免疫6次，免疫过程中刺激b细胞表达特异性的纳米抗体，其中抗体效价在免疫6次结束后测定，结果为104(图2)；(2)6次免疫结束后，提取骆驼外周血淋巴细胞100ml并提取总rna；(3)合成cdna并利用套式pcr扩增vhh；(4)利用限制性内切酶pstⅰ及notⅰ酶切20μgpmecs噬菌体展示载体及10μgvhh并连接两种片段；(5)将连接产物转化至电转感受态细胞tg1中，构建hdac6-cat1区域纳米抗体噬菌体展示文库并测定库容，库容的大小约为1.2×108；于此同时，通过菌落pcr检测所建文库的插入率，结果显示插入率达到95％。
实施例2：针对hdac6-cat1区域的纳米抗体筛选过程：
(1)取200μl重组tg1细胞至2×ty培养基中培养，期间加入40μl辅助噬菌体vcsm13侵染tg1细胞，并培养过夜以扩增噬菌体，次日利用peg/nacl沉淀噬菌体，离心收集扩增噬菌体；(2)将溶解在100mmph8.4nahco3中的hdac6-cat1重组蛋白200μg偶联在酶标板上，4℃放置过夜，同时设立负对照；(3)第二天加入100μl的3％bsa，室温封闭2h；(4)2h后，加入100μl扩增噬菌体(2×1011tfu免疫骆驼纳米抗体噬菌体展示基因库)，室温作用1h；(5)用pbs+0.05％tween-20洗掉结合的噬菌体；(6)用终浓度为25mg/ml的胰蛋白酶将与hdac6-cat1特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数生长期的大肠杆菌tg1细胞，37℃培养1h，产生并收集噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复3轮，逐步到富集(图3)。
实施例3：用噬菌体的酶联免疫方法(elisa)筛选特异性阳性克隆(图4):
(1)从上述3轮筛选后细胞培养板中，挑选175个单菌落分别接种于含100ug/ml氨苄青霉素的tb培养基的96深孔板中，并设置空白对照，37℃培养至对数期后，加入终浓度为1mm的iptg，28℃培养过夜；(2)利用渗透胀破法获得粗提抗体，并将抗体转移至经抗原包被的elisa板上，室温放置1h；(3)用pbst洗去未结合的抗体，加入100ul经1:2000稀释后的mouseanti-hatagantibody(鼠抗ha抗体)，在室温放置1h；(4)用pbst洗去未结合的抗体，加入100ul经1:2000稀释后的anti-mousealkalinephosphataseconjugate(山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体)，在室温放置1h；(5)用pbst洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，反应5-10min后于酶标仪上405波长处，读取吸收值；(6)当样品孔od值大于对照孔5倍以上时，判定为阳性克隆孔；(7)将阳性克隆孔的菌转摇在含有100ug/ul氨苄青霉素的lb培养基中以便提取质粒并进行测序。
根据序列比对软件vectornti分析各个克隆株的基因序列，把cdr1，cdr2，cdr3序列相同的株视为同一克隆株，而序列不同的株视为不同克隆株，最终获得16株抗hdac6-cat1纳米抗体。其纳米抗体的氨基酸序列为seqidno:94、seqidno:95、seqidno:96、seqidno:97、seqidno:98、seqidno:99、seqidno:100、seqidno:101、seqidno:102、seqidno:103、seqidno:104、seqidno:105、seqidno:106、seqidno:107、seqidno:108或seqidno:109所示的fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4区，构成整个vhh。
实施例4：抗hdac6-cat1纳米抗体在宿主菌大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定
(1)将上述测序分析所获得不同克隆株的质粒点转化到大肠杆菌wk6中，并将其涂布在lb+amp+glucose即含有氨苄青霉素和葡萄糖的培养平板上，37℃培养过夜；(2)挑选单个菌落接种在5ml含有岸边青霉素的lb培养液中，37℃摇床培养过夜；(3)接种1ml的过夜培养菌种至330mltb培养液中，37℃摇床培养，培养到od600nm值达到0.6-0.9时，1:1000稀释加入1miptg，28℃摇床培养过夜；(4)离心，收集大肠杆菌，利用渗透胀破法，获得抗体粗提液；(5)通过镍柱亲和层析法纯化出抗体，获得高纯度的纳米抗体，如图5所示；(6)将纳米抗体转移至经hdac6-wt和hdac6-cat1包被的elisa板上，室温放置1h；(7)用pbst洗去未结合的抗体，加入100ul经1:2000稀释后的mouseanti-hatagantibody(鼠抗ha抗体)，在室温放置1h；(8)用pbst洗去未结合的抗体，加入100ul经1:2000稀释后的山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体(anti-mousealkalinephosphataseconjugate)，在室温放置1h；(9)用pbst洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，反应5-10min后于酶标仪上405波长处，读取吸收值，结果如图6所示，其中9株纳米抗体与hdac6-wt有较好的反应，分别是seqidno:95、seqidno:96、seqidno:98、seqidno:101、seqidno:104、seqidno:105、seqidno:107、seqidno:108和seqidno:109(图6中横坐标10、12、23、43、50、53、54、73、87、119、136、147、156、189分别对应seqidno:94、seqidno:95、seqidno:96、seqidno:98、seqidno:100、seqidno:101、seqidno:102、seqidno:103、seqidno:104、seqidno:105、seqidno:106、seqidno:107、seqidno:108、seqidno:109)。
实施例5：抗hdac6-cat1纳米抗体针对hdac6-cat1区域抗原表位鉴定的应用
(1)截短蛋白的设计：对于抗原表位的分析，本课题采用在不破坏hdac6-cat1二级结构的基础上，将该区域进行截短设计，共设计6个截短蛋白，分别为cat1-h1(1-248aa)；cat1-h2(1-160aa)；cat1-h3(1-80aa)；cat1-q1(222-302aa)；cat1-q2(142-302aa)；cat1-q3(62-302aa)。载体为pet28a-gb1，引物设计为：h6-cat1c1；h6-cat1c2；h6-cat1c3；h6-cat1n1；h6-cat1n2；h6-cat1n3；(2)截短蛋白的表达纯化：以全长hdac6的编码基因为模板，通过pcr获得不同截短蛋白dna序列，经酶切，酶连，最终获得重组正确的不同截短蛋白质粒；6个截短蛋白中，cat1-h1以可溶的形式表达，选择用ni-nta的纯化方式获得；其余截短蛋白及cat1区域的蛋白以包涵体形式存在，选用包涵体复性方式获得；(3)基于elisa的抗原表位鉴定：因构建的重组质粒中带有gb1标签，gb1标签是proteing蛋白的一个结构域可以和抗体的fc结合，所以本实验中elisa设计如下：(4)包被纳米抗体：阳性孔纳米抗体，pbs稀释，500ng，每孔100μl，阴性对照孔为pbs，4℃结合过夜；(5)封闭：0.5‰pbst清洗5次，5％milk封闭，每孔200μl，室温1h；(6)加入不同的抗原截短蛋白：0.5‰pbst清洗5次，阳性孔加入带有gb1标签的抗原截短蛋白，阴性孔加入带有gb1标签的无关蛋白作对照，500ng，每孔100μl，室温1h；(7)加入hrp标记的二抗：0.5‰pbst清洗10次，每孔加入100μlanti-mousehrp抗体(1:20000)，室温1h；(8)显色：0.5‰pbst清洗10次，加显色底物，100μl每孔，避光反应10-15min；(9)酶标仪，od405波长读数；(10)数据处理及分析。使用数据处理软件：pymol、vectornti。氨基酸序列信息及晶体结构信息来自于ncbi。
对抗hdac6-cat1纳米抗体识别hdac6-cat1抗原表位晶体结构区域进行汇总，seqidno:107纳米抗体识别抗原表位部位跟其它序列均不同；seqidno:98、seqidno:105、seqidno:108纳米抗体识别抗原表位部位位置相同或近似且与其它序列不同；seqidno:96、seqidno:101、seqidno:104纳米抗体识别抗原表位部位位置相同或近似且与其它序列不同；seqidno:95纳米抗体识别抗原表位部位跟其它序列均不同；seqidno:109纳米抗体识别抗原表位部位跟其它序列均不同。而以上序列涉及的纳米抗体识别抗原表位部位位置均不同于催化口袋位置。
实施例6：抗hdac6-cat1纳米抗体细胞水平特异性鉴定的应用
(1)对于细胞水平亲和力分析(图7)，本专利中采用mg132加药处理诱导a549细胞形成聚集体，之后通过免疫荧光技术观察加药处理实验组与未加药对照组的差别，分析纳米抗体是否识别细胞内部的hdac6；(2)a549细胞的培养：完全培养基为f12k+10％fbs(胎牛血清)+1％双抗(penicillin-streptomycinsolution)；(3).第一天，铺细胞，将12孔板细胞爬片，放入12孔细胞培养板中，加入1ml细胞悬液，细胞密度为35％-40％，待细胞贴壁后，实验组加入1μmmg132，对照组不加；(4)细胞培养24h后，将培养基移除，用pbs小心清洗一遍；(5)加入1ml4％pfa固定细胞，室温15min；(6)1xpbs洗3遍，一次5min；(7)通透剂(1xpbs+0.2％tritonx-100)处理，每孔1ml，室温静置15min；(8)1xpbs洗3遍，一次5min；(9)10％bsa，室温封闭30min；(10)孵育体外表达的纳米抗体(以1mg/ml为标准，1:1000加)，稀释液为10％bsa+0.2％nan3，每孔1ml，4℃孵育过夜；(11)孵育一抗：1xpbs洗3遍，一次5min，加入一抗mouseanti-hamab(1:2000)，稀释液10％bsa+0.2％nan3，每孔加300μl，4℃过夜；(12).孵育荧光二抗：1xpbs洗4遍，一次5min，荧光二抗goatanti-mouseiggh&l(alexa
实施例7：建立抗hdac6-cat1纳米抗体稳定表达细胞系的应用(图8)
(1)为进一步检测抗hdac6-cat1纳米抗体的功能，本专利中方利用flp-in系统构建稳定表达的纳米抗体细胞系，之后将采用质谱分析技术获得与之结合的蛋白信息，进一步验证抗原表位，同时可通过检测hdac6底物蛋白乙酰化水平的变化，检测纳米抗体对hdac6活性的影响；(2)构建重组质粒pcdna5/frt-vhh，载体：pcdna5/frt；(3)转染293t细胞检测目的蛋白是否表达：293t细胞完全培养基为dmem+10％fbs；(4)第一天，铺细胞，12孔板，细胞密度35％-40％；(5)第二天，一般24h内，细胞密度达到70％-80％左右，进行转染；(6)重组质粒pcdna5/frt-vhh：脂质体＝1:3，质粒1μg，脂质体3μl，分别用无血清培养基稀释，室温静止5min，之后将质粒稀释液加入脂质体稀释液中，室温静置15min；(7)将混合液轻轻加入细胞培养基中，37℃细胞培养箱，培养36-48h，20h时换液一次；(8)细胞处理：将培养基移除，用pbs轻轻清洗一遍，之后用100μl细胞裂解液+蛋白酶抑制剂(ripa+pi)裂解细胞，冰上裂解15min，吸取细胞裂解液进1.5ml离心管中，12000rpm，10min，离心，将细胞裂解上清吸进新的离心管中；加5×lodingbuffer，用细胞裂解液稀释成1×，煮沸10min；跑sds-page蛋白胶；转膜，pvdf膜先用纯甲醇处理1min左右，恒流250ma，转膜1h；(9)5％milk室温封闭1h；(10)孵育一抗：0.5‰pbst清洗，一抗mouse-anti-hamab(1:5000)，稀释液3％bsa+0.1％nan3，4℃孵育过夜；(11)孵育二抗：0.5‰pbst清洗，二抗anti-mousehrp(1:20000)，pbs稀释，室温缓慢孵育1h；(12)曝光：0.5‰pbst清洗，曝光液a液与b液，1：1混匀，膜放至曝光盒正面朝上，用纸吸净膜上的液体，将配好的曝光液，均匀地敷在膜上曝光室用x光片曝光目的条带，检测纳米抗体是否表达；(13)转染293t-frt细胞(flp-in细胞系)：一个10cm细胞培养皿：重组质粒5μg+pog44质粒15μg+转染试剂(lipo2000)10μl；(14)加抗生素药hygromycinb(潮霉素)筛选阳性单克隆，生成稳定表达细胞系；(15)加doxycyclinehyclate(盐酸强力霉素)诱导剂诱导目的蛋白表达；(16)wb鉴定蛋白表达；(17)得到稳定表达细胞系，进行功能上的分析实验。
本发明中筛选能够特异性识别hdac6的纳米抗体，验证其特异性和结合靶抗原的能力及用于目标抗原的表位的分析。通过基因工程技术将纳米抗体基因序列构建入真核质粒载体系统pcdna5/frt中，以此来研究hdac6的生物学功能，为hdac6在生物医学领域提供了有效的纳米抗体应用工具。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应当了解，在本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中的描述只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110>南京融捷康生物科技有限公司
<120>针对hdac6-cat1区域的纳米抗体及其应用
<130>gxm20181229_02
<141>2018-12-29
<160>125
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>25
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
valglnleuglngluserglyglyglyservalglnvalglyglyser
151015
leuargleusercysalaserserala
2025
<210>2
<211>16
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
trppheargglnalaproglylysgluarggluglyvalalaalaile
151015
<210>3
<211>38
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
tyralaaspservalserglyargphethrileserglnaspasnala
151015
arglysthrleutyrleuglnmetasnserleulysprogluaspthr
202530
alamettyrtyrcysala
35
<210>4
<211>11
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
glythrglnvalthrvalserseralaalaala
1510
<210>5
<211>9
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
asnprotyrsersertyrserleugly
15
<210>6
<211>7
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
asnglytyrglyargthrser
15
<210>7
<211>19
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>7
ileglyserargtrptrptyrpropheaspproalaalatyrlystyr
151015
trpglygln
<210>8
<211>25
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>8
valglnleuglngluserglyglyglyservalglnalaglyglyser
151015
leuthrleusercysvalcyssergly
2025
<210>9
<211>16
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>9
trppheargglnalaproglylysgluargglualavalalaalaile
151015
<210>10
<211>38
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>10
tyrvalaspservalasnglyargphethrileserglnaspileval
151015
lyslysthrleuvalleuglumetasnserleulysprogluaspthr
202530
alamettyrtyrcysala
35
<210>11
<211>6
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>11
tyrileproserlysala
15
<210>12
<211>7
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>12
aspglyproglyargilearg
15
<210>13
<211>21
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>13
alaaspproargleuserthrasnasntrpserargalaproglutyr
151015
argtyrtrpglygln
20
<210>14
<211>15
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>14
valglnproglyglyserleuargleusercysalaalasergly
151015
<210>15
<211>16
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>15
trpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpvalserglyile
151015
<210>16
<211>38
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>16
tyralaaspservallysglyargphethrileserargaspasnala
151015
lysasnthrleutyrleuglnleuasnserleulysthrgluaspthr
202530
alamettyrtyrcysala
35
<210>17
<211>9
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>17
phethrpheserasntyralametglu
15
<210>18
<211>8
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>18
asnserglyglyileglythrtyr
15
<210>19
<211>18
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>19
lysglytyrglyasnmetvalvalalaglyilethrserasntyrarg
151015
glygln
<210>20
<211>25
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>20
valglnleuglngluserglyglyglyleuvalglnproglyglyser
151015
leuargleusercysalaalasergly
2025
<210>21
<211>16
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>21
trpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpvalalathrile
151015
<210>22
<211>38
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>22
tyralaaspservallysglyargphethrileserargaspasnala
151015
lysasnthrleutyrleuglnleuasnserleulysthraspaspthr
202530
alavaltyrasncysala
35
<210>23
<211>9
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>23
phethrvalserargthralametser
15
<210>24
<211>8
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>24
glythrseraspserilethrval
15
<210>25
<211>12
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>25
lyscyspheargtyrcysproproproleuthrpro
1510
<210>26
<211>15
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>26
alaglnalaglyglyserleuargleusercysproalasergly
151015
<210>27
<211>16
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>27
trppheargglnalaproglylysgluarggluglyvalalaargile
151015
<210>28
<211>38
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>28
tyralaaspservallysglyargphethrileserglnaspthrthr
151015
lysasnmetleutyrleuglnmetaspserleulysprogluaspthr
202530
alamettyrtyrcysala
35
<210>29
<211>9
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>29
leuthrserserthralacysleuala
15
<210>30
<211>8
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>30
argserleupheglyserthrtrp
15
<210>31
<211>22
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>31
alaglyargthrglyvalcystyrserglysertrpserproaspglu
151015
pheasntyrtrpglygln
20
<210>32
<211>15
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>32
valglnalaglyglyserleuargleusercysvalalasergly
151015
<210>33
<211>16
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>33
trppheargglnalaproglylysgluarggluglyvalalathrile
151015
<210>34
<211>38
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>34
tyralaaspservallysglyargphethrileserglnaspasnala
151015
lysasnthrleutyrleuglnmetasnserleulysprogluaspthr
202530
alamettyrtyrcysala
35
<210>35
<211>11
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>35
pheiletyrthrtyrsersertyrcysmetgly
1510
<210>36
<211>14
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>36
aspargaspargserthrthraspargaspargserthrthr
1510
<210>37
<211>19
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>37
alavalargserserglytyrcystyrilealaglntrptyrlystyr
151015
trpglygln
<210>38
<211>15
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>38
valglnthrglyglyserleuargleusercysilevalsergly
151015
<210>39
<211>16
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>39
trppheargglnalaproglylysgluarggluglyvalalaalaval
151015
<210>40
<211>40
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>40
thrtyrtyrthraspservallysglyargphethrileserleuasp
151015
thrthrlysasnthriletyrleuglnmetasnserleuargtyrglu
202530
aspthralamettyrtyrcysala
3540
<210>41
<211>9
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>41
tyrthrtyrserarglysthrvalgly
15
<210>42
<211>8
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>42
tyrseralaglyglythrserthr
15
<210>43
<211>19
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>43
thrglypheglyglyalaasntyrtyrasplysalaargtyrlystyr
151015
trpglygln
<210>44
<211>14
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>44
valglnalaglyglyserleuargleusercysalaalaser
1510
<210>45
<211>16
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>45
trppheargglnalaproglylysgluarggluglyvalalaserile
151015
<210>46
<211>40
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>46
thrtyrtyralaasnservallysglyargphethrileserargasp
151015
asnalalysasnthrvaltyrleuglnmetasnserleulysproglu
202530
aspthralamettyrtyrcysala
3540
<210>47
<211>10
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>47
glytyrthrtyrserserthrtyrmetala
1510
<210>48
<211>6
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>48
tyrthrglyaspglytrp
15
<210>49
<211>21
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>49
alalysthrargalavalglyglythrtrpserserproasniletyr
151015
thrtyrtrpglygln
20
<210>50
<211>24
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>50
valglnleuglngluserglyglyglyservalglnalaglyglyser
151015
leuargleusercysvalalaser
20
<210>51
<211>16
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>51
trppheargglnalaproglylysgluarggluglyvalalaalaile
151015
<210>52
<211>40
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>52
alatyrtyralaaspservalgluglyargphethrileserglnasp
151015
asnalalysasnthrvaltyrleuglnmetasnserleulysproglu
202530
aspthralamettyrtyrcysala
3540
<210>53
<211>8
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>53
argserseraspasntyrmetgly
15
<210>54
<211>4
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>54
trpglyglythr
1
<210>55
<211>20
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>55
thrglypheleulysglyglysertrpserargalagluargphehis
151015
tyrtrpglygln
20
<210>56
<211>25
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>56
valglnleuglngluserglyglyglyservalglnalaglyglyser
151015
leuargleusercysalaalasergly
2025
<210>57
<211>16
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>57
trppheargglnalaproglyglngluarggluglyvalalaalaile
151015
<210>58
<211>40
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>58
thrtyrtyrglyaspservallysglyargphethrileserlysasp
151015
ilephelysasnthrleutyrleuglnmetasnserleulysproglu
202530
gluthralamettyrtyrcysala
3540
<210>59
<211>6
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>59
glnthralaphemetala
15
<210>60
<211>6
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>60
aspthrargalaleuser
15
<210>61
<211>20
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>61
alaarglyslysproglyserserleuleuglnproglnsertyrval
151015
tyrtrpglygln
20
<210>62
<211>24
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>62
valglnleuglngluserglyglyglyservalglnalaglyglyser
151015
leuargleusercysalaalaser
20
<210>63
<211>16
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>63
trppheargglnalaproglylysgluarggluglyvalalaserile
151015
<210>64
<211>10
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>64
thrtyralatyrserserthrtyrmetala
1510
<210>65
<211>6
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>65
tyrthrglyaspglytrp
15
<210>66
<211>21
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>66
alalysthrargalavalglyglythrtrpserserproasniletyr
151015
thrtyrtrpglygln
20
<210>67
<211>16
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>67
trppheargglnargproglylysgluargglugluilealailephe
151015
<210>68
<211>40
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>68
thrsertyralaaspservallysglyargphethrileserglnasp
151015
asnalalysasnmetleutyrleuglnmetasnserleulysproglu
202530
aspthralamettyrtyrcysala
3540
<210>69
<211>10
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>69
valtyrargarghisasntyrcysmetgly
1510
<210>70
<211>5
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>70
aspargglyaspser
15
<210>71
<211>21
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>71
thrsertyrproargvalvalileglythrcysthrglyglyaspphe
151015
argvaltrpglygln
20
<210>72
<211>16
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>72
trpileargglnalaproglylysglnargglualavalalaalaile
151015
<210>73
<211>39
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>73
sertyralaaspservallysglyargphethrileserglnaspasn
151015
leulysasnthrleutyrleuglnleuasnlysleulysprogluasp
202530
thralamettyrtyrcysala
35
<210>74
<211>9
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>74
alaprotyrserthrtyrsermetgly
15
<210>75
<211>6
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>75
aspseraspglyasnile
15
<210>76
<211>24
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>76
alaasptyrproalathrserglyglyserglyglypheleualaala
151015
leuleuhislystyrtrpglygln
20
<210>77
<211>25
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>77
valglnleuglngluserglyglyglyservalglnalaglyglyser
151015
leuargleusercysalathrsergly
2025
<210>78
<211>16
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>78
trppheargglnvalproglylysgluarggluglyvalalaglyile
151015
<210>79
<211>40
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>79
thrtyrtyralaaspservallysglyargphethrileserargasp
151015
asplyslyslysthrleutyrleuglnmetglualaleuasnproglu
202530
aspthralamettyrtyrcysala
3540
<210>80
<211>9
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>80
phepropheserthrtyrcysmetgly
15
<210>81
<211>6
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>81
tyrileserhisglygln
15
<210>82
<211>23
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>82
alaglyaspargtrptyrcysproalaaspsertrpserargproglu
151015
argtyrprophetrpglygln
20
<210>83
<211>16
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>83
trpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpvalseralaile
151015
<210>84
<211>40
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>84
alathrtyralaaspservallysglyargphethrileserargasp
151015
asnalalysasnthrleutyrleuglnmetasnasnleulysthrglu
202530
aspthralavaltyrtyrcysala
3540
<210>85
<211>9
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>85
phethrphesermetasnglymetser
15
<210>86
<211>6
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>86
thrthrglyglyserval
15
<210>87
<211>16
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>87
thrglyasnglnargargproalaglnhisvalglyvaltrpglygln
151015
<210>88
<211>25
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>88
valglnleuglngluserglyglyglyservalglnalaglyglyser
151015
leuargleusercysthralasergly
2025
<210>89
<211>16
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>89
trppheargglnalaproglylysgluarggluglyvalalaalaile
151015
<210>90
<211>40
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>90
alavaltyralaaspservallysglyargphethrileserlysasp
151015
asnalaglutyrthrleutyrleuglnmetasnserleulysproglu
202530
aspthralamettyrtyrcysala
3540
<210>91
<211>6
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>91
tyrthrsersermetgly
15
<210>92
<211>4
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>92
glyilevalasn
1
<210>93
<211>21
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>93
alavalargargleuglnlyslysasnglnleualaseraspglutyr
151015
mettyrtrpglygln
20
<210>94
<211>125
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>94
valglnleuglngluserglyglyglyservalglnvalglyglyser
151015
leuargleusercysalaserseralaasnprotyrsersertyrser
202530
leuglytrppheargglnalaproglylysgluarggluglyvalala
354045
alaileasnglytyrglyargthrsertyralaaspservalsergly
505560
argphethrileserglnaspasnalaarglysthrleutyrleugln
65707580
metasnserleulysprogluaspthralamettyrtyrcysalaile
859095
glyserargtrptrptyrpropheaspproalaalatyrlystyrtrp
100105110
glyglnglythrglnvalthrvalserseralaalaala
115120125
<210>95
<211>124
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>95
valglnleuglngluserglyglyglyservalglnalaglyglyser
151015
leuthrleusercysvalcysserglytyrileproserlysalatrp
202530
pheargglnalaproglylysgluargglualavalalaalaileasp
354045
glyproglyargileargtyrvalaspservalasnglyargphethr
505560
ileserglnaspilevallyslysthrleuvalleuglumetasnser
65707580
leulysprogluaspthralamettyrtyrcysalaalaaspproarg
859095
leuserthrasnasntrpserargalaproglutyrargtyrtrpgly
100105110
glnglythrglnvalthrvalserseralaalaala
115120
<210>96
<211>115
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>96
valglnproglyglyserleuargleusercysalaalaserglyphe
151015
thrpheserasntyralametglutrpvalargglnalaproglylys
202530
glyleuglutrpvalserglyileasnserglyglyileglythrtyr
354045
tyralaaspservallysglyargphethrileserargaspasnala
505560
lysasnthrleutyrleuglnleuasnserleulysthrgluaspthr
65707580
alamettyrtyrcysalalysglytyrglyasnmetvalvalalagly
859095
ilethrserasntyrargglyglnglythrglnvalthrvalserser
100105110
alaalaala
115
<210>97
<211>119
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>97
valglnleuglngluserglyglyglyleuvalglnproglyglyser
151015
leuargleusercysalaalaserglyphethrvalserargthrala
202530
metsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpvalala
354045
thrileglythrseraspserilethrvaltyralaaspservallys
505560
glyargphethrileserargaspasnalalysasnthrleutyrleu
65707580
glnleuasnserleulysthraspaspthralavaltyrasncysala
859095
lyscyspheargtyrcysproproproleuthrproglythrglnval
100105110
thrvalserseralaalaala
115
<210>98
<211>119
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>98
alaglnalaglyglyserleuargleusercysproalaserglyleu
151015
thrserserthralacysleualatrppheargglnalaproglylys
202530
gluarggluglyvalalaargileargserleupheglyserthrtrp
354045
tyralaaspservallysglyargphethrileserglnaspthrthr
505560
lysasnmetleutyrleuglnmetaspserleulysprogluaspthr
65707580
alamettyrtyrcysalaalaglyargthrglyvalcystyrsergly
859095
sertrpserproaspglupheasntyrtrpglyglnglythrglnval
100105110
thrvalserseralaalaala
115
<210>99
<211>117
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>99
valglnalaglyglyserleuargleusercysvalalaserglyphe
151015
iletyrthrtyrsersertyrcysmetglytrppheargglnalapro
202530
glylysgluarggluglyvalalathrileaspargaspargserthr
354045
thrtyralaaspservallysglyargphethrileserglnaspasn
505560
alalysasnthrleutyrleuglnmetasnserleulysprogluasp
65707580
thralamettyrtyrcysalaalavalargserserglytyrcystyr
859095
ilealaglntrptyrlystyrtrpglyglnglythrglnvalthrval
100105110
serseralaalaala
115
<210>100
<211>118
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>100
valglnthrglyglyserleuargleusercysilevalserglytyr
151015
thrtyrserarglysthrvalglytrppheargglnalaproglylys
202530
gluarggluglyvalalaalavaltyrseralaglyglythrserthr
354045
thrtyrtyrthraspservallysglyargphethrileserleuasp
505560
thrthrlysasnthriletyrleuglnmetasnserleuargtyrglu
65707580
aspthralamettyrtyrcysalathrglypheglyglyalaasntyr
859095
tyrasplysalaargtyrlystyrtrpglyglnglythrglnvalthr
100105110
valserseralaalaala
115
<210>101
<211>118
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>101
valglnalaglyglyserleuargleusercysalaalaserglytyr
151015
thrtyrserserthrtyrmetalatrppheargglnalaproglylys
202530
gluarggluglyvalalaseriletyrthrglyaspglytrpthrtyr
354045
tyralaasnservallysglyargphethrileserargaspasnala
505560
lysasnthrvaltyrleuglnmetasnserleulysprogluaspthr
65707580
alamettyrtyrcysalaalalysthrargalavalglyglythrtrp
859095
serserproasniletyrthrtyrtrpglyglnglythrglnvalthr
100105110
valserseralaalaala
115
<210>102
<211>123
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>102
valglnleuglngluserglyglyglyservalglnalaglyglyser
151015
leuargleusercysvalalaserargserseraspasntyrmetgly
202530
trppheargglnalaproglylysgluarggluglyvalalaalaile
354045
trpglyglythralatyrtyralaaspservalgluglyargphethr
505560
ileserglnaspasnalalysasnthrvaltyrleuglnmetasnser
65707580
leulysprogluaspthralamettyrtyrcysalathrglypheleu
859095
lysglyglysertrpserargalagluargphehistyrtrpglygln
100105110
glythrglnvalthrvalserseralaalaala
115120
<210>103
<211>124
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>103
valglnleuglngluserglyglyglyservalglnalaglyglyser
151015
leuargleusercysalaalaserglyglnthralaphemetalatrp
202530
pheargglnalaproglyglngluarggluglyvalalaalaileasp
354045
thrargalaleuserthrtyrtyrglyaspservallysglyargphe
505560
thrileserlysaspilephelysasnthrleutyrleuglnmetasn
65707580
serleulysproglugluthralamettyrtyrcysalaalaarglys
859095
lysproglyserserleuleuglnproglnsertyrvaltyrtrpgly
100105110
glnglythrglnvalthrvalserseralaalaala
115120
<210>104
<211>128
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>104
valglnleuglngluserglyglyglyservalglnalaglyglyser
151015
leuargleusercysalaalaserthrtyralatyrserserthrtyr
202530
metalatrppheargglnalaproglylysgluarggluglyvalala
354045
seriletyrthrglyaspglytrpthrtyrtyralaasnservallys
505560
glyargphethrileserargaspasnalalysasnthrvaltyrleu
65707580
glnmetasnserleulysprogluaspthralamettyrtyrcysala
859095
alalysthrargalavalglyglythrtrpserserproasniletyr
100105110
thrtyrtrpglyglnglythrglnvalthrvalserseralaalaala
115120125
<210>105
<211>127
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>105
valglnleuglngluserglyglyglyservalglnalaglyglyser
151015
leuargleusercysalaalaservaltyrargarghisasntyrcys
202530
metglytrppheargglnargproglylysgluargglugluileala
354045
ilepheaspargglyaspserthrsertyralaaspservallysgly
505560
argphethrileserglnaspasnalalysasnmetleutyrleugln
65707580
metasnserleulysprogluaspthralamettyrtyrcysalathr
859095
sertyrproargvalvalileglythrcysthrglyglyaspphearg
100105110
valtrpglyglnglythrglnvalthrvalserseralaalaala
115120125
<210>106
<211>130
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>106
valglnleuglngluserglyglyglyservalglnalaglyglyser
151015
leuargleusercysalaalaserglyalaprotyrserthrtyrser
202530
metglytrpileargglnalaproglylysglnargglualavalala
354045
alaileaspseraspglyasnilesertyralaaspservallysgly
505560
argphethrileserglnaspasnleulysasnthrleutyrleugln
65707580
leuasnlysleulysprogluaspthralamettyrtyrcysalaala
859095
asptyrproalathrserglyglyserglyglypheleualaalaleu
100105110
leuhislystyrtrpglyglnglythrglnvalthrvalserserala
115120125
alaala
130
<210>107
<211>130
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>107
valglnleuglngluserglyglyglyservalglnalaglyglyser
151015
leuargleusercysalathrserglyphepropheserthrtyrcys
202530
metglytrppheargglnvalproglylysgluarggluglyvalala
354045
glyiletyrileserhisglyglnthrtyrtyralaaspservallys
505560
glyargphethrileserargaspasplyslyslysthrleutyrleu
65707580
glnmetglualaleuasnprogluaspthralamettyrtyrcysala
859095
alaglyaspargtrptyrcysproalaaspsertrpserargproglu
100105110
argtyrprophetrpglyglnglythrglnvalthrvalserserala
115120125
alaala
130
<210>108
<211>123
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>108
valglnleuglngluserglyglyglyservalglnalaglyglyser
151015
leuargleusercysalaalaserglyphethrphesermetasngly
202530
metsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpvalser
354045
alailethrthrglyglyservalalathrtyralaaspservallys
505560
glyargphethrileserargaspasnalalysasnthrleutyrleu
65707580
glnmetasnasnleulysthrgluaspthralavaltyrtyrcysala
859095
thrglyasnglnargargproalaglnhisvalglyvaltrpglygln
100105110
glythrglnvalthrvalserseralaalaala
115120
<210>109
<211>123
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>109
valglnleuglngluserglyglyglyservalglnalaglyglyser
151015
leuargleusercysthralaserglytyrthrsersermetglytrp
202530
pheargglnalaproglylysgluarggluglyvalalaalailegly
354045
ilevalasnalavaltyralaaspservallysglyargphethrile
505560
serlysaspasnalaglutyrthrleutyrleuglnmetasnserleu
65707580
lysprogluaspthralamettyrtyrcysalaalavalargargleu
859095
glnlyslysasnglnleualaseraspglutyrmettyrtrpglygln
100105110
glythrglnvalthrvalserseralaalaala
115120
<210>110
<211>375
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>110
gtgcagctgcaggagtctgggggaggctcggtgcaggtcggagggtctctgagactctcc60
tgtgcctcctctgcaaacccctacagcagctactcactgggctggttccgccaggctccg120
ggtaaggagcgcgagggagtcgcggctattaatggttatggtaggacaagttacgcagac180
tccgtgagcggccgattcaccatctcccaagacaacgcccggaagactctgtatctgcaa240
atgaacagcctgaaacctgaggacactgccatgtactactgtgcaattgggtcgaggtgg300
tggtatccattcgatcccgcggcgtataagtactggggccaagggacccaggtcaccgtc360
tcctcagcggccgca375
<210>111
<211>372
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>111
gtgcagctgcaggagtctggaggaggctcggtgcaggctggagggtctctgacactctcc60
tgtgtatgctctggatacatacccagtaaggcctggttccgccaggctccagggaaggag120
cgcgaggcggtcgcagcgattgatgggcctggtaggataaggtacgtagactccgtgaac180
ggccgattcaccatctcccaagacattgtcaagaagactctcgttctcgaaatgaacagc240
ctgaaacctgaggacactgccatgtactactgtgcggcagatcccaggttgtctactaat300
aactggtcgcgagcccccgagtatcgctactggggccaggggacccaggtcaccgtctcc360
tcagcggccgca372
<210>112
<211>345
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>112
gtgcagcctggggggtctctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtaac60
tatgccatggaatgggttcgccaggctccagggaagggactcgagtgggtctcaggcatt120
aatagtggaggtattggtacatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctcc180
agagacaacgccaagaacacgctgtatctgcagctgaacagcctgaaaactgaggacacg240
gccatgtattactgtgcaaaggggtacggtaatatggtggtggctggtatcacaagtaac300
taccgaggccaggggacccaggtcaccgtctcctcagcggccgca345
<210>113
<211>357
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>113
gtgcagctgcaggagtctgggggaggcttggtgcagcctggggggtctctgagactctcc60
tgtgcagcctctggattcaccgtcagtagaactgccatgagctgggtccgccaggctcca120
gggaagggactcgagtgggtcgccactattggtactagtgatagtatcacagtctatgca180
gactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacacgctgtatctg240
caattgaacagcctgaaaactgacgacacggccgtgtataattgtgcaaaatgtttccgt300
tactgcccaccaccccttaccccggggacccaggtcaccgtctcctcagcggccgca357
<210>114
<211>357
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>114
gcgcaggctggagggtctctgagactctcctgtccagcctctggattgacttccagtacc60
gcctgcttggcctggtttcgccaggctccagggaaggagcgcgagggggtcgcacgtata120
cgttctctttttggtagcacatggtatgccgactccgtgaagggccgattcaccatctcc180
caagacaccaccaagaatatgctgtatttacaaatggacagcctgaaacctgaggacact240
gccatgtactactgtgcggcagggcggacgggagtctgctattcaggctcttggtcacct300
gatgagtttaactactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctcagcggccgca357
<210>115
<211>351
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>115
gtgcaggctggagggtctctgagactctcctgtgttgcctctggattcatctacacctac60
agtagttactgcatgggctggttccgccaggctccagggaaggagcgcgagggggtcgca120
actattgatagagatcgtagcacaacctacgcagactccgtgaagggccgattcaccatc180
tcccaagacaacgccaagaacactctgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggac240
actgccatgtactactgtgcggcagtccgtagtagtggttactgctacatcgcccagtgg300
tataagtactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctcagcggccgca351
<210>116
<211>354
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>116
gtgcagactggagggtctctgagactctcctgtatagtatctggatacacctacagtcgc60
aagaccgtgggctggttccgccaggctccagggaaggagcgcgagggggtcgcagcggtt120
tattctgcaggtggtactagtacgacatactataccgactccgtgaagggccgattcacc180
atctccctagacaccaccaagaacacgatttatctacaaatgaacagcctgagatatgag240
gacactgccatgtactattgtgcgacaggtttcggcggtgctaactattacgacaaagca300
cggtataagtactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctcagcggccgca354
<210>117
<211>354
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>117
gtgcaggctggagggtctctgagactctcctgtgcagcctctggatacacctacagtagc60
acctacatggcctggttccgccaggctccagggaaggagcgcgagggggtcgcaagtatt120
tatactggtgatggttggacatactatgccaactccgtgaagggccgattcaccatctcc180
cgagacaacgccaagaacacggtgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacact240
gccatgtactactgtgcggccaaaacccgtgcagtcggtgggacctggtcatccccaaac300
atatatacgtactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctcagcggccgca354
<210>118
<211>369
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>118
gtgcagctgcaggagtctggaggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactctcc60
tgtgtagcctctagatccagcgacaactacatgggatggttccgccaggctccagggaag120
gagcgcgagggggtcgccgccatttggggtggcaccgcatactatgccgactccgtcgag180
ggccgattcaccatctcccaagacaacgccaagaacacagtgtatctgcaaatgaacagc240
ctgaaacctgaggacactgccatgtactactgtgcgacaggtttcttgaaaggtggtagt300
tggtcgagggcagagaggtttcattactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca360
gcggccgca369
<210>119
<211>372
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>119
gtgcagctgcaggagtctgggggaggctcggttcaggctggagggtctctgagactctcc60
tgtgcagcctctggacagaccgccttcatggcctggttccgccaggctccagggcaggag120
cgcgagggggtcgcagctattgatactcgtgctttaagcacatactatggcgactccgtg180
aagggtcgcttcaccatctccaaagacattttcaagaacactctgtatctgcaaatgaac240
agcctgaaacctgaggagactgccatgtactactgtgcagcgagaaaaaaaccggggagc300
agcctcttgcaaccgcaatcgtatgtttactggggccaggggacccaggtcaccgtctcc360
tcagcggccgca372
<210>120
<211>384
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>120
gtgcagctgcaggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactctcc60
tgtgcagcctctacatacgcctacagtagcacctacatggcctggttccgccaggctcca120
gggaaggagcgcgagggggtcgcaagtatttatactggtgatggttggacatactatgcc180
aactccgtgaagggccgattcaccatctcccgagacaacgccaagaacacggtgtatctg240
caaatgaacagcctgaaacctgaggacactgccatgtactactgtgcggccaaaacccgt300
gcagtcggtgggacctggtcatccccaaacatatatacgtactggggccaggggacccag360
gtcaccgtctcctcagcggccgca384
<210>121
<211>381
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>121
gtgcagctgcaggagtctggaggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactctcc60
tgtgcagcctctgtatacagacggcataactactgcatgggctggttccgccagcgtcca120
gggaaggagcgcgaggagatcgcaatttttgataggggtgatagcacaagctacgcagac180
tccgtgaagggccgattcaccatctcccaagacaacgccaagaatatgttgtatctgcaa240
atgaacagcctgaaacctgaggacactgccatgtactactgtgcgacatcatacccaagg300
gtggtaattggtacctgtacaggtggggactttcgtgtctggggccaggggacccaggtc360
accgtctcctcagcggccgca381
<210>122
<211>390
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>122
gtgcagctgcaggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactctct60
tgtgcagcctctggcgctccctacagtacctattctatgggctggatccgccaggctcca120
gggaagcagcgcgaggcggtcgcagctattgatagtgatgggaacataagctacgcagac180
tccgtgaagggccgattcaccatctcccaagacaacctcaagaacactctgtatctacaa240
ttgaacaaactgaaacctgaggacactgccatgtactactgtgcggcagattatccagca300
acctcagggggtagtggtggtttcttagccgcactgcttcataagtactggggccagggg360
acccaggtcaccgtctcctcagcggccgca390
<210>123
<211>390
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>123
gtgcagctgcaggagtctggaggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactctcc60
tgtgcaacctctggatttcccttcagtacttactgtatggggtggttccgccaggttcca120
gggaaggagcgcgagggggtcgccggtatttatattagtcatggtcagacatattatgcc180
gactccgtgaagggccgattcaccatctcccgagacgacaagaagaagacgctgtatcta240
caaatggaagccctgaaccctgaggacactgccatgtattactgtgcggcaggagaccgg300
tggtactgccccgcggactcatggtcccggccagaaaggtatccgttctggggccagggg360
acccaggtcaccgtctcctcagcggccgca390
<210>124
<211>369
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>124
gtgcagctgcaggagtctggaggaggctcggtgcaggctggggggtctctgagactctcc60
tgtgcagcctctggattcacattcagtatgaacggcatgagctgggtccgccaggctcca120
gggaaggggctcgagtgggtctcagcgattactactggtggtagtgtggcaacgtatgcg180
gactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaatgccaagaacacgctgtatctc240
caaatgaacaacctgaaaactgaagacactgccgtgtattactgcgccacagggaatcaa300
cgtaggccggcacagcacgtgggtgtgtggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca360
gcggccgca369
<210>125
<211>369
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>125
gtgcagctgcaggagtctggaggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactctcc60
tgtacagcctctggatacaccagcagtatgggctggttccgccaggctccagggaaggag120
cgcgagggggtcgcagctatcggcattgttaacgcagtctacgcggattccgtgaagggc180
cgattcaccatctccaaagacaacgccgagtacactctctatctgcaaatgaacagcctg240
aaacctgaggacactgccatgtactactgtgcggcagtacggcgcctacaaaaaaaaaac300
caactggcttcggatgagtatatgtactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca360
gcggccgca369
- 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞！