本发明涉及生物发酵制药技术领域，具体地说涉及一种从发酵液中提取纯化普伐他汀钠的方法。
背景技术：
普伐他汀钠(pravastatinsodium)，化学名称为：{1s-[1a(bs*，ds*)，2a，6a，8b(r*)，8aa]}-1，2，6，7，8，8a-六氢-b，d，6-三羟-2-甲基-8-(2-甲基-1-氧丁氧基)-1-萘庚酸单钠盐，分子式：c23h35nao7，分子量：446.52。普伐他汀钠作为一种高效降血脂药，能显著减缓动脉粥样硬化进程，有出色的耐受性、高度的安全性。用于高脂血症、家族性高胆固醇血症。
从发酵液中提取纯化普伐他汀钠的现有技术方法主要有：
1.大多数报道都采用有机溶媒对发酵液直接进行抽提，再使用其他类型的有机溶剂进行反萃取后，经若干手段最后通过溶媒结晶。这一方法在工业化生产中存在的问题有：首先，由于普伐他汀钠发酵液中存在有大量的的杂质，通过有机溶媒的抽提过程并不能很好地去除这些杂质，因而酯相中普伐他汀钠的纯度较低；其次，由于普伐他汀钠在发酵液中的浓度一般很低，仅为0.5-5g/l，用有机溶媒抽提法纯化普伐他汀钠时需要使用大量的溶媒(一般为发酵液的1-2.5倍)，再者，由于生产过程中使用了多种溶媒(目前见诸报道的通常三种以上)，极易造成交叉污染，且这样在工业化大规模生产过程中会带来较为严重地环境污染与三废问题，且危害生产操作人员的健康；
2.cn1468098中有报道采用有机溶媒对发酵液直接进行抽提，然后经反萃取等手段得到普伐他汀铵盐，再使用离子交换法，得到普伐他汀钠最后冷冻干燥制得普伐他汀钠。该方法同样存在上述第1种方法带来的问题，同时又产生了供需较为繁琐的不便，且由于离子交换的方法产生了大量的废水，一定程度上增加了环境污染的风险，另外对废水处理需要花费大量的人力物力，无形中增加了制药企业的生产成本；
3.cn1229326c中有报道采用大孔吸附树脂纯化的方法，该方法虽然避免了大量有机溶媒使用的弊端，但其在生产过程使用了大量的水溶性有机溶剂和水的混合物，连续规模生产时的溶媒套用较为繁琐困难，且消耗量大，而且通过其提纯和精制普伐他汀钠，含量最高仅有95.6％，仍然不能够满足业界对其纯度的要求，达不到相关的质量标准。
而从发酵液中纯化普伐他汀钠的理想的方法为同时满足高纯度、高收率和低污染的要求，但是现有技术中的纯化方法往往不能同时满足上述三点要求。
因此，亟需研发一种从发酵液中提取纯化普伐他汀钠的方法，并使得到产品可以达到合格的普伐他汀钠的质量要求，能应用于工业化规模化生产。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种同时满足高纯度、高收率和低污染要求的从发酵液中提取纯化普伐他汀钠的方法。
本发明首先提供一种从发酵液中提取纯化普伐他汀钠的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)向普伐他汀发酵液中加入碱溶液，过滤取滤液，得碱化滤液；
(2)步骤(1)所得碱化滤液中加入酸，酸化后的溶液中加入固体吸附剂，过滤弃滤液，得固体析出物；
(3)对步骤(2)所得固体析出物用有机溶剂进行固液萃取，过滤得萃取液；
(4)将步骤(3)所得萃取液经减压浓缩、降温结晶分离，得到普伐他汀潮晶；将得到的普伐他汀潮晶采用步骤(3)所述的有机溶剂加热溶解，加入活性碳，脱色过滤，得脱色液；
(5)向脱色液中加入碱，回流反应，再降温结晶分离，即得普伐他汀钠成品潮晶，经干燥即得普伐他汀钠成品。
步骤(1)加入碱溶液后，应当充分搅拌，在40-50℃下反应1.5-2.5h后，再过滤。
步骤(1)中的发酵液加入碱溶液后，得到的碱化液ph值为8.0-12.0，优选为8.5-9.5，此处的优选，是指ph在8.5-9.5碱化反应的效果比8.0-8.5的好，且越碱越有利于其碱化反应的进行，但当碱度达到9.5后，随着ph升高，碱化反应的效果无显著差异，故此选择8.5-9.5。
步骤(1)所述碱溶液优选为2％-4％(g/l)的氢氧化钠水溶液。
步骤(2)酸化后的溶液ph值为1.0-6.0，优选3.5-4.0，此处的优选，是指在3.5-4.0时的酸化效果比4.5-6.0的好，越酸越有利于析出，但酸度达到3.5之后，随着ph的下降，析出效果无显著差异，但其杂质有升高趋势，且酸用量增大成本增高，因此选择3.5-4.0。步骤(2)加入的酸，优选为盐酸，浓度为5-6mol/l。
步骤(2)所述固体吸附剂为硅藻土和/或珍珠岩，固体吸附剂加入质量与酸化后溶液的体积之比为10％-15％(g/l)。
步骤(3)所述有机溶剂为水溶性有机溶剂，优选乙醇，甲醇、丙酮、异丙醇中的一种或多种。更优选有机溶剂为乙醇。
本发明中萃取使用的有机溶剂与热溶使用的有机溶剂均为水溶性有机溶剂，且为同一种有机溶剂，在单一溶媒体系下，可以得到合格的普伐他汀钠成品，由此减少了生产过程中溶媒的种类，避免了多种溶媒间交叉污染的风险，利于生产中溶媒的回收套用与管理，大大减轻了安全和环保的风险。
本发明上述方法的步骤(4)所述减压浓缩的浓缩温度为40-80℃，优选为65-75℃，浓缩至约200000～300000μg/ml，然后降温结晶至0～20℃后分离，优选结晶分离温度为10～15℃。
步骤(4)所述的有机溶剂加热溶解，条件为：温度60～80℃，优选70～75℃，加入有机溶剂的体积为潮晶重量的4～10倍(ml/g)，优选为6～8倍；优选活性碳加量为溶解液体积(有机溶剂溶解潮晶后的体积)的0.1～0.2％(g/l)，脱色20-50min。
步骤(5)所述脱色液中加入碱，所述碱选自氢氧化钠、乙醇钠、甲醇钠中的一种或几种，优选为氢氧化钠，用量为与脱色液中有效成分摩尔量比值为1.01～1.02：1，更优选为2.5mol/l的氢氧化钠水溶液。
进一步地，步骤(5)中，回流反应温度为60～80℃，优选为70～75℃，回流1.5～2.5h；降温结晶至0～20℃后分离，优选降温结晶至10～15℃分离。
本发明提供了上述方法在提高普伐他汀钠产品纯度和/或总回收率中的应用。
本发明根据发酵液中的有效成份普伐他汀在碱性和酸性状态下在水相中不同的溶解性的特点，通过分别加入碱、过滤弃滤渣、滤液中加酸的方式，从而达到去除大量的菌体杂质、碱不溶性杂质、色素的目的，可大幅度的提高纯物料中有效成份纯度。利用吸附剂(如硅藻土)的吸附作用，将酸化液中析出的有效成份普伐他汀酸吸附，从而去除掉大量的酸溶性杂质、色素等，进而进一步提高物料的纯度，并将有效成份富集在少量的吸附剂，即为萃取底物，其重量比其它常规处理方式(如：采用发酵液直接调酸，再过滤所得固形物，即为该方式所得的萃取底物)所得萃取底物的重量减少了80％以上，大大减少了萃取底物的重量，且该吸附剂在经萃取后可重复使用约10个批次，大大减少了固体废弃物的重量，与此同时，从根本上大大减少的有机溶剂的用量，降低的有机溶剂的消耗，利于后续步骤的提取纯化，且对环境污染少。
本发明方法中，若缺少对发酵液碱性化、酸性化去除大量杂质和吸附剂富集有效成份的处理，将直接影响普伐他汀钠产品的质量，极可能达不到合格的质量标准；同时，也会对后续步骤溶媒萃取产生较大影响，表现在1.萃取乳化严重，溶媒消耗增大，耗时长；2.未能去除的杂质大量溶于溶媒中，萃取液质量大大降低；3.由于未用吸附剂富集有效成份，故而溶媒用量大大增加，其消耗也会增大。
通过改进，本发明方法适用于从发酵液中提取纯化普伐他汀钠的规模化生产，且可以生产出达到欧洲药典标准的的普伐他汀钠产品。通过对发酵液的碱化、酸化去除大量的杂质和色素，又通过吸附剂将酸化液中有效成份大量富集，由此大幅提高了萃取底物的纯度并大大的减少了萃取底物的量(比其他常规处理方式减少了80％以上)故而提高了萃取液的质量；整个生产过程中采用单一溶媒体系，且工序不繁杂，产生的三废量相对来说较低，适于规模化生产。本方法生产的普伐他汀钠含量在98.8％以上，主要杂质6-表普他汀(杂质a)＜0.15％，总有关物质＜0.4％，产品质量符合合格普伐他汀钠的ep9.6版质量标准(普伐他汀钠含量在97.0-102.0％，主要杂质6-表普他汀(杂质a)≤0.3％，总有关物质≤0.6％)，总收率可达75％以上。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本实施例中初始所用的发酵液通过以下方法制得：通过对微生物如：霉菌、丝状细菌、放线菌、链霉菌等的培养发酵，将底物康百汀转化为普伐他汀，即为本发明专利中所述普伐他汀发酵液。
实施例1
取发酵液5.0l，其中的有效成份普伐他汀单位21238μg/ml，用浓度2％(w/v)的氢氧化钠水溶液调ph8.5，保温40℃，搅拌1.5h，过滤，得5.8l碱化液；用5mol/l盐酸将碱化液ph调至3.5，得到的酸化液总体积为6.1l，加入610g硅藻土，搅拌均匀，过滤得固体析出物810g，使用乙醇进行萃取一次用2430ml，二次用1620ml，常温固液萃取，搅拌时间1小时，过滤合并两次萃取液得4160ml，于65℃减压浓缩至780ml后，搅拌降温结晶，温度10℃时，分离，得普伐他汀潮晶115g，含量为87.6％；
向潮晶中加入690ml乙醇，于70℃热溶，加入0.8g活性炭，用0.45微米的全纸板过滤，得脱色液，缓慢滴入2.5mol/l的氢氧化钠水溶液98.6ml，于70℃回流反应1.5小时，搅拌降温结晶，温度10℃时，分离，得普伐他汀钠成品潮晶，减压干燥得普伐他汀钠成品83.1g。
普伐他汀钠含量：99.4％，主要杂质6-表普他汀(杂质a)：0.06％，总有关物质：0.18％，总收率：78.26％。(ep9.6版中的方法检测，以下各实施例和对比例中的成品检测均为此方法)
实施例2
取发酵液5.0l，其中的有效成份普伐他汀单位21238μg/ml，用浓度4％(w/v)的氢氧化钠水溶液调ph9.5，保温50℃，搅拌2.5h，过滤，得6.0l碱化液；用6mol/l盐酸将碱化液ph调至4.0，体积为6.2l，加入930g硅藻土，搅拌均匀，过滤得固体析出物1050g，使用乙醇进行萃取一次用3150ml，二次用2100ml，常温固液萃取，搅拌时间1小时，过滤合并两次萃取液得5280ml，于75℃减压浓缩至790ml后，搅拌降温结晶，温度10℃时，分离，得普伐他汀潮晶109g，含量为88.3％；
向潮晶中加入872ml乙醇，于75℃热溶，加入1.9g活性炭，用0.45微米的全纸板过滤，得脱色液，缓慢滴入2.5mol/l的氢氧化钠水溶液94.3ml，于75℃回流反应2.5小时，搅拌降温结晶，温度15℃时，分离，得普伐他汀钠成品潮晶，减压干燥得普伐他汀钠成品82.3g。
普伐他汀钠含量：99.3％，主要杂质6-表普他汀(杂质a)：0.09％，总有关物质：0.21％，总收率：77.50％。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于：将硅藻土替换为珍珠岩粉。后续步骤同实施例1。最终得到普伐他汀钠成品82.8g。
普伐他汀钠含量为99.2％，主要杂质6-表普他汀(杂质a)为0.09％，总有关物质为0.23％，总收率：77.97％。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于：将乙醇替换为丙酮。后续步骤同实施例1。最终得到普伐他汀钠成品81.3g。
普伐他汀钠含量：98.9％，主要杂质6-表普他汀(杂质a)：0.12％，总有关物质：0.27％，总收率：76.56％。
对比例1
本对比例与实施例1的区别在于：加入碱溶液后，在30℃反应1小时。后续步骤参数均同实施例1。最终所得普伐他汀钠成品35.7g。普伐他汀钠含量：92.9％，主要杂质6-表普他汀(杂质a)：1.31％，总有关物质：5.8％，总收率：33.62％。
对比例2
本对比例与实施例1的区别在于：加入碱溶液后，在60℃反应3小时。后续步骤参数均同实施例1。最终所得普伐他汀钠成品58.7g，普伐他汀钠含量：94.1％，主要杂质6-表普他汀(杂质a)：1.07％，总有关物质：4.9％，总收率：55.28％。
对比例3
本对比例与实施例1的区别在于：碱化ph为12.5。后续步骤参数均同实施例1。最终所得普伐他汀钠成品73.6g，普伐他汀钠含量：96.1％，主要杂质6-表普他汀(杂质a)：0.92％，总有关物质：3.1％，总收率：69.31％。
对比例4
本对比例与实施例1的区别在于：碱化ph为7.5。后续步骤参数均同实施例1。最终所得普伐他汀钠成品20.3g，普伐他汀钠含量：96.9％，主要杂质6-表普他汀(杂质a)：0.78％，总有关物质：2.6％，总收率：19.12％。
对比例5
本对比例与实施例1的区别在于：酸化ph为0.5。后续步骤参数均同实施例1。最终所得普伐他汀钠成品82.6g，普伐他汀钠含量：97.3％，主要杂质6-表普他汀(杂质a)：0.52％，总有关物质：1.9％，总收率：77.79％。
对比例6
本对比例与实施例1的区别在于：酸化ph为6.5。后续步骤参数均同实施例1，最终所得普伐他汀钠成品18.8g，普伐他汀钠含量：98.9％，主要杂质6-表普他汀(杂质a)：0.11％，总有关物质：0.31％，总收率：17.70％。
对比例7
本对比例与实施例1的区别在于：碱回流反应温度58℃，1小时。后续步骤参数均同实施例1。最终所得普伐他汀钠成品75.8g，普伐他汀钠含量：98.7％，主要杂质6-表普他汀(杂质a)：0.12％，总有关物质：0.51％，总收率：71.8％。
对比例8
本对比例与实施例1的区别在于：碱回流反应温度82℃，3小时。后续步骤参数均同实施例1，最终所得普伐他汀钠成品70.8g，普伐他汀钠含量：96.7％，主要杂质6-表普他汀(杂质a)：0.87％，总有关物质：2.61％，总收率：66.67％。
对比例9
本对比例与实施例1的区别在于：步骤(4)与步骤(5)的降温结晶均为-5℃。后续步骤参数均同实施例1，最终所得普伐他汀钠成品84.2g，普伐他汀钠含量：97.9％，主要杂质6-表普他汀(杂质a)：0.47％，总有关物质：0.81％，总收率：79.29％。
对比例10
本对比例与实施例1的区别在于：步骤(4)与步骤(5)的降温结晶均为25℃。后续步骤参数均同实施例1。最终所得普伐他汀钠成品69.2g，普伐他汀钠含量：99.5％，主要杂质6-表普他汀(杂质a)：0.07％，总有关物质：0.19％，总收率：65.17％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。