CDPK18L基因作为负调控因子在提高番茄细菌性叶斑病抗性和高温抗性中的应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及cdpk18l基因作为负调控因子在提高番茄细菌性叶斑病抗性和高温抗性中的应用。

背景技术：

番茄，茄科茄属，是一种重要的蔬菜和经济作物，在全世界范围内广泛种植。因其营养丰富，口感鲜美，广受喜爱。同时，番茄也是设施栽培的主要蔬菜之一。

然而，近年来，随着大气环境不断发生变化以及农业种植方式的改变，番茄病害爆发日益严重，全球气温的不断升高也使得番茄面临高温胁迫。设施内相对密闭，极易造成高温高湿的环境，加之单一的种植模式，使番茄很容易受到生物与非生物的双重胁迫。

细菌性叶斑病是其中一种高发病害，由丁香假单胞杆菌番茄致病变种(pseudomonassyringaepv.tomatodc3000)引发的。它是一种革兰氏阴性细菌，对番茄的危害主要表现在叶片上，也可发生在叶脉和果实，影响番茄的果实品质和产量。现阶段对细菌性叶斑病的主要防治方式为喷施农药。虽然可以一定程度上减少产量损失，但随之而来的是农药残留，环境污染以及产生抗药性细菌等一系列问题。

番茄对高温非常敏感，持续的高温会严重影响番茄的营养生长和生殖生长。高温不仅抑制番茄的光合作用，还会导致花粉活力丧失，影响开花坐果。高温胁迫会引发植物体内一系列的反应，包括活性氧积累，细胞失水，酶活性的丧失等。

cdpks是一种钙离子依赖型蛋白激酶，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，由一个蛋白激酶域、一个自我抑制结构域和一个类cam结构域组成(ludwigaa等，“cdpk-mediatedsignalingpathways:specificityandcross-talk.”journalofexperimentalbotany,2004,55(395):181-188)。

前人研究表明，cdpks参与到多种生物及非生物胁迫相关的信号通路中，且作用机制各不相同。例如，拟南芥cpk3和cpk13通过调控热激转录因子hsfb2a激活pdf1.2的转录，从而增强植物对食草昆虫的抗性(kanchiswamyc.n.等，“regulationofarabidopsisdefenseresponsesagainstspodopteralittoralisbycpk-mediatedcalciumsignaling.”bmcplantbiology,2010,10:97)。在冷害和盐害/干旱的胁迫下，水稻cdpk7基因的表达量上升。增加cdpk7的含量能够提高水稻对冷害和盐害/干旱的抗性。在盐害/干旱的胁迫下，过表达植株抗性相关的基因表达量显著高于对照，而在冷害的胁迫下则没有这一现象出现，说明cdpk7对冷害和盐害/干旱的抗性机制通过两条独立的途径展开。(saijoy等，“overexpressionofasingleca²⁺-dependentproteinkinaseconfersbothcoldandsalt/droughttoleranceonriceplants.”theplantjournal,2000,23:319-327)。拟南芥cpk23则负调控抗逆性，拟南芥cpk23基因突变后拟南芥对干旱的抗性显著提高。过表达cpk23后拟南芥的气孔导度变大，从而影响其对干旱的抗性(masy,wuwh.“atcpk23functionsinarabidopsisresponsestodroughtandsaltstresses.”plantmolecularbiology,2007,65:511-518)。

番茄cdpk18l作为cdpks家族中的一员，鲜有其在生物和非生物抗性中的研究。因此，研究番茄cdpk18l基因应对细菌性叶斑病和高温的抗性机制具有理论和实际应用价值。

近年来发展的crispr/cas9基因编辑技术能够精准敲除基因组中的任何基因，从而精确的改变农作物性状，快速获得理想种质，大大缩短育种时间。同时，相比于转基因育种，利用crispr/cas9基因编辑技术进行育种可以不引入外源基因。在利用crispr/cas9技术进行基因组编辑之后，植株可以通过自交筛选出目标基因发生编辑且不含cas9的株系，可在很多情况下避免使用颇具争议性引入外源基因的转基因技术。尽管在园艺作物中建立高效的基因编辑体系刚刚起步，利用基因编辑技术实现对某些基因的突变，不仅为研究园艺作物的复杂性状及复杂功能提供了重要途径，对于推动园艺作物的遗传改良也具有重要意义。

技术实现要素：

本发明提供了cdpk18l基因作为负调控因子在提高番茄细菌性叶斑病抗性和高温抗性中的新用途，为培育抗细菌性叶斑病和抗高温的番茄品种提供依据。

具体技术方案如下：

本发明提供了cdpk18l基因作为负调控因子在提高番茄细菌性叶斑病抗性中的应用，所述cdpk18l基因的蛋白编码区的核苷酸序列如seqidno.1所示，全基因序列如seqidno.6所示，其蛋白编码区长度为1713bp。

该cdpk18l基因编码的蛋白为钙离子依赖型蛋白激酶，由570个氨基酸组成，其序列如seqidno.2所示，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，由一个蛋白激酶域、一个自我抑制结构域和一个类cam结构域组成，当与钙离子结合时，该蛋白被激活。

本发明首先对番茄钙离子依赖型蛋白激酶cdpk18l(基因编号：xm_004232444，ncbi网站https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行序列分析，查找pam序列，将ngg前的20个bp的序列定义为sgrna，选择定位于基因蛋白编码区上且具有高度特异性的sgrna序列，该特异性靶向cdpk18l基因蛋白编码区的sgrna的dna序列如seqidno.3所示。

本发明通过酵母双杂交实验发现，cdpk18l基因编码的蛋白与谷氨酰胺合成酶存在互作。

所以，进一步地，cdpk18l基因编码的蛋白作为负调控因子在提高番茄细菌性叶斑病抗性中的应用，所述蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示。

进一步地，所述蛋白通过与谷氨酰胺合成酶互作，负调控番茄细菌性叶斑病的抗性。

所述的负调控是指cdpk18l通过与谷氨酰胺合成酶互作，改变植物体内的氮代谢过程，削弱植物对细菌性叶斑病的抗性。

cdpk18l基因作为负调控因子在提高番茄高温抗性中的应用，所述cdpk18l基因的蛋白编码区的核苷酸序列如seqidno.1所示。

本发明还提供了抗细菌性叶斑病和抗高温番茄的培育方法，包括：

(1)在番茄cdpk18l基因的蛋白编码区选取含有pam结构的靶标片段，进行引物设计，构建cripr/cas9载体；

(2)构建含步骤(1)所述cripr/cas9载体的农杆菌基因工程菌；

(3)将步骤(2)所述基因工程菌转化番茄子叶，获得不含外源cas9蛋白且稳定遗传的纯合突变体株系。

进一步地，所述靶标片段pam结构前20个碱基的核苷酸序列如seqidno.3所示。所述pam结构为ngg，n代表任意碱基。

进一步地，构建所述crispr/cas9载体的引物的核苷酸序列如seqidno.4和seqidno.5所示。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明利用crispr/cas9基因编辑技术获得番茄cdpk18l基因编辑突变体，发现该突变体能够显著增强对番茄细菌性叶斑病的抗性，证明了cdpk18l基因作为负调控因子在提高番茄细菌性叶斑病抗性中的用途，可用于抗细菌性叶斑病番茄品种的选育。

(2)本发明还发现cdpk18l基因缺失的突变体能够显著增强对高温的抗性，证明了cdpk18l基因作为负调控因子在提高番茄高温抗性中的用途，可用于抗高温番茄品种的选育。

附图说明

图1为实施例2中获得的t1代突变体植株的基因编辑位点；

与未经过基因编辑的普通番茄相比，基因编辑突变体在sgrna的位置发生碱基缺失。以下将未经过基因编辑的普通番茄称为对照。

cdpk18l#1比对照少两个碱基，cdpk18l#2比对照少一个碱基。

图2为实施例3中对照和cdpk18l基因突变型番茄接种细菌性叶斑病病原菌后的病级指数柱形图；

其中，发病越严重，病级指数越高；对照植株病级指数显著高于突变体植株；小写字母a、b代表不同植株之间在5％水平上的差异显著。

图3为实施例3中对照和cdpk18l基因突变型番茄接种细菌性叶斑病病原菌后的发病叶片台盼蓝染色图；

其中，斑点越多越大，表示发病越严重。

图4为实施例4中对照和cdpk18l基因突变型番茄进行高温处理之后的表型。

图5为实施例5中酵母双杂交的结果图；

其中，pbd-cdpk18l+pad表示含有cdpk18l的pgbkt7质粒和pgadt7质粒共转化入酵母感受态细胞；pbd+pad-谷氨酰胺合成酶表示pgbkt7质粒和含有谷氨酰胺合成酶的pgadt7质粒共转化入酵母感受态细胞；pbd-cdpk18l+pad-谷氨酰胺合成酶表示含有cdpk18l的pgbkt7质粒和含有谷氨酰胺合成酶的pgadt7质粒共转化入酵母感受态细胞；sd-trp-leu表示缺少trp和leu两种氨基酸的酵母固体培养基；sd-trp-leu-his-ade表示缺少trp、leu、his和ade四种氨基酸的酵母固体培养基；若酵母在缺少氨基酸的酵母培养基上生长，则说明两个蛋白之间存在互作。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人所熟知，所用原料、试剂盒均为市售商品。

下述实施例中采用的番茄品种为番茄常规品种cr(condinered)，将未经过基因编辑的普通番茄称为对照。

实施例1含特异sgrna的crispr/cas9载体的构建

在ncbi网站https://www.ncbi.nlm.nih.gov/上找到cdpk18l(xm_004232444)的dna序列，其序列如seqidno.6所示，输入http://crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/crispr2/crispr网站，找出onscore得分高，且gc含量>40％，位于蛋白编码区的一段pam结构前的20bp碱基序列cacggcggcggtatttgtgg(seqidno.3)。

设计crispr引物，如下所示：

crispr前引物(seqidno.4):gattgcacggcggcggtatttgtgg；

crispr后引物(seqidno.5):aaacccacaaataccgccgccgtgc；

取上述crispr前引物和后引物各5μl，混匀后用pcr仪退火成双链。中间载体pmd18-t经bbsi单酶切，普通dna纯化试剂盒纯化后，将双链与载体用t4连接酶连接，16℃连接过夜。42℃热击转化涂板，抗性为氨苄青霉素。

挑单克隆菌落，用crispr前引物(seqidno.4)：gattgcacggcggcggtatttgtgg和载体后引物(seqidno.7)：ctacttatcgtcatcgtctttg，进行pcr验证。

将条带大小正确的菌液送至测序公司测序，测序结果显示载体包含sgrna序列，提质粒，经hindiii与kpni双酶切后，连接至终载体pcambia1301上。再次测序结果显示终载体包含sgrna，将所得最终质粒电击入gv3101农杆菌感受态，28℃培养两天后挑斑进行pcr验证，获得可用于构建其crispr/cas9基因编辑材料的农杆菌菌株。

实施例2cdpk18l基因突变体材料制备与鉴定

在播种培养基播种已消毒的种子，7天后切子叶。农杆菌侵染法将实施例1制备的最终质粒转化入子叶中，利用植物细胞全能性，获得t0代基因编辑番茄。

t0代基因编辑番茄苗检测。利用ctab法提取t0代植株的基因组dna并以其为模板，在包含sgrna的dna序列前后约200bp处设计如下引物，进行pcr扩增测序验证：

验证前引物(seqidno.8):gagggcttatggttttcttc

验证前引物(seqidno.9):caattctcttgacagccaca

所得pcr产物送测序公司测序。测序结果与该段基因原序列利用dnaman软件进行比对，选取sgrna序列发生碱基缺失、且测序显示单峰的植株，进行自交繁种，获得t0代的种子。

上述t0代种子种植于生长室中，获得t1代植株。利用上述同样方法检测t1代植株的sgrna序列碱基编辑情况。同时，利用crispr前引物(seqidno.4)和载体后引物(seqidno.7)对t1代植株的dna进行pcr扩增，检测是否含有cas9序列。选取sgrna发生变异，但不含cas9的t1代植株，确定为基因编辑植株的两个株系，分别命名为cdpk18l#1和cdpk18l#2，其基因编辑位点如图1所示。

cdpk18l#1比对照植株少两个碱基，cdpk18l#2比对照植株少一个碱基。对上述两个株系进一步自交繁种，获得t1代种子。上述两个株系t1代种子播种后，获得不含外源基因cas9，且sgrna发生变异的稳定遗传的t2代植株。

以下实施例均以上述两个纯合株系t2代植株作为材料进行实验。

实施例3cdpk18l基因编辑突变体的抗病性研究

细菌性叶斑病病原菌菌种接种在含25mg/l利福平的固体king’sb培养基上，于28℃培养箱中培养2天后得以活化，作为原板。从原板挑取菌落重新在新的板king’sb培养基上划板，28℃培养箱中培养1天。用10mmmgcl2溶液将菌液悬浮，调节od600＝0.1。加0.02％的有机硅，对番茄植株叶背进行喷施，使得细菌菌液能够浸润叶片。将植株置于25℃，95％空气相对湿度、12小时光照12小时黑暗，光强200umolm^-2s^-1的环境下培养3天后，观察植株发病情况。

根据叶片发病情况统计病级指数，如图2所示，对照植株的发病情况明显较突变体更严重；取发病叶片进行台盼蓝染色，如图3所示，对照植株的染色面积明显多于突变体。

病级指数的统计方式为：将发病的番茄叶片进行分级，分级标准为：0级表示未发病，1级表示叶片下表皮可见少数病斑，2级表示叶片下表皮局部密集病斑，3级表示叶片下表皮多部位密集病斑，4级表示叶片下表皮全叶可见病斑分布。0-4级别分别赋值0-4分。根据每个植株每个叶片的发病情况按分级进行分类，加权平均，求得每株病级指数。

由图2和图3可知，cdpk18l突变体能够显著提高其对细菌新叶斑病的抗性。

实施例4cdpk18l基因编辑突变体的抗高温性能研究

将3-4周大小的番茄幼苗放入人工气候培养箱，12小时光照12小时黑暗，光强200umolm^-2s^-1，温度为42℃，期间及时补充水分，防止幼苗干旱。两天后发现对照植株比cdpk18l#1和cdpk18l#2萎蔫更加严重，选取其中代表性植株进行拍照，表型差异如图4所示。

实施例5cdpk18l和谷氨酰胺合成酶的互作鉴定

以对照番茄cdna为模板，分别扩增cdpk18l蛋白编码区片段(seqidno.1)并重组至pgbkt7载体，谷氨酰胺合成酶片段并重组至pgadt7载体。将上述pgbkt7和pgadt7共同转化到酵母ah109菌株。

具体操作步骤如下：挑去在ypad培养基上的ah109单菌落至3mlypda中，250rpm，30min振荡培养8h，取约200μl菌液转移到含20mlypda的50ml离心管中，同样条件下培养过夜。当od600数值到达0.6-0.8之间时，4000rpm，5min离心，弃上清。用te/liac重悬，4000rpm，5min离心，弃上清。再用te/liac重悬，制得酵母感受态。将上述重组的pgbkt7和pgadt7，鲑鱼精子dna，peg/liac与酵母感受态混合，30℃静置30min，加入60μl二甲亚砜。42℃水浴15min，冰上放置5min后离心去上清，加入100μl无菌ddh2o，涂抹于营养缺陷型固体培养基sd-trp-leu，30℃培养3-4天。挑取成功转入两个重组质粒的单克隆酵母用sd-trp-leu液体培养基培养，至od600数值到达0.6-0.8之间，用4000rpm，5min离心,弃上清。用无菌ddh2o重悬至od600数值到达0.3，并分别稀释10倍，100倍。吸取10μl菌液，分别滴至sd-trp-leu和sd-trp-leu-his-ade固体培养基30℃培养3-4天观察结果。

如图5所示，酵母菌落在sd-trp-leu和sd-trp-leu-his-ade固体培养基均生长良好，说明cdpk18l和谷氨酰胺合成酶存在互作。

序列表

<110>浙江大学

<120>cdpk18l基因作为负调控因子在提高番茄细菌性叶斑病抗性和高温抗性中的应用

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1713

<212>dna

<213>番茄(solanumlycopersicuml.)

<400>1

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

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<210>6

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

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