灰树花葡聚糖合成酶、其编码基因及应用的制作方法

本发明属于食用菌遗传和基因工程技术领域，具体涉及一种灰树花葡聚糖合成酶、其编码基因及应用。

背景技术：

食药用真菌多糖是当前国内外研究十分活跃的领域之一，其在细胞识别、细胞间物质运输、免疫调节及抗肿瘤等诸多重要的生物过程中起到关键作用。其中，葡聚糖是由d-葡萄糖之间通过β-1,3和/或β-1,6糖苷键链接聚合而成的多糖，具有显著的免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、抗病毒和降血脂等生理功能，因此被称为“生物反应调节物”。

然而，食药用真菌多糖的合成过程极为复杂，参与合成的底物和酶系众多，且可参考的技术方法严重不足，因而对其了解和认识十分有限。研究发现，葡萄糖作为灵芝发酵的碳源时，除供菌体自身生长需求外，还会被多种核苷酸糖合成酶（如udp-葡萄糖焦磷酸化酶、udp-葡萄糖-4-差向异构酶、gdp-甘露糖焦磷酸化酶和dtdp-葡萄糖焦磷酸化酶等）转化为相应的udp-葡萄糖、udp-半乳糖、gdp-甘露糖和dtdp-鼠李糖等核苷酸糖，并推测其可能经糖转移酶转运至多糖合成位点最终聚合成菌丝体多糖或胞外多糖。因此，要实现食药用真菌葡聚糖高效而稳定的合成，还需明确葡聚糖合成相关酶系的功能，并采取具有针对性的代谢调控手段以有效强化其合成。

灰树花（grifolafrondosa）是一种富含多糖和蛋白质等营养成分的食用菌。已有的研究结果显示，灰树花子实体中纯化出的葡聚糖（d-fraction）具有显著的抗肿瘤和免疫调节等活性。已有研究证实，灰树花菌丝体多糖或胞外多糖中的单糖组成和含量与核苷酸糖合成酶（磷酸葡萄糖异构酶、udp-葡萄糖焦磷酸化酶、udp-葡萄糖脱氢酶、gdp-甘露糖焦磷酸化酶和udp-葡萄糖-4-差向异构酶）的活性直接相关。但究竟哪些酶系参与了灰树花葡葡聚糖合成途径却始终没有详细报道。到目前为止没有检索到任何关于灰树花多糖合成途径相关酶和合成机制的分子水平研究成果。

技术实现要素：

本发明目的是提供有效改变灰树花葡聚糖合成量的技术手段，具体的，本发明的目的在于提供灰树花葡聚糖合成相关酶，即葡聚糖合成酶，同时提供灰树花葡聚糖合成酶编码基因序列、基因沉默和基因过表达质粒、基因工程菌及生产方法。

为实现灰树花菌丝体多糖高效而稳定的合成和进一步提升灰树花发酵产品品质的目标，本发明首次从灰树花菌丝体基因组中克隆得到葡聚糖合成关键酶-葡聚糖合成酶的编码基因，并通过基因沉默证明该基因在灰树花菌丝体生长和葡聚糖合成过程中的关键角色；最后通过基因工程技术，在灰树花中过表达葡聚糖合成酶，显著提高了重组菌株细胞生长和葡聚糖合成产量。本发明将有助于从分子水平理解食药用真菌多糖的合成机制，开展食药用真菌多糖合成的代谢工程研究和高效发酵生产品质稳定的葡聚糖提供重要的技术支持和参考。

本发明通过rna干扰（rnainterference,rnai）技术进行灰树花葡聚糖合成酶基因沉默，以及通过同源重组技术进行灰树花葡聚糖合成酶基因过表达，为分子水平理解食药用真菌多糖的合成机制和高效生产免疫增强剂葡聚糖提供行之有效的解决策略和方法，所构建的重组菌株能以葡萄糖、淀粉水解物和木质纤维素等底物合成葡聚糖。

本发明提供一种灰树花葡聚糖合成酶，所述酶包括4个亚基fks1-0、fks1-1、fks1-2和fks1-3，各亚基的氨基酸序列如seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、seqidno.8所示。

编码所述葡聚糖合成酶各亚基fks1-0、fks1-1、fks1-2和fks1-3的基因序列如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4所示。

本发明还提供所述灰树花葡聚糖合成酶在改变提高葡聚糖合成量中的用途，所述改变包括上调或下调灰树花多糖合成量；进一步的，所述上调葡聚糖合成量是通过过表达编码灰树花葡聚糖合成酶亚基fks1-0的基因实现；所述下调葡聚糖合成量是通过基因沉默编码灰树花葡聚糖合成酶亚基fks1-0的基因实现;进一步的，所述上调或下调灰树花多糖合成量是通过过表达或基因沉默灰树花葡聚糖合成酶亚基fks1-0编码基因的保守序列（seqidno.9）实现。

本发明还提供一种重组载体，即过表达载体，所述载体包含所述灰树花葡聚糖合成酶亚基fks1-0编码基因的保守序列（seqidno.9），用于上调灰树花葡聚糖合成量。所述重组载体是通过扩增葡聚糖合成酶亚基fks1-0编码基因保守序列（seqidno.9），经t4dna连接酶与质粒pgu3301连接获得；根据本发明的实施例之一，所述的基因过表达载体为pgu3301-fks1-0。

所述重组载体还包括灰树花gpd启动子（seqidno.10）和构巢曲霉35s启动子（seqidno.11），即基因沉默载体。所述重组载体的构建是分别克隆seqidno.9序列、seqidno.10序列和seqidno.11序列，再通过overlap-pcr将三个基因片段进行连接，质粒pan7-1经bami和hindiii酶切，然后通过t4dna连接酶将基因片段和酶切质粒片段连接获得双向启动子沉默葡聚糖合成酶基因保守区域的载体。根据本发明的实施例之一，所述的基因沉默载体为pan7-fks1-0。

本发明还提供一种重组工程菌，所述重组工程菌包括所述的基因沉默载体或过表达载体。所述工程菌是通过制备不完全酶解的灰树花原生质体，并采用电击转化法将所述的重组载体转化该原生质体得到。

其中，所述制备不完全酶解的灰树花原生质体是通过将培养的灰树花菌丝体经0.3-0.6m甘露醇溶液洗涤后，加入0.5-4.0%溶壁酶（购自广东微生物研究所）在25-45℃条件下酶解1-5h，离心收集酶解后的不溶物，经过滤获得。

所述的电击转化法将基因沉默载体或过表达载体转入原生质体，是将基因沉默载体pan7-fks1-0或基因过表达载体pgu3301-fks1-0与灰树花原生质体混匀后，在设置电场强度为0.5-3.5kv/cm，电容15-45μf和电阻200-600ω等条件下电击2.0-8.0ms后，依次涂布到选择性再生cym培养基（潮霉素100μg/ml）和潮霉素抗性平板上，28℃条件培养筛选获得。

本发明还提供所述的重组工程菌在改变葡聚糖合成量中的用途；所述改变包括上调或下调灰树花多糖合成量。

本发明还提供一种高产灰树花葡聚糖的生产方法，采用所述灰树花重组工程菌，以葡萄糖、淀粉水解物或木质纤维素等底物生产，所述方法包括如下步骤：

（1）配制发酵培养基和种子培养基，其碳源为葡萄糖、或淀粉水解物或木质纤维素中的一种或两种，浓度为5.0~100.0g/l；

（2）培养所述的工程菌，在培养基中活化工程菌种子液，并在相应规模的发酵罐中逐级放大制备种子培养液；

（3）将工程菌种子液以5.0%-15.0%的接种量接种到含有发酵培养基的摇瓶或发酵罐。

所述发酵罐培养条件：20℃-30℃，通气量0.5-2.0vvm，搅拌转速50-500rpm，培养3-10d；所述摇瓶条件为：20-30℃，转速80-200rpm，培养3-10d。

使用该方法发酵重组灰树花可得葡聚糖总产量为2.0-50.0g/l以上。

本发明通过首次采用过表达技术或基因沉默正负调控灰树花葡聚糖合成。经基因沉默的灰树花重组菌，菌体生长速度缓慢，且葡聚糖合成量和合成速度与原始菌株相比显著下降甚至全部消除，说明葡聚糖合成酶在葡聚糖合成过程中具有不可替代的作用。经基因过表达的灰树花重组菌，其葡聚糖合成量和合成速度与原始菌株相比显著提高。基因过表达灰树花重组菌在25l发酵罐发酵葡聚糖的产量能够提高50%以上，还具有生长快、培养基廉价、遗传稳定、产量高等诸多优势，具有明显的工业化生产的潜力。本发明为利用基因工程技术改造出食药用真菌的葡聚糖合成途径提供技术基础和方法指导。

附图说明

图1为灰树花葡聚糖合成酶各亚基（fks1-0，fks1-1，fks1-2和fks1-3）基因的克隆结果；图中，m：dnamaker，1为fks1-0扩增产物，2为fks1-1扩增产物，3为fks1-2扩增产物，3为fks1-3扩增产物。

图2为灰树花葡聚糖合成酶dicer-likeprotein2功能域预测分析结果。

图3为灰树花葡聚糖合成酶基因序列的基因沉默载体构建示意图。

图4为灰树花葡聚糖合成酶电转及再生重组菌在含有100μg/ml潮霉素培养基生长结果。

图5灰树花葡聚糖合成酶基因沉默和基因过表达的重组菌株在pdb平板上生长对比结果。

图6葡聚糖合成酶基因沉默和基因过表达的灰树花重组菌在25-l发酵罐条件下发酵合成葡聚糖的结果；图中，gf-wt：对照菌株；gfo-fks-1-0：过表达重组菌；gfi-fks-1-0：基因沉默重组菌）。

具体实施方式

以下结合实例与附图对本发明的具体实施作进一步的说明，以下实施例中使用的质粒、pcr试剂等采用商业产品，具体操作按照说明书进行。但本发明的实施方式不限于此，其他未注明的实验操作和工艺参数按照常规技术进行。

本发明实施例中所述的葡聚糖测定方法如下：收集灰树花发酵醪，经10000g离心收集上清液，浓缩后使用95%乙醇按体积比1:3沉淀；10000g离心收集醇沉物，经50℃真空干燥至恒重，即为所产葡聚糖重量并记录。

本发明实施例中所述的葡聚糖中单糖组成测定方法如下：称取30mg所产葡聚糖样品，加入3ml72%h2so4，30℃水浴60min后，加入8.4ml蒸馏水，于121℃反应1h后碳酸钙调节ph至中性，8000g离心收集上清液，旋转蒸发至干。称取水解后的样品，依次加入1mg内标物肌醇、10mg盐酸羟胺及1.0ml吡啶，90℃水浴30min后，冷却至室温，加入1.0ml乙酸酐，90℃继续水浴30min，得到各个标准单糖的糖腈乙酸酯衍生物；精确称取以上六种单糖各1mg，加入相同试剂，按上述步骤反应后得到混合标准单糖的糖腈乙酸酯衍生物，0.22μm微孔滤膜过滤后进入gc分析，气相色谱分析条件：美国agilent公司7890a气相色谱仪，毛细管色谱柱，fid检测器。进样口温度280℃，检测器温度300℃，柱温箱起始温度130℃，保持5min，4℃/min到240℃，保持5min，分流比40：1，进样量1μl。根据样品保留时间确定单糖种类，采用内标法计算各单糖的百分含量，明确所产葡聚糖样品中的单糖组成及含量。

本实施例中涉及到的灰树花葡聚糖合成酶fks，所述酶包括4个亚基fks1-0、fks1-1、fks1-2和fks1-3，各亚基的氨基酸序列如seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、seqidno.8所示。

编码所述葡聚糖合成酶各亚基fks1-0、fks1-1、fks1-2和fks1-3的基因序列如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4所示。

所述亚基fks1-0编码基因的cdna序列为seqidno.12所示；葡聚糖合成酶基因保守序列和克隆灰树花gpd启动子和构巢曲霉35s启动子的序列分别为seqidno.9、seqidno.10和seqidno.11所示。

实施例1:灰树花葡聚糖合成酶编码基因的克隆

离心收集灰树花gf02（购自美国模式培养物集存库，americantypeculturecollection，atcc®60301™）培养菌丝体，迅速加入液氮研磨成细粉，通过植物或者真菌基因组提取试剂盒提取基因组。

根据灰树花胞外葡聚糖合成酶亚基的编码基因fks-1-0（genbankid：mk256943）、fks-1-1（genbankid：mk256944）、fks-1-2（genbankid：mk256945）和fks-1-3（genbankid：mk256946）设计引物，分别为：

fks1-0-f(seqidno.13)：5'-acagaagggtctgcaccttaa-3'，

fks1-0-r(seqidno.14)：5'-gtatatgtcgtggagatctatagg-3'；

fks1-1-f(seqidno.15)：5'-ccgtaagagaaacgcacataga-3'，

fks1-1-r(seqidno.16)：5'-tgcagagcacaaataacacataac-3'；

fks1-2-f(seqidno.17)：5'-ccctcccacttagacccaac-3'，

fks1-2-r(seqidno.18)：5'-tctggaagtttagaatggtgcc-3'；和

fks1-3-f(seqidno.19)：5'-gagcccttatgcacaatgg-3'，

fks1-3-r(seqidno.20)：5'-tggtctgtcgtgcacttgtta-3'。

将培养和收集灰树花gf02菌丝体迅速在液氮中研成粉末状提取总rna。根据race技术，使用takara3’-fullracecoresetv2.0试剂盒（takaracode：d314）并设计特异性引物3race1(seqidno.21)：5'-ttctgggtatccatcctcgc-3'，3race2(seqidno.22)：5'-gatacccagaagtaggtca-3'，以灰树花总rna反转录的cdna为模板，pcr扩增获得fks1-0基因3’cdna特异片段，根据已经得到的灰树花基因特异片段，使用takara5’-fullracekit（takaracode：d315）试剂盒并设计特异性引物5race1(seqidno.23)：5'-cccatcagttctcttttgcg-3'，5race2(seqidno.24)：5'-aagaagaagaggctcgggca-3'，经去磷酸化反应，去帽子反应、5'raceadaptor的连接以及反转录反应之后的cdna为模板，pcr扩增获得fks1-0基因5’cdna特异片段，经拼接得到fks1-0基因完整的cdna序列见seqidno.12。

以已经公布的灰树花的基因组（genbankassemblyaccession：gca_001683735.1）为模板采用上述引物扩增基因全长，pcr反应程序：94℃预变性3min；94℃变性20s，退火30s，退火温度52℃，72℃延伸（时间由目的基因长度决定），反应35个循环；采用1%琼脂糖凝胶电泳分离pcr扩增产物，再用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收目的基因片段（如图1所示）测序，然后将测序获得fks1-0、fks1-1、fks1-2和fks1-3的基因序列，在ncbi中进行blast比对，确认其为编码灰树花葡聚糖合成酶的基因序列。

实施例2：构建灰树花葡聚糖合成酶基因序列的基因沉默载体pan7-fks-1-0

根据已经公布的灰树花全基因序列（genbankassemblyaccession：gca_001683735.1），发现灰树花基因组中存在两段dicer-like氨基酸序列（genbank：obz75102.1和obz68881.1），进一步通过ncbi保守功能域预测分析dicer-likeprotein2，结果如图2，灰树花dicer-like蛋白含有三个功能域：helicc,dicer_dimer,andriboc，编码1438个氨基酸，且与其他物种同源性达到95%以上，表明灰树花存在典型的rnai关健酶，存在基因沉默的可能。

根据实施例1中克隆得到的灰树花葡聚糖合成酶各亚基的基因序列（fks-1-0、fks-1-1、fks-1-2和fks-1-3），根据同源区域设计上下游引物分别为：

fks-f(seqidno.25)：5'-cccaagcttgcgccatccataaggtcct-3'，

fks-r(seqidno.26)：5'–ggggtaccgacgatgagggcaacgaag-3'。

以实施例1中得到的灰树花cdna为模板pcr扩增获得目的基因fks-1-0。

根据灰树花gpd基因序列（genbank：a0h81_05461），设计gpd启动子引物为：

gpd-f(seqidno.27)：5'-cgggatcccgttcgcattacacacattg-3'；

gpd-r(seqidno.28)：5'-ggggtaccactggtgggtacaaatgacg-3'。

以实施例1中得到的灰树花总dna为模板pcr扩增目的基因。

根据质粒pan7-1（购于湖南丰晖生物科技有限公司）中构巢曲霉35s启动子序列seqidno.11，设计35s启动子引物为：

35s-f(seqidno.29)：5'-cgggatcccgttcgcattacacacattg-3'；

35s-r(seqidno.30)：5'-ggggtaccactggtgggtacaaatgacg-3'。

以质粒pan7-1为模板pcr扩增目的基因。

分别将灰树花葡聚糖合成酶主要亚基基因fks-1-0进行kpni和xhoi酶切，灰树花gpd基因启动子进行bami和kpni酶切，构巢曲霉35s启动子进行xhoi和hindiii酶切，并将质粒pan7-1进行bami和hindiii酶切。将各酶切产物通过t4dna连接酶获得双向启动子沉默葡聚糖合成酶基因保守区域的载体pan7-fks-1-0（载体构建示意图如图3所示）。

实施例3：不完全酶解制备灰树花原生质体

收集灰树花pda液体培养所得菌丝体，组织粉碎机无菌条件下处理1min，以10%接种量接种于100mlpdb培养基，28℃静置培养4d后，5000g离心15min收集不溶物；用0.6m甘露醇溶液洗涤2次，加入1ml2%丝状真菌破壁酶液，30℃酶解4h。将酶解液以5000g离心15min收集不溶物，无菌过滤得到酶解的原生质体；将制备的原生质体加入50ml再生cym培养基（葡萄糖20g蛋白胨2g酵母膏2g七水硫酸镁0.5g磷酸氢二钾1.0g磷酸二氢钾0.46g琼脂20g，潮霉素100μg/ml）中混匀，倒入平板，28℃培养再生。

实施例4：灰树花葡聚糖合成酶基因沉默重组菌gfi-fks-1-0的构建

取10μg质粒pan7-fks-1-0和1ml灰树花原生质体重悬液至电转杯中，放置1min后电转，电转条件为：电场强度为2.5kv/cm，电容25μf和电阻400ω等条件下电击4ms后，倒入选择性再生cym培养基（潮霉素100μg/ml）和潮霉素抗性平板上，28℃条件培养筛选获得灰树花葡聚糖基因沉默重组菌gfi-fks-1-0。

实施例5：构建葡聚糖合成酶基因过表达的灰树花重组菌gfo-fks-1-0

与实施例2类似，根据同源区域设计灰树花葡聚糖合成酶亚基fks-1-0上下游引物分别为：

fks-f(seqidno.31)：5'-cccaagcttgcgccatccataaggtcct-3'，

fks-r(seqidno.32)：5'-ggggtaccgacgatgagggcaacgaag-3'。

以灰树花cdna为模板pcr扩增获得目的基因fks-1-0。

利用一步法克隆试剂盒(onestepcloningkit；takara)分别将灰树花葡聚糖合成酶主要亚基基因fks-1-0连接到载体pgu3301（购于湖南丰晖生物科技有限公司）的多克隆位点（mcs）区域，转化e.colitop10，进行pcr验证和测序验证，获得葡聚糖合成酶基因过表达载体pgu3301-fks-1-0。

取10μg过表达载体pgu3301-fks-1-0和1ml灰树花原生质体重悬液至电转杯中，放置1min后电转，电转条件为：电场强度为3.0kv/cm，电容20μf和电阻450ω等条件下电击5ms后，到选择性再生cym培养基（潮霉素100μg/ml）和潮霉素抗性平板上，28℃条件培养筛选获得灰树花葡聚糖过表达重组菌gfo-fks-1-0，如图4所示，经验证，电转成功。

实施例6：以葡萄糖为碳源灰树花重组菌gfi-fks-1-0和gfo-fks-1-025-l发酵生产葡聚糖

（1）斜面培养基(g/l)：土豆200，葡萄糖20，蛋白胨5，kh2po41.5，mgso4·7h2o0.75，ph自然。该培养基用于菌种保藏及活化。

一级种子培养基为(g/l)：葡萄糖20，蛋白胨5，kh2po41.5，mgso4·7h2o0.75，ph自然。

二级种子培养基为(g/l)：葡萄糖30，蛋白胨6，kh2po43，mgso4·7h2o1.5，ph自然。

（2）发酵培养基为(g/l)：葡萄糖60，蛋白胨6，kh2po46，mgso4·7h2o1，大豆油50ml，ph自然。

（3）切取5mm×5mm的新鲜重组菌菌丝块置于斜面培养基上，于28℃的恒温培养箱中培养5d。

分别制备一级和二级种子培养基。接入10块5mm×5mm重组菌菌块，装液量为75/250ml，28℃、150rpm摇床培养3d，制得一级种子液。将一级种子液接种于二级种子培养基中，接种量10%(v/v)，装液量150/500ml，摇床(28℃，150rpm)培养3d，获得二级种子液。

（4）将培养好的二级种子液以10%的接种量，接种至25l发酵罐中，装液量60%，控制温度28℃，培养7d，控制搅拌转速和通气量分别为90rpm和0.8vvm。每24h取发酵醪，10000g离心10min后，得到灰树花菌丝体沉淀，蒸馏水反复洗涤菌体，冷冻干燥后称量计算菌丝体干重；上清液经浓缩乙醇沉淀，干燥后称量计算葡聚糖量，并检测葡聚糖样品中单糖组成。经发酵6d后，灰树花原始菌株wt菌体量为23.4g/l，胞外葡聚糖产量为1.03g/l；而灰树花葡聚糖合成酶基因沉默重组菌gfi-fks-1-0的菌体量仅为5g/l，葡聚糖产量为0.4g/l，其葡萄糖组成达98%以上；而葡聚糖合成酶基因过表达菌株gfo-fks-1-0的菌体量增加到33.2g/l，葡聚糖量达为1.7g/l，其葡萄糖组成达99%以上。这也表明，对葡聚糖合成酶主要亚基进行基因沉默或过表达，均对灰树花菌丝体生长和葡聚糖合成产生直接而显著的影响。

序列表

<110>江苏大学

<120>灰树花葡聚糖合成酶、其编码基因及应用

<160>32

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1913

<212>dna

<213>灰树花(grifolafrondosa)

<400>1

atgcttgtcatcctgtccgttcagatattcattgtgacgagtaagtgttatgtgttattt60

gtgctctgcatggtgcttatgaatttgattcgcagtggttttcttggggacgttgaacga120

ccagctgctcgtctgcaagtattcctcttcgggccagtttatcggtacaacaggatgcta180

caatctcactcctgcgttccagtggatcgaccattgcatcatcagtattttcttggtatt240

tatgattgcatacctccccctgttcctacaaggtacgtcgaagtgtcatgattataacgt300

ccaattcgataaccgtaattccgcagagcttgttgagcgtggaactggcaaagctgtatt360

tcgactggcgaagcacttcggttcggcgtctcctgcgttcgaagtgttctcgacacagat420

ctcttctcattcaattatcaccaacttgactttcggaggtgcaagatacatcgccaccgg480

ccgtggcttcgcgacgacgagaatttcatttagcatcctatactcgagatttgcggggcc540

aagtatctatctcgggatgaggacattgattatgttgttatatgtgactctgaccatctg600

gacgggttgggtgacctacttctgggtatccatcctcgctttgtgcatttcgccgttcct660

cttcaatccccatcagttctcttttgcggactttatcattgactacaggtaagctagaat720

tgtagacctaatcgttcacgtcactaacttgaattccagggagttcttgcggtggatgaa780

ccgcggcaactcgcgcgtacaccagaactcttggattggctattgccggttatcacggac840

tatgattacaggctacaagaagaagaggctcgggcatccttcagagaaattgtcgggtga900

cgtcccgcgtgcgggctggcgagcggtcttgttctcggaggtcatcttccccatcgtgat960

ggccaccctgttcgtcatcgcatacatgctcgtgaagtcgttcccggacaaggatgggaa1020

gcaaccgcccagccccctcattcgaatcgcaatcgtatctcttgggccgattgtttggaa1080

tgctgcgatattgctcgtcctgttcatgttctcgcttttccttggaccgatgctcgacac1140

accgttccccaagttcggatcattgatggctttccttgggcactcgctcggtgtcatcgg1200

catgatcgcattcttcgagttcctcgtaagtcgtctcaccttatctatttcttgacatcg1260

ctcactttccgcggcacatagtggttcctcgagctgtggaacgtcgcacacgccgtgctc1320

ggtctgatcgcagtcatcttcattcagcgcgccatccataaggtcctgatttcggtgttc1380

ctgtcgcgcgagttcaagcatgacgagacgaaccgggcgtggtggacaggtaaatggtac1440

ggccgcgggctgggctcgcacgcgatgtcacagcctgcacgagagttcatcgtgaagatc1500

atcgagctgtcgctgtggagctcagatttcctcactggccacctattgctcttcttgttg1560

acaccgccaatcctcataccgtacttcgaccggctacactcgacgatgctctgtgagtag1620

ctatgctatgatttatgctaatgatgttactgatatcgagtctgcagtctggttgaggcc1680

gtcaaaacaaatccgcgcaccgttgtattccatcaagcagaagcggcaacgtcggtggat1740

tgtcatcaagtatggtgctgtctacgtgctcgcgatcggcatcttcgttgccctcatcgt1800

catccgtgggtattgctcatctgtatggtgtcattgttgctcatcccgcccatgtagcgc1860

tcgtcttccggcaatcgctgaccttcaactgcagcatttgccaacaggtctga1913

<210>2

<211>3966

<212>dna

<213>灰树花(grifolafrondosa)

<400>2

atggccggtcgctctggtccacgaagccaggagggcatgtatgtctcctcgtctccgtct60

tcagacccccacgatcccttcagcaacgtccacgcacaaatgcccgagccccagaggtac120

tacgacaacgactctgaccagatagataattacggtcggcgcgacacctatggctcggat180

ggcagtaatggaggaaacgacgacgatcgttattatgaccacaacggcgcctacgatccg240

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