褐鲳鲉抗菌肽moronecidin及其应用的制作方法

本发明涉及海洋分子生物学技术领域，具体涉及褐鲳鲉抗菌肽moronecidin及其应用。

背景技术：

近半个世纪以来，世界人口爆发性增长使人类社会对食品的需求大幅增长，以此为契机而飞速发展的畜牧和水产养殖业不可避免地面临各种病原微生物引起的病害所导致的减产。抗生素的应用在一定程度上提高了畜牧和水产养殖业的经济效益及饲料的利用率，然而其滥用也给人类社会带来了严重的威胁。我国每年生产抗生素原料约21万吨，其中9.7万吨应用于畜牧和水产养殖业，占年总产量的46.1％。畜牧和水产养殖业中抗生素的使用不仅能够直接导致病原菌产生耐药性，甚至对养殖相关的水体、土壤产生二次污染；不仅如此，残留在畜禽、水产品中的抗生素还可通过食物链进入人体内，严重威胁人类健康。因此，寻求高效、绿色的抗生素替代品成为近年来的研究热点。

自然界中，抗菌肽(antimicrobialpeptide，amp)广泛存在于生物体内，是生物体先天性免疫系统的重要组成部分，一般具有较为广谱的抗菌活性。天然抗菌肽通常由12～100个氨基酸组成，具有较好的热稳定性和水溶性，对细菌、真菌等具有较强的抑杀活性。抗菌肽研究始于1972年，瑞典科学家boman等在果蝇中发现抗菌肽及其免疫功能，随之1981年成功分离得到天蚕素a和b。迄今为止，约有2800种抗菌肽被成功分离和研究。随着研究技术的发展，越来越多的抗菌肽被分离鉴定出来，研究者们亦对其作用机制进行了深入的探索。大量研究表明，抗菌肽能够通过多种不同作用机制发挥其活性功能，如破坏细胞质膜结构、攻击微生物线粒体、抑制细菌蛋白质合成及细胞壁形成及与微生物染色质结合发挥其杀菌功能等。近年来，研究者们发现一些抗菌肽甚至具有抑杀病毒、寄生虫、抑制癌细胞生长等能力，且对高等动物的正常体细胞无明显细胞毒性，且不易使受试菌产生耐药性。在越来越多耐药性微生物被发现的今天，抗菌肽因其物理吸附、破坏微生物膜的作用机理不易使细菌产生耐药性的特征，在临床医药等领域具有良好的应用前景。抗菌肽因其具有在体内可降解、安全高效、不易产生耐药性等特点，被认为是抗生素的理想替代品之一。因此，有必要对未知抗菌肽进行深入研究、对已知抗菌肽进行进一步改造，使得更多新型、高效、有针对性的低毒抗菌肽及其制品在畜禽和水产养殖领域广泛应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了褐鲳鲉抗菌肽moronecidin及其应用。本发明于褐鲳鲉肝脏转录组文库中首次获得抗菌肽sm-mor基因序列，进一步利用pcr方法对其核苷酸序列进行了验证，采用固相化学合成方法获得了sm-mor多肽，实验发现其具有广谱抗细菌、真菌活性，有作为水产养殖饲料添加剂、抗菌剂应用的前景。本发明为来源于褐鲳鲉肝脏表达的抗菌肽sm-mor的首次报道。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：

一种抗菌肽，为褐鲳鲉(sebastiscusmarmoratus)抗菌肽moronecidin(sm-mor)，其氨基酸序列如seqidno.1所示，为：

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所述褐鲳鲉抗菌肽sm-mor的开放阅读框序列如seqidno.2所示，为：

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所述褐鲳鲉抗菌肽sm-mor的分子式为c314h495n89o85s4，分子量为7005.17道尔顿。所述褐鲳鲉抗菌肽sm-mor由60个氨基酸组成，来源于褐鲳鲉，是具有抗菌功能的多肽。该抗菌肽的成熟肽预测分子量为4555.13道尔顿，所含38个氨基酸中包含7个带正电荷的氨基酸残基和6个带负电荷的氨基酸残基，根据氨基酸残基电荷预测该抗菌肽等电点为8.74，在ph等于7.0时带有1个正电荷。该抗菌肽的亲水性平均系数为-0.732，具有亲水的水溶性，是一种带有正电荷的阳离子多肽。

采用固相化学合成方法即可获得纯度达95％以上的褐鲳鲉抗菌肽sm-mor。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：

所述的抗菌肽在制备抗菌剂中的应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是：

所述的抗菌肽在制备饲料添加剂中的应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之四是：

所述的抗菌肽在制备防霉防腐剂中的应用。

所述褐鲳鲉抗菌肽sm-mor对多种革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌及真菌有显著的抗菌活性。其中，对谷氨酸棒杆菌的最小抑菌浓度为1.56～3.125μm；对重要致病菌金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度为3.125～6.25μm；对施氏假单胞菌最小抑菌浓度为3.125～6.25μm。此外，对新型隐球菌的最小抑菌浓度为1～2μm，且最小杀菌浓度为8～16μm。与许多已知的海洋动物抗菌肽比较，sm-mor抗菌效果好、杀菌速率快，显示出极大的应用价值，在制备防腐剂、抗菌剂方面有良好的应用前景。

所述褐鲳鲉抗菌肽sm-mor对小鼠肝实质细胞aml12无细胞毒性，在较低浓度时(接近体外抗菌效应浓度)对人正常肝细胞l02无明显细胞毒性，预示其可安全用于药物治疗或者作为饲料添加剂使用。

本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：

本发明提供了一种具有广谱且高效抗菌的抗菌肽，其抗菌效应浓度下对非癌细胞系无细胞毒性，具有应用安全性。该抗菌肽可通过固相化学合成方法大量获得。该抗菌肽来源于海洋鱼类，既可用于畜禽养殖业作为饲料添加剂，也可研制用于哺乳动物的抗菌药物，具有广泛的应用前景。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1为褐鲳鲉抗菌肽sm-mor对金黄色葡萄球菌、施氏假单胞菌及新型隐球菌的杀菌动力学曲线图。在图1中，横坐标为时间(min)，纵坐标为存活菌落数相对于起始菌落数的百分比。

图2为mts法检测褐鲳鲉抗菌肽sm-mor对非癌细胞系小鼠肝实质细胞aml12和人正常肝细胞l02增殖影响的实验图。星号表示显著抑制细胞生长的浓度(*:p<0.05；**:p<0.01)。

具体实施方式

下面通过实施例具体说明本发明的内容：

以下实施例可以使本专业技术领域的技术人员更加全面的了解本发明，本发明并不限于下述实施例。

本实施例涉及的菌种有：蜡状芽孢杆菌(bacilluscereus)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)、表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermidis)、铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)、荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)、施氏假单胞菌(pseudomonasstutzeri)、嗜水气单胞菌(aeromonashydrophila)、大肠埃希氏菌(escherichiacoli)、弗氏志贺氏菌(shigellaflexneri)、副溶血弧菌(vibrioparahaemolyticus)、解藻弧菌(vibrioalginolyticus)、白假丝酵母(candidaalbicans)、新型隐球菌(cryptococcusneoformans)等，均购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心。

实施例1褐鲳鲉抗菌肽sm-mor核苷酸序列扩增

所述褐鲳鲉抗菌肽sm-mor开放阅读框序列如seqidno.2所示，为：

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通过对褐鲳鲉肝脏转录组进行测序，筛选获得了褐鲳鲉抗菌肽sm-mor基因全长cdna序列。褐鲳鲉抗菌肽sm-mor基因的开放阅读框为183bp(含终止密码子taa)，genbank登录号：mk387855。

表1moronecidin序列pcr扩增引物

根据所获得的sm-mor基因的全长cdna序列，设计基因特异性引物(表1)，通过pcr技术对其序列进行进一步验证。以第一对引物为例，pcr反应体系如下：

混合均匀，进行pcr反应。反应程序如下：

1)95℃预变性5min；

2)95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；

3)72℃延伸5min；

4)4℃停止。

将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，切下含有目的片段的琼脂糖凝胶，放入1.5ml离心管中。使用wizardsvgelandpcrclean-upsystem回收试剂盒回收目的dna片段。具体步骤如下：

(1)称量凝胶重量，按照每100mg琼脂糖凝胶对应100μl溶液bd的比例，向离心管中加入溶液bd；

(2)60℃水浴10min，直至凝胶完全融化；

(3)将溶液置于dna纯化柱中，静置1min；16000g离心1min，弃溶液；

(4)将纯化柱置于原收集管中，加入700μlmembranewashsolution，16000g离心1min，弃滤液；

(5)重复1次步骤(4)；

(6)将纯化柱置于原收集管中，16000g再次离心1min，彻底去除纯化柱中残留的液体；

(7)将离心柱至于新的1.5ml离心管中，向纯化柱的中央处滴加30～50μlnuclease-freewater；16000g离心1min，管底部即为目的dna片段，置于-20℃保存。

(8)取部分回收的dna样品进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像系统对电泳结果拍照。

pcr产物与载体连接并转化

(1)使用pmd19-tvector试剂盒，在离心管中配置如下反应体系：

(2)16℃反应30min；

(3)全量加入到感受态细胞中，在冰水中放置30min；

(4)42℃热激45s，然后迅速放置在冰水中1min；

(5)加入890μllb液体培养基，37℃、200rpm振荡培养2h，然后4000rpm离心10min，从底部吸取100μl菌液，在含amp的固体培养基上培养过夜(14h)；

(6)在平板培养基中挑选5个白色菌落加入5ml含amp的lb液体培养基中，20℃、200rpm，培养时间约3.5h。

pcr法快速鉴定阳性克隆

利用通用引物m13f-47和m13r-48，对克隆的sm-morcdna序列进行验证。

(1)使用2×hsmix试剂构建pcr反应体系，菌落pcr体系如下：

(2)混合均匀后，按以下程序进行pcr反应：

94℃、3min；

94℃、30sec，55-68℃、30sec，72℃、1min，30个循环；

72℃、10min；

4℃停止反应。

(3)吸取5μl扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像系统在紫外灯下观察电泳结果，并拍照。

核酸序列测定与分析

将鉴定含有重组阳性克隆的大肠杆菌按照15％的比例加入灭菌甘油进行保种，样品送至生物公司进行核苷酸序列测定。利用生物信息学软件对所测的序列进行拼接和比对。

综上分析，所述sm-mor基因来源于褐鲳鲉肝脏，其氨基酸序列列如seqidno.1所示，为：

mrfitlflvlsmvvlmaepgeaffrhivgaisrifgqkqrdmadqqeldqrafdrerafa

所述褐鲳鲉抗菌肽sm-mor的分子式为c314h495n89o85s4，分子量为7005.17道尔顿。所述褐鲳鲉抗菌肽sm-mor由60个氨基酸组成，来源于褐鲳鲉，是具有抗菌功能的多肽。该抗菌肽的成熟肽预测分子量为4555.13道尔顿，所含38个氨基酸中包含7个带正电荷的氨基酸残基和6个带负电荷的氨基酸残基，根据氨基酸残基电荷预测该抗菌肽等电点为8.74，在ph等于7.0时带有1个正电荷。该抗菌肽的亲水性平均系数为-0.732，具有亲水的水溶性，是一种带有正电荷的阳离子多肽。

采用固相化学合成方法即可获得纯度达95％以上的褐鲳鲉抗菌肽sm-mor。

本实施例中褐鲳鲉抗菌肽sm-mor委托上海辉孚实业有限公司通过固相化学合成方法获得，并提供多肽分子量、hplc、质谱等监测信息。

实施例2褐鲳鲉抗菌肽sm-mor最小抑菌浓度(mic：minimuminhibitionconcentration)和最小杀菌浓度(mbc:minimumbactericidalconcentration)的测定

(a)将保种的蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、谷氨酸棒杆菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、施氏假单胞菌、嗜水气单胞菌、大肠埃希氏菌、弗氏志贺氏菌等在营养肉汤平板上划线，副溶血弧菌、解藻弧菌在2216e海水肉汤平板上划线，在相应培养最适温度倒置培养12-16h；白假丝酵母、新型隐球菌在ypg平板上划线，于28℃培养3-7天。从各平板上挑取菌落接种于相应培养基斜面上，细菌继续培养10-16h，真菌继续培养1-3d后，用10mm磷酸盐缓冲液(ph7.4)冲洗斜面，细菌用mh液体培养基：10mm磷酸缓冲液＝2：3的混合培养基稀释至od600＝0.003；弧菌用海水培养基调整稀释至od600＝0.0006；酵母用ypd液体培养基：10mm磷酸缓冲液＝2：3的混合培养基调整稀释至od600＝0.00067。准备好的菌液须在20min内使用。

(b)将抗菌肽sm-mor经0.22μm滤膜过滤后，利用bradford法测定蛋白浓度，倍比稀释蛋白浓度为1.56、3.12、6.25、12.5、25、50μm，4℃保存备用。

(c)在96孔细胞培养板上进行最小抑菌浓度检测实验，每种被测菌按照以下操作设置空白对照组、阴性对照组和待测样品实验组，每组设置3个平行样：

阴性对照组：加50μl灭菌超纯水和50μl菌悬液；

空白对照组：加50μl待测蛋白样品和50μl磷酸盐缓冲液；

样品实验组：加50μl待测蛋白样品和50μl菌悬液。

对于细菌，将培养板置于各菌种相对应的最适培养温度下，培养18-24h，观察结果；

对于真菌，将培养板置于28℃培养1-2d，观察结果。

将96孔细胞培养板待测实验组中肉眼观察未有菌生长的孔中培养液混匀后，吸取2μl接种于相应固体培养基平板上，置于各最适生长温度继续培养24-48h，观察mbc(minimumbactericidalconcentration)结果。

褐鲳鲉抗菌肽sm-mormic、mbc抗菌谱如表2所示：

表2褐鲳鲉抗菌肽sm-mor的抗菌活性测定

注：mic：最小抑菌浓度(μm)，用a-b表示。a：肉眼可见菌体生长的最高蛋白浓度；b：肉眼未见菌体生长的最低蛋白浓度。

mbc：最小杀菌浓度(μm)，能够杀死99.9％菌体的最低蛋白浓度。

实施例3褐鲳鲉抗菌肽sm-mor杀菌动力学曲线

本部分选取一种革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)、一种革兰氏阴性菌(施氏假单胞菌)及一种真菌(新型隐球菌)作为被测菌进行褐鲳鲉抗菌肽sm-mor杀菌动力学曲线的测定。

(a)将保种的施氏假单胞菌及金黄色葡萄球菌涂布于营养肉汤平板上，将保种的新型隐球菌涂布于ypd上，在最适培养温度倒置培养。

(b)从平板上挑取菌落接种于斜面上继续培养，用10mm磷酸盐缓冲液(ph7.4)冲洗斜面，用mh液体培养基(或ypd液体培养基)：10mm磷酸缓冲液＝2：3的混合培养基调整菌悬液浓度至od600＝3.3×10⁴cfu/ml。

(c)将sm-mor蛋白表达产物经过0.22μm滤膜过滤后，稀释蛋白至所需实验浓度，置于冰上待用。

(d)在96孔细胞培养板上，设置阳性对照组、待测实验组，每组设置三个平行样：

阳性对照组：加100μl菌悬液和100μl10mm磷酸缓冲液。

待测实验组：加100μl菌悬液和100μl待测蛋白样品。

将96孔细胞培养板置于28℃培养箱中继续培养，于不同时间点取适量培养液稀释后涂布营养肉汤平板或ypd平板，平板于菌种最适温度继续培养至单克隆生长，计数每个平板上克隆数目，统计分析并作杀菌动力学曲线。结果表明：2倍mbc浓度可在作用120min内杀死50％的新型隐球菌，在540min后杀菌指数达到100％；2倍mbc浓度的sm-mor与金黄色葡萄球菌作用15min后，杀菌指数达到100％；2倍mbc浓度的sm-mor与施氏假单胞菌作用20min后，杀菌指数达到100％。

实施例4褐鲳鲉抗菌肽sm-mor对动物细胞系增殖的影响

本部分选取人正常肝细胞l02、小鼠肝脏实质细胞aml12作为受试细胞株，进行褐鲳鲉抗菌肽sm-mor对不同细胞增殖影响的检测。

(a)将aml12细胞、l02细胞在对应细胞培养基中培养至细胞接合度80-90％后，用含edta的胰酶消化并用相应细胞培养基重悬，以相应细胞培养基调整细胞密度，在96孔细胞培养板中每孔接种2×10⁴个细胞，置于37℃细胞培养箱在5％的co2条件下过夜培养。

(b)待每孔细胞生长到接合度约60-70％时，吸取细胞培养基，用相应细胞培养基倍比稀释sm-mor蛋白至0、5、10、20、40μm，以含10μm牛血清蛋白(bsa)的正常细胞培养基为对照，每组设置3个平行样。

将96孔细胞培养板放入37℃、5％的co2条件下继续培养48h后，每孔加入20μlmts试剂，放入培养环境反应2h后，用酶标仪测定在波长为490nm时的吸光值。结果表明：褐鲳鲉抗菌肽sm-mor对小鼠肝脏实质细胞aml12无抑制其生长的作用；在低浓度时无抑制其人正常肝细胞l02生长的作用，而在较高浓度时具有一定抑制作用。

以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

序列表

<110>自然资源部第三海洋研究所

<120>褐鲳鲉抗菌肽moronecidin及其应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>60

<212>prt

<213>褐鲳鲉(sebastiscusmarmoratus)

<400>1

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151015

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354045

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<212>dna

<213>褐鲳鲉(sebastiscusmarmoratus)

<400>2

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<210>3

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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