一种用于培育抗干旱微生物的基因的制作方法

本发明涉及生物技术及基因工程领域，具体而言，涉及一种用于培育抗干旱微生物的基因。

背景技术：

耐辐射戈壁异常球菌(deinococcusgobiensisi-0)在中国新疆寒冷的沙漠戈壁中发现，对辐射、氧化及干旱等非生物胁迫具有很强的抗性。有学者研究了该菌冷激蛋白编码基因csp1，发现csp1的表达能增强大肠杆菌耐受高温、高盐、干旱等非生物胁迫的能力。也有研究者发现在冷冻、高盐胁迫条件下，戈壁异常球菌编码的dgl5蛋白能够提高相关酶的活性，进而缓解外界环境对宿主大肠杆菌的伤害。

但是，从目前的研究结果看，耐辐射戈壁异常球菌的研究才刚起步，还有许多需要研究和解决的问题。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种能够提高微生物耐干旱能力的蛋白，微生物通过产生该蛋白，能提高微生物耐干旱的能力。

本发明的第二目的在于提供上述的蛋白在培育耐干旱微生物中的用途。

本发明的第三目的在于提供编码上述蛋白的编码基因。

本发明的第四目的在于提供含有上述编码基因的重组质粒。

本发明的第五目的在于提供含有上述编码基因的重组工程菌。

本发明的第六目的在于提供一种基因组包括的编码基因。

本发明的第七目的在于提供一种提高微生物耐干旱的方法。

为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：

一种能够提高微生物耐干旱能力的蛋白，蛋白的氨基酸序列seqidno.1所示。

上述的蛋白在培育耐干旱微生物中的用途。

编码上述蛋白的编码基因。

含有上述编码基因的重组质粒。

含有上述编码基因的重组工程菌。

上述编码基因在培育耐干旱微生物中的用途。

一种基因组，基因组包括上述的编码基因。

一种提高微生物耐干旱的方法，包括通过在微生物体内提高上述蛋白的含量，蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供一种能够提高微生物耐干旱能力的蛋白，该蛋白具有耐干旱的能力；因此可以提高微生物耐干旱的能力，编码上述蛋白的编码基因以及含有编码基因的重组质粒和重组工程菌，因此将基因、重组质粒和重组工程菌可以用于提高微生物耐干旱的能力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实验例1所提供的蛋白的亲/疏水性分析图谱；

图2为本发明实验例1所提供的跨膜结构域分析；

图3为本发明实验例1所提供铁蛋白结构域的预测；

图4为本发明实验例1所提供原核重组表达质粒的构建验证电泳图谱；

图5为本发明实验例2所提供未进行山梨醇冲击实验的菌落生长图；

图6为本发明实验例2所提供山梨醇冲击实验的菌落生长图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

实施例中所举的质粒、菌株及试剂如下：

质粒：

表达载体pet28a由本实验室保存，pet28a-dgfe1(dgfe-1基因片段与表达载体pet28a通过酶切连接)重组质粒由本研究构建。

实验菌株：

大肠杆菌top10及bl21菌株购自北京全式金生物技术公司；pet28a/bl21(空载体pet28a转化大肠杆菌bl21菌株获得的重组菌株)、pet28a-dgfe1/bl21(重组质粒pet28a-dgfe1转化大肠杆菌bl21菌株获得的重组菌株)由本研究构建，e.coli及其重组菌株均在lb培养基中生长，培养温度为37℃。

生化试剂：

限制性核酸内切酶及t4dna连接酶购自neb公司；琼脂糖凝胶dna回收试剂盒、普通质粒小提试剂盒均购自天根生化科技公司(tiangen)；dntps、高保真transstartfastpfudnapolymerase购自全式金生物公司；iptg购自阿拉丁(aladdin)；卡那抗生素购自vwr生物技术公司；试验中所用引物合成及测序均成都擎科梓熙生物技术有限公司完成。

培养基：

lb培养基：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l，ph调至7.0，固体培养基中加入agar15g/l。高压蒸汽(121℃,1.034×10⁵pa)灭菌30min。

抗生素及主要溶液配制：

卡那霉素(km)(50mg/ml)：称取1g卡那霉素粉末，溶于20ml灭菌去离子水中，滤膜过滤除杂后分装，保存于-20℃冰箱；

iptg(100mmol/l)：称取0.24giptg，溶于10ml双蒸水中，滤膜过滤除菌后分装，保存于-20℃冰箱。

下面对本发明实施例的一种用于培育抗干旱微生物的基因进行具体说明。

一种能够提高微生物耐干旱能力的蛋白，蛋白的氨基酸序列seqidno.1所示。

上述的蛋白在培育耐干旱微生物中的用途。

编码上述蛋白的编码基因。

进一步地，本发明较佳的实施例中，编码基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。

含有上述的编码基因的重组质粒。

含有上述的编码基因的重组工程菌。

上述的编码基因在培育耐干旱微生物中的用途。

一种基因组，基因组包括上述的编码基因。

一种提高微生物耐干旱的方法，包括通过在微生物体内提高上述的蛋白的含量，蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种能够提高微生物耐干旱能力的蛋白，蛋白的氨基酸序列seqidno.1所示。

戈壁异常球菌i-0中含有编码编号为dgo_ca1742蛋白，命名为dgfe-1，其氨基酸序列如seqidno.1，编码该蛋白的基因核苷酸序列如eqidno.2所示。dgfe-1蛋白具有耐干旱的功能，可用于培育耐干旱微生物，进而为培育具有耐干旱性状的植物提供参考依据，其编码的蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示。

利用http://web.expasy.org/protparam/对dgfe-1蛋白氨基酸序列进行在线预测，该蛋白由311个氨基酸组成，分子式c1462h2267n403o428s3，其分子量为28001.31da，理论等电点为6.33，不稳定系数为20.58，为稳定蛋白；对dgfe-1蛋白序列进行分析发现，该蛋白富含ala(19.0％)、gly(12.0％)、leu(11.3％)，带负电氨基酸残基总数(asp+glu)为29，带正电氨基酸残基总数(arg+lys)为28，其中疏水氨基酸残基含量为50.5％，总平均疏水指数(gravy)为0.166，同时，利用http://web.expasy.org/protscale/和http://web.expasy.org/protparam/对dgfe-1蛋白亲疏水性进行分析，也显示出该蛋白的疏水特性，结果如图1所示；跨膜结构分析显示，dgfe-1蛋白具有跨膜螺旋结构，且在第29位至52位，结果如图2所示。此外，kegg和ncbi分析预测dgfe-1蛋白含有铁蛋白结构域，属铁蛋白_2超家族，从58位到227位，结果如图3所示。

本实施例还提供一种重组质粒及重组工程菌

通过pcr从deinococcusgobiensisi-0扩增dgfe-1基因。核苷酸长度为936bp，编码311个氨基酸。

扩增引物，引物的上游序列如seqid3所示：

dgfe1-f:5’-cgggatccatgaccgaccagaaccgcag-3’；

扩增引物，引物的下游序列如seqid4所示：

dgfe1-r:5’-cccaagcttttacttgatcgtgccgttca-3’。

将dgfe-1基因连接于pet28a表达载体上，构建含有完整dgfe-1基因的重组质粒pet28a-dgfe1。

通过pcr方法从deinococcusgobiensisi-0的基因组中扩增出目的基因片段，反应条件：95℃10min，[95℃30sec，62℃30sec，72℃45sec]35个循环，72℃10min，pcr产物经胶回收后，通过bamhi/hindiii双酶切获得含有粘性末端的pet28a表达载体及dgfe-1基因片段，将dgfe-1片段连接于pet28a载体上，构建大肠杆菌重组表达质粒pet28a-dgfe1，将该表达质粒转化大肠杆菌bl21，经pcr、质粒酶切、测序验证插入序列正确，将该重组菌株命名为pet28a-dgfe1/bl21，结果如图4所示，图中左图泳道1为重组载体pet28a-dgfe1，泳道2为pet28a-dgfe1载体酶切结果；右图为dgfe-1基因的pcr产物验证电泳图谱。

将含有pet28a空质粒的e.colibl21命名为pet28a/bl21。

当然还可以将dgfe-1与其他的各种合适的质粒连接重组成含有dgfe-1基因的重组质粒。

将导入dgfe-1基因的重组质粒pet28a-dgfe1转入原核宿主细胞大肠杆菌bl21中，获得重组工程菌株pet28a-dgfe1/bl21。

同样，含有dgfe-1基因的重组质粒也可以转入多种宿主细胞形成重组工程菌。

本实施例还提供一种基因组，该基因组包含编码氨基酸序列seqidno.1的蛋白的编码基因；该编码基因可以是核苷酸序列如seqidno.2所示的编码基因。

实施例2

本实施例提供表达dgfe-1蛋白并验证其具有耐干旱能力的实验。

具体操作如下：

将实施例1中获得的含有deinococcusgobiensisi-0dgfe-1基因的pet28a-dgfe1/bl21菌株与含空质粒的pet28a/bl21菌株分别接种于4mllb液体培养基(含km抗生素)中，摇床过夜(37℃)培养后，再分别按od600约为0.1的量转接于20ml的lb液体培养基中，培养30min后加入终浓度为0.1mm的iptg，继续培养至od600为0.5至0.6之间即可。

取1ml菌液，4000r/min离心4min收集菌体，用1ml0.3mol/l的山梨醇溶液重悬菌体，对照组重悬于1ml无菌水重悬，37℃，220r/min培养4-5h。每个样品用无菌去离子水倍比稀释至10^-4，取10μl点在lb固体培养基表面，经37℃，220r/min培养12-16h，观察菌落形成情况并照相。

未进行山梨醇冲击实验的实验结果如图5所示，其中：a是含有空表达质粒的大肠杆菌bl21菌株；b含有dgfe-1基因表达质粒的大肠杆菌重组菌株。

图6是山梨醇冲击实验的结果，其中：a是含有空表达质粒的对照大肠杆菌菌株(pet28a/bl21)经受0.3mol/l山梨醇处理后的菌落；b是含有dgfe-1基因表达质粒的大肠杆菌重组菌株(pet28a-dgfe1/bl21)经受0.3mol/l山梨醇处理后的菌落。

从图5和图6的比较可以看出，山梨醇处理前：含有dgfe-1基因的pet28a-dgfe1/bl21菌株与含空质粒的pet28a/bl21)菌株生长能力基本一致。山梨醇处理后：重组菌株的生长能力明显比含空载质粒的菌株强，生长状况相差1-2个数量级。

含有dgfe-1基因的重组菌株对干旱胁迫的抗性远高于只含空质粒的菌株，该基因的表达提高了大肠杆菌的耐旱能力。

因此，可以通过在细菌体内导入dgfe-1基因并表达dgfe-1蛋白以提高细菌的耐干旱的能力。

综上所述，本发明提供能够提高微生物耐干旱能力的蛋白，该蛋白具有耐干旱的能力，因此可以提高微生物耐干旱的能力，编码上述蛋白的基因以及含有编码基因的重组质粒和重组工程菌，因此将基因、重组质粒和重组工程菌可以用于提高微生物耐干旱的能力，具备较高的实际生产价值。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

序列表

<110>西南科技大学

<120>一种用于培育抗干旱微生物的基因

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>311

<212>prt

<213>耐辐射戈壁异常球菌(deinococcusgobiensis)

<400>1

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151015

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290295300

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<210>2

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<212>dna

<213>耐辐射戈壁异常球菌(deinococcusgobiensis)

<400>2

atgaccgaccagaaccgcagtgcgaccgccgagaccctgaccgacgccaccaccgaagcc60

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<210>3

<211>28

<212>dna

<213>耐辐射戈壁异常球菌(deinococcusgobiensis)

<400>3

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<210>4

<211>29

<212>dna

<213>耐辐射戈壁异常球菌(deinococcusgobiensis)

<400>4

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