一株肠杆菌株及其在制备微生物多糖中的应用的制作方法

本发明涉及一株肠杆菌kosakoniacowaniilt-1菌株及利用该菌株产微生物多糖方法，它属于微生物学及生物工程技术领域。

背景技术：

生物多糖广泛存在于微生物、大型真菌、动物和植物中，是天然界最丰富的聚合物之一。随着生物技术的高速发展，微生物多糖功能的研究也日益完善，成为免疫学、生物学和药学的研究热点。研究表明，微生物多糖由于其独特的化学结构、优越的物理化学性质、流变学特性以及本身的生物活性和营养价值，微生物多糖在各个领域均具有相关应用。此外，微生物多糖具有生产周期短、原料廉价、纯化简单以及可在人工控制下进行大规模工业化生产等动植物多糖所不具备的优势。因此，微生物多糖正迅速成为重要的新兴的生物材料。

经检索，目前未见有使用肠杆菌k.cowanii发酵合成微生物多糖的专利报道。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供了一株产微生物多糖的菌株。

本发明还要解决的技术问题是提供肠杆菌在制备微生物多糖中的应用。

为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：

发明人在2017年从江苏省苏州市地区土壤中筛选得到一株肠杆菌，分类命名为kosakoniacowaniilt-1，已保藏于中国典型培养物保藏中心”(简称cctcc)，保藏地址：湖北省武汉市，洪山区八一路，武汉大学山国典型培养物保藏中心，邮编：430072，登记入册的保藏号为cctccno：m2017850，保藏日期为2017年12月29日。以下内容均以此菌株作为生产菌株。

所述菌株具有下述性质：

1、菌落形态学特征与生理生化特性见表1。

表1菌落形态学特征与生理生化特性

2、16srdna序列分析：

测得菌株的16srdna基因的核普酸序列长度为1388bp，其基因序列如seqidno.1：所示。将所测序列从genebank数据库中使用blast程序进行同源性比较，构建16srdna全序列为基础的系统发育树。结果表明：菌株与肠杆菌hme8565达到100％同源性。根据菌株形态学观察和生理生化实验分析结果认定本发明所使用的是肠杆菌，具体为肠杆菌k.cowaniilt-1。

上述肠杆菌k.cowaniilt-1在制备微生物多糖中的应用也在本发明的保护范围之内。

利用上述肠杆菌k.cowaniilt-1制备微生物多糖的具体的方法如下：将肠杆菌lt-1接种于斜面固体培养基，转接到种子培养基，最后接种于多糖发酵培养基中进行好氧培养，发酵液中富含有细菌微生物多糖。

本发明所述肠杆菌k.cowaniilt-1及其所述菌在制备微生物多糖的应用，依次包括以下步骤：

1.培养基的配制：

斜面培养基：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l，琼脂粉20g/l，自来水配置，调整ph值至7.0～7.2，121℃灭菌20min；

液体种子培养基：蔗糖15g/l，花生饼粉3g/l，无机盐及金属离子1～2.5g/l，自来水配置，调整ph值至7.0～7.2，121℃灭菌20min；

固体种子培养基：液体种子培养基，琼脂粉20g/l，自来水配置，调整ph值至7.0～7.2，121℃灭菌20min；

富集液体培养基：蔗糖30g/l，酵母粉3g/l，硝酸钠3g/l，磷酸二氢钾1.5g/l，硫酸镁0.4g/l，硫酸锰0.05g/l，琼脂粉20g/l，自来水配置，调整ph值至7.0～7.2，121℃灭菌20min；

富集固体培养基：富集液体培养基、琼脂粉20g/l，自来水配置，调整ph值至7.0～7.2，121℃灭菌20min；

发酵培养基：蔗糖30g/l，花生饼粉6g/l，硝酸钠6g/l，磷酸二氢钾0.3g/l，硫酸镁0.4g/l，硫酸锰0.04g/l，自来水配制，ph值调至7.0～7.2，121℃灭菌20min；

2.菌种选择：

选已保藏菌株肠杆菌k.cowaniilt-1；

3.菌种活化：

将肠杆菌k.cowaniilt-1菌种接种于斜面培养基，24～36℃静置培养24～36h，再次挑取单菌落划线到普通固体培养基上，24～36℃培养24～36h，得到活化菌种备用；

4.种子培养：

取步骤3中活化好的菌种，无菌条件下接种2～4环于种子液的摇瓶中，置于转速为200rpm的摇床上，温度为28～38℃培养24h，得到发酵种子液；

5.发酵培养：

将步骤(4)中发酵种子液在无菌条件下以4％～10％体积比的接种量，将种子液接种于发酵培养基摇瓶中，置于转速为200rpm的摇床上，28～38℃培养36～48h；当发酵液中多糖浓度不再上升时，发酵停止；

6.多糖提取：

(1)取步骤5中发酵液离心除去菌体，上清减压蒸馏至1/5体积后加入3～5倍体积的95％无水乙醇，离心取沉淀，沉淀用75％乙醇洗涤，再高速离心收集沉淀恒温干燥后可获得微生物多糖粗品；

(2)将步骤(1)所得的多糖粗品溶解于25倍体积蒸馏水中，用na2co3调ph至7.0～8.0，加入质量为多糖1％～5％的胰蛋白酶，50～60℃水解1～2h后，用草酸调ph至5.0～6.0添加质量为多糖质量2‰～5‰的木瓜蛋白酶，60～70℃水解2～4h后，于100℃水浴加热4～6min，以终止酶反应；

(3)将步骤(2)所得蛋白酶处理液用草酸调ph至7.0，加入3％三氯乙酸，搅拌，15,000rpm离心10～15min，取上清；

(4)将步骤(3)所得清液加入1/3体积的sevag试剂，充分震荡脱去蛋白，制得多糖溶液；

(5)将步骤(4)所得多糖溶液用氨水调ph值至8.0，在50℃下滴加30％的h2o2，至溶液为浅黄色，保温1～2h，然后用草酸中和ph至7.0；蒸馏水透析2～4d后，冷冻干燥得多糖精品，并蒸馏回收酒精；

7.多糖含量测定

本发明利用苯酚硫酸法测定多糖含量：

精密称取干燥恒重的葡萄糖，分别配置成0.000、0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030、0.035、0.040、0.045、0.050mg/ml的标准液，同时配置一定浓度的多糖溶液。精密吸取各标准液和多糖溶液0.2ml，分别置于试管内，各加5％苯酚试剂0.1ml和浓硫酸0.5ml，立刻摇匀。沸水加热15min，冰浴，以0mg/ml的标准液作空白对照，在490nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程，并计算多糖的含量。

有益效果：本发明具有如下优势：

(1)本发明筛选得到一株微生物多糖生产菌株，该菌株在多糖发酵过程以廉价的蔗糖作为碳源，廉价的花生饼粉作为氮源，合成微生物多糖，大大节约成本，操作方便简单。

(2)该菌株发酵合成微生物多糖，产量可达到17.35～59.52g/l，蔗糖转化率高达57.83％～70.17％。大大降低了生产成本，对于微生物多糖的生产具有十分重要的意义和经济价值。

附图说明

图1为肠杆菌lt-1的16srdnapcr纯化琼脂糖凝胶电泳图(a)和肠杆菌lt-1的系统发育树(b)。

图2为肠杆菌lt-1产微生物多糖水解液液相色谱图。

图3为肠杆菌lt-1产微生物多糖的红外光谱图。

图4为肠杆菌lt-1产微生物多糖的核磁共振图(nmr)¹h图谱。

图5为其中(a)为谱；

图5为肠杆菌lt-1产微生物多糖的核磁共振图(nmr)¹³c图谱。

图6为摇瓶合成肠杆菌lt-1微生物多糖进程曲线。

图7为7.5l发酵罐补料合成肠杆菌lt-1微生物多糖进程曲线。

图8为1t发酵罐补料合成肠杆菌lt-1微生物多糖进程曲线。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权力要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：菌株lt-1的筛选

从60份来自全国各地的酒糟中筛选微生物多糖产生菌，各取1g分别加入装有无菌富集培养基的三角瓶中，装液量为50ml/250ml，在37℃条件下，置于摇床以200rpm，富集培养48h。取1ml培养液转接到相同的液体富集培养基中相同条件下进行第二次富集培养，培养48h。在无菌条件下，将培养液稀释到10^-8和10^-9，各取0.2ml涂布于苯胺蓝多糖筛选平板中，30℃培养24h，

根据菌落表面湿润粘稠的程度和合成产物与苯胺蓝反应的颜色变化，筛选出阳性菌株并进行分离纯化，再接种到多糖发酵培养基中，在30℃，200rpm条件下培养48h，然后测定初筛菌株多糖的产量，以此获得产量最高的菌株。

所述的苯胺蓝多糖筛选平板包含如下组分：蔗糖30g/l，硝酸钠2g/l，磷酸氢二钾0.1g/l，氯化钾0.5g/l，硫酸镁0.5g/l，硫酸亚铁0.01g/l，苯胺蓝0.05g/l，琼脂20g/l，自来水配置，自然ph，121℃灭菌20min；

实施例2：菌株lt-1的菌属鉴定及发酵产物微生物多糖的鉴定

①肠杆菌k.cowaniilt-1的鉴定

利用细菌基因组dna提取试剂盒提取菌株lt-1的基因组dna，以上游引物27f和下游引物1492rpcr扩增16srdna序列如图1a所示，将pcr扩增后产物进行胶回收纯化，将胶回收纯化产物送至苏州金唯智生物科技有限公司进行测序。测序所得菌株的16srdna基因的核普酸序列长度为1388bp，其基因序列如seqidno.1所示。将测序结果与genebank数据库中已知16srdna序列进行blast比对，并使用blast程序进行同源性比较，构建16srdna全序列为基础的系统发育树。结果显示：该菌株与肠杆菌k.cowaniihme8565达到100％同源性(图1b)。根据菌株形态学观察和生理生化实验分析结果认定本发明所使用的是肠杆菌，具体命名为肠杆菌k.cowaniilt-1。

②肠杆菌k.cowaniilt-1发酵产物的鉴定

取肠杆菌k.cowaniilt-1多糖发酵液于5,000rpm条件下离心除去菌体，上清液在60～70℃条件下，旋转蒸发浓缩为原体积的1/5，加入3～5倍体积的无水乙醇，离心取沉淀，沉淀用无水乙醇脱水，经过高速离心收集沉淀，恒温干燥后可获得微生物多糖粗品；将多糖粗品溶解于蒸馏水中，用na2co3调ph至7.0～8.0，加入质量为多糖2％～5％的胰蛋白酶，45～55℃酶解1～2h后，用醋酸调ph至5.0～6.0添加质量为多糖质量2％～5％的木瓜蛋白酶，55～65℃水解2～4h后，于100℃水浴加热15～30min，终止酶反应；将蛋白酶处理液用醋酸调ph至7.0，加入3％三氯乙酸，搅拌，5,000rpm离心10～15min，取上清加入1/3体积的sevag试剂，充分震荡脱去蛋白，制得多糖溶液；用氨水调ph值至8.0，在50℃下滴加30％的h2o2，至溶液为浅黄色，保温1～2h，然后用稀盐酸中和ph至7.0；蒸馏水透析2～4d后，冷冻干燥得多糖提纯产物。

取多糖提纯产物0.3g于水解瓶中，加3ml的72％的硫酸，混合，于30℃水浴60min，取出后加入84ml去离子水稀释到5％，混匀。经过121℃，1h处理后，取出冷却，调节ph至6.5，得到多糖酸水解液，多糖水解液液相色谱结果如图2所示。从单糖高效液相色谱图中可以看出，eps共有四种单糖组分，分别为葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和岩藻糖。

利用红外光谱仪测定k.cowaniilt-1发酵微生物多糖提纯产物的红外图谱，取样品0.2mg与少量kbr研磨压片制样，然后用红外光谱仪测定样品的红外图谱，扫描范围4000～400cm^-1。以d2o为溶剂，对k.cowaniilt-1发酵提纯产物进行nmr¹h和nmr¹³c检测。结果如图4、图5所示。

实施例3：肠杆菌lt-1合成微生物多糖的发酵碳源种类优化

本实施例说明不同碳源对菌株微生物多糖产量的影响，将种子培养液以4％(v/v)的接种量分别接种于含30g/l甘油、葡萄糖、蔗糖、乳糖、柠檬酸盐为唯一碳源的发酵培养基中，初始ph值为7.0～7.2，于28～32℃，200rpm振荡培养，培养基装液量为50ml/250ml三角瓶，发酵培养48h，菌株微生物多糖的产生情况明显不同。当且仅当碳源为蔗糖时菌株才能合成微生物多糖，即菌株依赖蔗糖合成微生物多糖。因此，选择蔗糖为发酵培养基的碳源，多糖产量达到17.35g/l，蔗糖转化率为57.83％，多糖合成速率为0.36g/l/h。

实施例4：肠杆菌lt-1发酵合成微生物多糖的蔗糖浓度的优化。

本实施例说明不同蔗糖浓度对菌株微生物多糖产量的影响，将种子培养液以4％(v/v)的接种量分别接种于含10、20、30、40、50、60、70、80、90、100g/l的蔗糖发酵培养基中，初始ph值为7.0～7.2，于28～32℃，200rpm振荡培养，培养基装液量为50ml/250ml三角瓶，发酵培养48h。当所选蔗糖浓度为30g/l时，菌株的微生物多糖产量最多，为17.95g/l，蔗糖转化率为59.83％，多糖合成速率为0.37g/l/h。

实施例5：肠杆菌lt-1发酵合成微生物多糖氮源种类的优化。

本实施例说明不同氮源对菌株微生物多糖产量的影响，将种子培养液以4％(v/v)的接种量分别接种于含5g/l牛肉膏、胰蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、花生饼粉、黄豆粉、小麦胚芽粉、酵母粉为唯一氮源的发酵培养基中，初始ph值为7.0～7.2，于28～32℃，200rpm振荡培养，培养基装液量为50ml/250ml三角瓶，发酵培养48h，菌株微生物多糖的产生情况明显不同。当所选氮源为花生饼粉时，菌株的微生物多糖产量最多。因此，选择花生饼粉为发酵培养基的氮源，多糖产量达到18.21g/l，蔗糖转化率为60.70％，多糖合成速率为0.38g/l/h。

实施例6：肠杆菌lt-1发酵合成微生物多糖的花生饼粉浓度的优化

本实施例说明不同花生饼粉浓度对菌株微生物多糖产量的影响，将种子培养液以4％(v/v)的接种量分别接种于含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10g/l花生饼粉的发酵培养基中，初始ph值为7.0～7.2，于28～32℃，200rpm振荡培养，培养基装液量为50ml/250ml三角瓶，发酵培养48h，菌株微生物多糖的产量差别较大。当所选花生饼粉浓度为6g/l时，菌株的微生物多糖产量最多。因此，选择6g/l花生饼粉浓度为发酵培养基的氮源浓度，多糖产量达到19.24g/l，蔗糖转化率为64.13％，多糖合成速率为0.40g/l/h。

实施例7：肠杆菌lt-1发酵合成微生物多糖的温度优化。

本实施例说明不同培养温度对菌株微生物多糖产量的影响，将种子培养液以4％(v/v)的接种量接种于发酵培养基，初始ph值为7.0～7.2，于200rpm恒温振荡培养，培养基装液量为50ml/250ml三角瓶，发酵培养48h，发酵培养温度分别为24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃，菌株微生物多糖的产生情况明显不同。从结果可以看出在30℃菌株的微生物多糖产量较高。因此选择30℃为最佳生产微生物多糖的温度范围，多糖产量达到19.88g/l，蔗糖转化率为66.27％，多糖合成速率为0.41g/l/h。

实施8：肠杆菌lt-1发酵合成微生物多糖所需金属盐种类及其浓度的优化。

本实施例说明不同金属盐及其浓度对菌株产微生物多糖产量的影响，将种子培养液以4％(v/v)的接种量分别接种于含有以下各不同浓度金属盐的发酵培养基中，经过单因素变量实验如下：

硝酸钠3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0g/l以及对照组，硝酸钠最佳浓度为6.0g/l；

磷酸二氢钾0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60g/l以及对照组，磷酸二氢钾最佳浓度为0.30g/l；

硫酸镁0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60g/l以及对照组，硫酸镁最佳浓度为0.50g/l；

硫酸锰0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06g/l以及对照组，硫酸锰最佳浓度为0.04g/l；

对于不同实验组的发酵培养基，不同浓度的金属离子设置3组平行对照，初始ph值为7.0，于30℃，200rpm振荡培养，培养基装液量为50ml/250ml三角瓶，发酵培养48h，菌株产多糖最高，多糖产量达到20.16g/l，蔗糖转化率为67.20％，多糖合成速率为0.42g/l/h。

实施例9：肠杆菌lt-1发酵合成微生物多糖时间的优化

本实施例说明不同发酵培养时间对菌株微生物多糖产量的影响，将种子培养液以4％(v/v)的接种量接种于发酵培养基，初始ph值为7.0～7.2，于200rpm，30℃恒温振荡培养，培养基装液量为50ml/250ml三角瓶，发酵培养时间分别每隔4h取一次样并测定多糖的含量，共发酵60h，菌株不同时间段微生物多糖的产生情况明显不同。从结果可以看出在28～32℃菌株的微生物多糖产量较高。因此，选择48h为最佳生产微生物多糖的时间范围，多糖产量达到21.05g/l，蔗糖转化率为70.17％，多糖合成速率为0.44g/l/h(图6)。

实施例10：7.5l发酵罐补料合成肠杆菌lt-1微生物多糖

斜面固体培养基为：蛋白胨10g/l，酵母粉3g/l，氯化钠5g/l，琼脂粉20g/l，自来水配置，调整ph值至7.0，121℃灭菌20min；

液体种子培养基为：蔗糖15g/l，花生饼粉3g/l，磷酸氢二钾2g/l，硫酸镁0.05g/l，自来水配制，调整ph值至7.0，121℃灭菌20min；

发酵培养基为：蔗糖30g/l，花生饼粉6g/l，硫酸锰0.04g/l，磷酸二氢钾0.3g/l，硫酸镁0.5g/l，硝酸钠6g/l，自来水配制，调整ph值至7.0，121℃灭菌20min；

将肠杆菌lt-1接种在种子培养基，在30℃，200rpm的摇床条件下培养48h，将种子液按10％(v/v)的种子量接种于预装有7.5l灭菌后的发酵培养基的发酵罐中进行培养，培养条件：整个发酵过程中保持温度32℃，空气比控制在1.4vvm，转速为350rpm，发酵过程中开启ph自动控制装置，利用盐酸或氨水控制发酵液ph值在7.0之间。当发酵液中残留还原糖在10g/l时，打开补料装置，将蔗糖补入发酵液中，除最后一次补料，其他补料时控制发酵液中蔗糖终浓度保持在30g/l左右，进行补料发酵。发酵86h，微生物多糖浓度达到55.67g/l，蔗糖转化率为65.49％，多糖合成速率为0.65g/l/h。

实施例11：1t发酵罐补料合成肠杆菌lt-1微生物多糖

斜面固体培养基为：蛋白胨10g/l，酵母粉3g/l，氯化钠5g/l，琼脂粉20g/l，自来水配置，调整ph值至7.0，121℃灭菌20min；

液体种子培养基为：蔗糖15g/l，花生饼粉3g/l，磷酸氢二钾2g/l，硫酸镁0.05g/l，自来水配制，调整ph值至7.0，121℃灭菌20min；

发酵培养基为：蔗糖30g/l，花生饼粉6g/l，硫酸锰0.04g/l，磷酸二氢钾0.3g/l，硫酸镁0.5g/l，硝酸钠6g/l，自来水配制，调整ph值至7.0，121℃灭菌20min；

将肠杆菌lt-1接种在种子培养基，在30℃，200rpm的摇床条件下培养48h，将种子液按10％(v/v)的种子量接种于预装有750l灭菌后的发酵培养基的发酵罐中进行培养，培养条件：整个发酵过程中保持温度32℃，空气比控制在1.4vvm，转速为300rpm，发酵过程中开启ph自动控制装置，利用盐酸或氨水控制发酵液ph值在7.0～7.2之间。当发酵液中残留还原糖在10g/l时，打开补料装置，将蔗糖补入发酵液中，除最后一次补料，其他补料时控制发酵液中蔗糖终浓度保持在30g/l左右，进行补料发酵。发酵72h，微生物多糖浓度达59.62g/l，蔗糖转化率为70.14％，多糖合成速率高达0.83g/l/h。(图7)

实例12：

此外，该菌及其所产多糖可以促进经济类作物(玉米、小麦、水稻、土豆、红薯、油菜、棉花、草莓等)生长、提高种子发芽率、果实增产和提早上市的作用。

最后，还需注意的是，以上列举仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110>常熟理工学院

<120>一株肠杆菌株及其在制备微生物多糖中的应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>2

<211>1388

<212>dna

<213>肠杆菌lt1(kosakoniacowanii)

<400>2

acggtaacaggaagcagcttgctgcttcgctgacgagtggcggacgggtgagtaatgtct60

gggaaactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataacgt120

cgcaagaccaaagagggggaccttcgggcctcttgccatcagatgtgcccagatgggatt180

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