一种不易开伞的黄色金针菇菌种农金49及其分子标记鉴定方法与流程

文档序号：21817578发布日期：2020-08-11 21:30阅读：611来源：国知局

本发明属于金针菇技术领域，具体涉及一种不易开伞的黄色金针菇菌种‘农金49’及其分子标记鉴定方法。

背景技术：

金针菇（flammulinafiliformis）以其营养丰富、味美适口而为人们所熟悉，是我国实现工厂化栽培最早的食用菌，经过几十年的努力，其生产工艺实现了从玻璃瓶栽到聚丙烯袋栽，以及塑料瓶栽的发展。目前金针菇工厂化栽培以白色品种为主，近年来随着白色金针菇市场的饱和，竞争异常激烈，其价格一直处于较低迷状态，金针菇企业面临着巨大的压力。然而此时的黄色金针菇由于栽培量少，相对白色金针菇，则是一种珍贵的品种，黄色金针菇的价格至少比白色金针菇高出一倍，黄色品种显示出较大的商业价值。人们对金针菇商品性状的要求之一是子实体的菌盖要较小，但黄色金针菇的生长发育一般较白色金针菇快，其菌盖较易开伞从而影响其商品性状，因此选育一个不易开伞的黄色金针菇品种则可以弥补这一缺陷。

技术实现要素：

本发明的目的在于，针对现有技术的不足，提供了一种不易开伞的黄色金针菇菌种‘农金49’及其分子标记鉴定方法。

本发明提供的黄色金针菇‘农金49’菌株，其分类命名为：金针菇（flammulinafiliformis）农金49，该菌株已于2019年12月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏编号cctccno：m20191019。

本发明提供的黄色金针菇（flammulinafiliformis）‘农金49’，简称‘农金49’是以白色金针菇‘农金7号’和黄色金针菇‘g-20’为亲本进行杂交选育而成，其继承了两个亲本的优良性状。‘农金49’菌种稳定性好，浅黄色，商品外观优美，单根子实体间不易粘连，菌柄偏白、中等粗细，柄较长，菌盖浅黄色、不易开伞，产量高，每袋产量在440～490g，具有很好地开发应用前景。

金针菇‘农金49’的母种培养基为马铃薯葡萄糖培养基（pda）：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂条20g，水1000ml；培养条件为常规的金针菇培养，无特殊要求。

本发明还提供了所述金针菇‘农金49’菌株的分子标记鉴定方法，包括菌丝的培养与收集、基因组dna的提取、特异性片段pcr扩增、pcr产物的电泳检测与dna测序。

所述特异性片段pcr扩增是由6对引物分别对‘农金49’的dna进行pcr扩增，经电泳检测分别得到单一的标记片段，6对引物序列和用这6对引物分别扩增‘农金49’的dna得到的标记片段大小见表1；

表1特异标记扩增信息

所述pcr产物的电泳检测：经电泳检测，在一个泳道上只有一个片段出现，且片段大小与对应的引物相符（各引物对应的片段大小见表1），是金针菇（flammulinafiliformis）‘农金49’的标记。其中电泳条件为：取pcr产物5～10μl，与1μl上样缓冲液混匀，点样于1.2%的琼脂糖凝胶上，于0.5xtbe缓冲液中，5v/cm电压下电泳；所述上样缓冲液：0.1％溴酚蓝,40%蔗糖。

pcr扩增反应体系：1～1.5μl含量80~150ng的dna，12.5μlpremixtaq（带染料），1μl浓度为10μmol/l的正向引物,1μl浓度为10μmol/l的反向引物,9～9.5μlddh2o，总体积25μl；

pcr扩增反应程序：94℃预变性5min；98℃变性10sec，57℃退火30sec，72℃延伸x,35个循环;72℃延伸10min。其中引物f49p1、f49p3、f49p4的72℃延伸时间x为1min45sec；引物f49p2、f49p5、f49p6的72℃延伸时间x为1min10sec。

pcr扩增产物，经dna测序，引物f49p1产生一条1336bp的条带，其dna序列如seqidno.1所示；引物f49p2产生一条1076bp的条带，其dna序列如seqidno.2所示；引物f49p3产生一条1206bp的条带，其dna序列如seqidno.3所示；引物f49p4产生一条1621bp的条带，其dna序列如seqidno.4所示；引物f49p5产生一条1036bp的条带，其dna序列如seqidno.5所示；引物f49p6产生一条951bp的条带，其dna序列如seqidno.6所示；6个引物同时检测得到对应大小的dna标记条带，是金针菇（flammulinafiliformis）‘农金49’菌株的标记。

本发明具有以下优点：

1、金针菇‘农金49’含白色金针菇‘农金7号’和黄色金针菇两个亲本的基因，既具有‘农金7号’产量高的特点，又具有黄色金针菇出菇快、子实体黄色的特点，此外还有两亲本没有特点：菌盖不易开伞。‘农金49’与黄色金针菇‘杂19’（原三明真菌研究所通过杂交选育的黄色金针菇品种）相比最大的优点就是菌盖不易开伞、菌柄长、整齐度好；另外与目前工厂化栽培的白色品种相比，‘农金49’最大的优点菌盖较小，即不易开伞，菌柄长、不粘连；此外，‘农金49’既能采用聚丙烯塑料袋栽的模式，又能适应瓶栽的模式，因此具有很好地开发应用前景。

2、金针菇‘农金49’的dna鉴定方法具有真实可靠，一目了然的特点，比经典的形态鉴定误差小，不受环境条件的影响，判断更直观。

3、专一性强：本发明在对金针菇基因测序、生物信息分析的基础上，设计金针菇‘农金49’的特异识别性的标记片段。

4、金针菇‘农金49’的dna鉴定方法操作简单，检测时间短，经典的形态鉴定需要检测的指标多，时间长且需要综合起来分析。

附图说明

图1为金针菇‘农金49’子实体形态图。a为金针菇‘农金49’袋栽子实体形态；b为金针菇‘杂19’袋栽子实体形态；c为金针菇‘农金49’瓶栽子实体形态；d为金针菇‘t-011’瓶栽子实体形态。

图2为金针菇‘农金49’特异性识别标记电泳图；其中，1～3泳道的引物为f49p1，标记片段大小为1336bp；4～6泳道的引物为f49p2，标记片段大小为1076bp；7～9泳道的引物为f49p3，标记片段大小为1206bp；10～12泳道的引物为f49p4，标记片段大小为1621bp；13～15泳道的引物为f49p5，标记片段大小为1036bp；16～18泳道的引物为f49p6，标记片段大小为951bp，是金针菇‘农金49’的标志；当6对引物都对‘农金49’基因组检测时都产生对应大小的标志片段，则为金针菇‘农金49’，m表示分量为dl2000的dnamark。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。

实施例1：金针菇‘农金49’的选育

（1）对黄色金针菇‘g-20’进行出菇实验，收集其孢子，并进行孢子萌发实验，获得单孢菌株，并选择生长较快的单孢菌株30个；

（2）用‘农金7号’与黄色金针菇‘g-20’选择的30个单孢菌株进行杂交，配对30个组合，获得25个杂交子；

（3）对获得的25个杂交子进行菌丝稳定性观察，选择菌丝生长速度稳定、且较快的杂交子18个进行出菇实验，观察到杂交编号为‘49’的杂交子菌盖较小、出菇整齐、产量较高；

（4）此后，金针菇杂交子‘49’经多次出菇，性状稳定，周期短，抗逆性较好、出菇时整齐度好、柄长、菌盖不易开伞，整体外观好，产量较高，将金针菇杂交子‘49’命名为‘农金49’。

金针菇‘农金49’已于2019年12月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:武汉武汉大学，保藏编号cctccno：m20191019。实施例2：金针菇‘农金49’（cctccno：m20191019）的工厂化栽培，包括以下步骤：

（1）金针菇‘农金49’的袋栽

将金针菇‘农金49’、黄色金针菇‘杂19’菌株在pda培养基上活化2次，转接于金针菇原种常规培养基，23℃恒温培养至长满原种瓶。待原种长好后，即进行袋栽，金针菇袋栽的选料、各种原料配方、装袋、消毒灭菌和出菇管理均按黄年来等主编的中国食用菌-金针菇（黄年来，林志彬，陈国梁，主编．中国食药用菌学．上海：上海科技文献出版社．2010，937～978.）中袋栽的方法。

子实体性状表现，‘农金49’的栽培周期与‘杂19’相当，‘农金49’（图1a）的菌盖不易开伞、菌柄长，而‘杂19’（图1b）菌盖较易开伞、菌柄较短，其它性状无显著差异；在产量上，‘农金49’的单袋产量比‘杂19’高50～90克。

金针菇‘杂19’购买于市场。

（2）金针菇‘农金49’的瓶栽

制作黄色金针菇‘农金49’、白色金针菇‘t-011’的液体菌种，其栽培选料、各种原料配方、装袋、消毒灭菌和出菇管理均按黄年来等主编的中国食用菌-金针菇（黄年来，林志彬，陈国梁，主编．中国食药用菌学．上海：上海科技文献出版社．2010，937～978.）中瓶栽的方法。

子实体性状表现，‘农金49’的栽培周期与‘t-011’相当，‘农金49’（图1c）的菌盖不易开伞、菌柄长，而‘t-011’（图1d）菌盖较大、菌柄较短，其它性状无显著差异。

实施例3：金针菇‘农金49’的分子标记鉴定方法，包括以下步骤：

（1）菌丝培养和收集

1、将金针菇‘农金49’、‘农金7号’、‘g-20’转接含100mlpda液体培养基的250ml广口三角瓶中；

2、放置在25℃摇床上，转速90～130r/min培养5～8d；

3、用纱布过滤培养好的菌丝，蒸馏水冲洗，滤纸吸干；

4、称取0.5～1.3g菌丝，用滤纸包好，保存于-20℃备用。

（2）ctab法提取基因组dna

提取金针菇‘农金49’、黄色金针菇等菌株基因组dna提取的具体操作步骤，按照陶永新等的方法（taoy,xieb,yangz,etal.identificationandexpressionanalysisofanewglycosidehydrolasefamily55exo-β-1,3-glucanase-encodinggeneinvolvariellavolvaceasuggestsaroleinfruitingbodydevelopment[j].gene,2013,527(1):154-160.）进行，提取的dna放-20℃保存备用。

（3）金针菇‘农金49’特异性标记引物设计

将金针菇‘农金49’、‘农金7号’、‘g-20’等菌株的基因组dna送往北京诺禾致源科技股份有限公司进行全基因组的二代测序，测序数据量为3～4g的cleandata，对这些基因组数据进行生物信息分析，寻找杂交子‘农金49’特有的基因，并进行引物设计，引物信息如下：

引物f49p1正向序列为5’-agagcttcttgccggaacag-3’，f49p1反向序列为5’-gagctcacctcacggatatg-3’，此引物对‘农金49’的基因组能扩增出约1336bp的标记片段；

引物f49p2正向序列为5’-tccagtgtcgcgtctgaatc-3’，f49p2反向序列为5’-tgggccaggcaatccacatc-3’，此引物对‘农金49’的基因组能扩增出约1076bp的标记片段；

引物f49p3正向序列为5’-gtgcctagcggcaacagaag-3’，f49p3反向序列为5’-tgtctcgccataatcaccag-3’，此引物对‘农金49’的基因组能扩增出约1206bp的标记片段；

引物f49p4正向序列为5’-ggccggctcaacctatttac-3’，f49p4反向序列为5’-gccgcccacattatgggtag-3’，此引物对‘农金49’的基因组能扩增出约1621bp的标记片段；

引物f49p5正向序列为5’-cgattgtgcgcatcttaacg-3’，f49p5反向序列为5’-ggattccgcgccgatattcc-3’，此引物对‘农金49’的基因组能扩增出约1036bp的标记片段；

引物f49p6正向序列为5’-ccaggctgcgcacttgtatc-3’，f49p6反向序列为5’-agcgagaccttctgtcattc-3’，此引物对‘农金49’的基因组能扩增出约951bp的标记片段。

（4）特异性片段pcr扩增

pcr扩增反应体系：1.2μl含量100ng的dna，12.5μlpremixtaq（带染料），1μl浓度为10μmol/l的正向引物,1μl浓度为10μmol/l的反向引物，9.3μlddh2o；

（5）pcr产物的电泳检测

取pcr产物5μl，点样于1.2%的琼脂糖凝胶上，同时使用dl2000的dnamark作为片段大小的参照，于0.5×tbe缓冲液中，5v/cm电压下电泳30—40min，电泳结束后，然后在凝胶成像仪上照相。电泳图如图2所示，引物f49p1、1～3泳道显示的分子量为1336bp，引物f49p2、4～6泳道显示的分子量为1076bp，引物f49p3、7～9泳道显示的分子量为1206bp，引物f49p4、10～12泳道显示的分子量为1621bp，引物f49p5、13～15泳道显示的分子量为1036bp，引物f49p6、16～18泳道显示的分子量为951bp的dna标记条带，是金针菇‘农金49’的标志；m表示分量为dl2000的dnamark。

（6）特异性片段序列测序

将引物f49p1～f49p6扩增‘农金49’得到的单一片段连接到pmd18-tvector进行克隆，送往杭州有康生物科技有限公司进行测序，分别得到单一片段的dna序列如下：

使用引物f49p1扩增‘农金49’得到1336bp标记片段的dna序列如seqidno.1所示；

使用引物f49p2扩增‘农金49’得到1076bp标记片段的dna序列如seqidno.2所示；

使用引物f49p3扩增‘农金49’得到1206bp标记片段的dna序列如seqidno.3所示；

使用引物f49p4扩增‘农金49’得到1621bp标记片段的dna序列如seqidno.4所示；

使用引物f49p5扩增‘农金49’得到1036bp标记片段的dna序列如seqidno.5所示；

使用引物f49p6扩增‘农金49’得到951bp标记片段的dna序列如seqidno.5所示。

六、试剂与仪器

ctab抽提液：100mmol/ltris-hcl，2.0%ctab，20mmol/ledta，1.4mol/lnacl，ph8.0;

ctab沉淀液：50mmol/ltris-hcl，1.0%ctab，10mmol/ledta，ph8.0;

ctab/nacl：0.7mol/lnacl，10%ctab；

氯仿异戊醇：体积比氯仿比异戊醇为24比1；

te缓冲液：10mmol/ltrishcl，1mmol/ledta；

0.5×tbe：44.5mmol/ltris,50mmol/lhbo3、1mmol/ledta;

premixtaq(extaqversion2.0)带染料的和pcr扩增试剂，均购自大连宝生物公司。

主要仪器：

sw-cj-1fb型单人水平垂直两用净化工作台：苏州净化设备有限公司

灭菌锅：上海三申

hyg-a全温摇瓶柜：太仓市实验室

冷冻离心机：sigma3k30

pcr扩增仪：eppendorfag22331hamburg

掌型离心机：江苏海门市麒麟医用仪器厂lx-100手掌型离心机

sdc-6节能型智能恒温槽：宁波新芝生物科技股份有限公司

凝胶成像系统：tanon-2008。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

序列表

<110>福建农林大学

<120>一种不易开伞的黄色金针菇菌种农金49及其分子标记鉴定方法

<130>18

<160>18

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna