一种生物防治型菌株TF-08、培养方法及其应用与流程

本发明涉及微生物和生物防治领域，尤其涉及一种生物防治型菌株tf-08、培养方法及其应用。
背景技术：
：近几十年来，化肥和农药的使用对于保障粮食增产稳产起到了巨大的推动作用，但由于化学化肥、农药的长期不合理使用，严重威胁了环境和农产品安全。因此，寻找经济高效、与环境相容性好的农业新方法、新技术是解决当前环境污染、食品安全危机的迫切需求。而充分利用和发挥生态系统中微生物对农作物的促生和抗病虫功能，对提高农作物的生产能力，保护和改善农业生态环境，促进农业的可持续发展具有重要的生态和经济意义。目前，控制植物病害的一般方法是使用化学农药，然而，长期使用化学农药会导致病原菌产生抗药性而降低化学药剂的防病效果，同时长期使用化学药剂会造成农药残留超标和环境污染，同时也带来了耐药性、抗药性、杀灭有益微生物、污染环境、蔬果残留药物等方面负面影响。生物防治是控制植物病害的一种新途径，它主要是利用生防菌与植物病原微生物之间的拮抗作用，抑制植物病原菌的生长。尚未发现黄蓝状菌株tf-08对试验植株、叶片、花、果实有药害现象，对植物的生长、生产和食用是安全可靠的。技术实现要素：针对现有技术中化学农药防治所存在的环境污染和病害发生严重等问题，本发明的目的是提供一种生物防治型菌株tf-08、培养方法及其应用。本发明所述黄色篮状菌tf-08的10倍稀释液防治高于或相当于化学药剂的防治。在草莓苗、黄瓜苗、小麦苗等植物上tf-08菌株定殖力强，有利于植物苗的存活率，可以减少化学农药的用量及其在土壤中的累积，防止环境污染，有利于提高作物的质量和产量，经济效益和社会效益十分显著。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种生物防治型菌株tf-08，黄蓝状菌株(talaromycesflavus)tf-08，于2020年3月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为：gdmccno：60983。所述菌株的形状特征：可产生分生孢子和子囊孢子，分生孢子梗呈现扫帚状，2轮分枝,梗基2～4个，轮生，其上轮生2～6个瓶梗，顶端着生长链状串生的分生孢子,分生孢子呈现椭圆形，大小3～3.5μm*2～3μm；子囊壳呈球形，大小为237～352μm；子囊球形，大小为8.1～9.6μm，内含8个子囊孢子。一种生物防治型菌株tf-08的培养方法，将所述tf-08菌株接种于培养基，15-35℃培养3-10天。作为优选，所述培养基选自马铃薯葡萄糖琼脂培养基pda、马铃薯蔗糖琼脂培养基psa、查氏培养基ca、燕麦片琼脂培养基oa、淀粉琼脂培养基sa或酵母膏葡萄糖琼脂培养基yda中的一种。作为优选，对黄蓝状菌株(talaromycesflavus)tf-08进行its序列测定以及菌株β-tubulin序列测定。作为优选，its序列测定：以菌株的dna为模板，its1为：5′-tccgtaggtgaacctgcgg-3′(seqidno：1)和its4为：5′-tcctccgcttattgatatgc-3′(seqidno：2)，进行its-pcr扩增，扩增产物用试剂盒进行回收，将回收片段与pgemteasy载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆送外协测序，所得序列在genbank中进行blast比对和分析；菌株β-tubulin序列测定：以菌株的dna为模板，采用真菌通用引物t1：5′-aacatgcgtgagattgtaagt-3′(seqidno：3)和t224：5′-gagggaacgacggagaaggtgg-3′(seqidno：4)对tf-08基因组进行pcr扩增，扩增产物用试剂盒进行回收，将回收片段与pgemteasy载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆送外协测序，所得序列在genbank中进行blast比对和分析。一种生物防治型菌株tf-08的应用，用于植物病害的防治。作为优选，用于草莓炭疽病的防治。作为优选，用于黄瓜白粉病的防治。作为优选，用于小麦赤霉病的防治。本发明的有益效果是：本发明提供的生物防治型菌株tf-08能够有效抑制水稻立枯丝核菌、大麦赤霉病菌、草莓炭疽病菌、莴苣菌核病菌、甜瓜蔓枯病菌等病菌的生长，可以有效防止植物病害，并且可以减少化学农药的用量和其在土壤中的累积，对于防止环境污染极为重要，同时也有利于提高草莓、黄瓜、小麦等作物的质量与产量，经济效益和社会效益十分显著。附图说明图1是菌株tf-08的生长状态图。图2是菌株tf-08菌丝缠绕在草莓炭疽菌的菌丝上。图3是菌株tf-08pcambia1300::hph载体构建图。图4是菌株tf-08pcambia1300::hph：：gfp载体构建图。图5是菌株tf-08pcambia1300::hph：：rfp载体构建图。图6是菌株tf-08对不同病菌的抑制率。图7是不同温度下菌株tf-08对两种病菌的抑制率影响。图8是光照对菌株tf-08生长的影响。图9是菌株tf-08的系统发育树。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。本发明所用的质粒与菌株，包括p1300hph(pcambia1300::hph)、pbin、puc-rfp、大肠杆菌(escherichiacoli)、dhsa菌株、农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)菌株agl1感受态、稻瘟病菌菌株(标准菌株guy11)、草莓炭疽病菌、水稻立枯丝核菌(rhizoctoniasolamikihn)、水稻稻瘟病菌、大麦赤霉病菌、草莓炭疽病菌、草莓灰霉病菌、茄子棒孢病菌、莴苣菌核病菌、油菜菌核病菌、甜瓜蔓枯病菌、甜瓜蔓割病菌、茭白胡麻斑病菌、番茄早疫病菌和黄瓜枯萎病菌等，保存在浙江省农业科学院实验室存储库中。本发明中tf-08菌液在应用时，按10克tf-08菌株，100克水来配制tf-08菌液。本发明中的tf-08发酵液是通过常规的工艺制得的。实施例1本发明提供了一种黄蓝状菌株(talaromycesflavus)tf-08，于2020年3月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为：gdmccno：60983。(1)供试质粒及菌株：先准备好相关质粒和菌株，包括p1300hph(pcambia1300::hph)、pbin、puc-rfp、大肠杆菌(escherichiacoli)、dhsa菌株、农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)菌株agl1感受态、稻瘟病菌菌株(标准菌株guy11)、草莓炭疽病菌、水稻立枯丝核菌(rhizoctoniasolamikihn)、水稻稻瘟病菌、大麦赤霉病菌、草莓炭疽病菌、草莓灰霉病菌、茄子棒孢病菌、莴苣菌核病菌、油菜菌核病菌、甜瓜蔓枯病菌、甜瓜蔓割病菌、茭白胡麻斑病菌、番茄早疫病菌和黄瓜枯萎病菌等。(2)菌液培养基配方：可以选用以下配方之一。①马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda):马铃薯150g切片，加水煮沸，约半小时后纱布过滤得滤液，加葡萄糖10g，琼脂10g，加水定容至1l。②马铃薯蔗糖琼脂培养基(psa):马铃薯150g切片，加水煮沸，约半小时后纱布过滤得滤液，加蔗糖10g，琼脂10g，加水定容至1l。③查氏培养基(ca):nano32g，khpo41g,kcl0.5g，mgso40.5g，feso40.01g，蔗糖30g，琼脂10g，加水定容至1l。④燕麦片琼脂培养基(oa):燕麦片30g，加水煮沸，约半小时后纱布过滤得滤液，加10g琼脂，加水定容至1l；⑤淀粉琼脂培养基(sa):可溶性淀粉20g,kno31g,khpo40.5g,nacl0.5g，mgso40.5g,feso40.01g，琼脂10g，加水定容至1l。⑥酵母膏葡萄糖琼脂培养基(yda):酵母膏10g，葡萄糖10g,琼脂10g,加水定容至1l。以上培养基均121℃高压灭菌30min。在载玻片上覆盖一层水琼脂，待水琼脂凝固后，可从草莓炭疽病标本中分离获取菌株tf-08。在载玻片两端分别接种tf-08菌株和草莓炭疽菌。将该载玻片置于铺有湿润滤纸的培养皿中，于28℃黑暗培养。待培养3天后两种菌丝在载玻片上相遇时进行显微观察。第二天开始每日观察菌落生长的形态，10天后观察孢子的形态。(参见图1)。(3)生物学特性1)菌株its序列测定。采用its1为：5′-tccgtaggtgaacctgcgg-3′(seqidno：1)和its4为：5′-tcctccgcttattgatatgc-3′(seqidno：2)对tf-08基因组进行its-pcr扩增。pcr反应条件为:94℃5min；94℃30s,58℃30s，72℃90s，35个循环；72℃10min。pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳，切取含目的条带的凝胶，用试剂盒(名称)进行回收，将回收片段与pgemteasy载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆送外协测序，所得序列在genbank中进行blast比对和分析。2)菌株β-tubulin序列测定。采用真菌通用引物t1：5′-aacatgcgtgagattgtaagt-3′(seqidno：3)和t224：5′-gagggaacgacggagaaggtgg-3′(seqidno：4)对tf-08基因组进行pcr扩增。(4)抑菌谱见下表1：表1.抑菌谱病原菌生长抑制率/％水稻立枯丝核菌61.58水稻稻瘟病菌25.66大麦赤霉病菌68.4草莓炭疽病菌71.75草莓灰霉病菌52.93茄子棒孢病菌38.11莴苣菌核病菌81.83油菜菌核病菌24.29甜瓜蔓枯病菌66.67甜瓜蔓割病菌57.59茭白胡麻斑病菌55.52番茄早疫病菌48.76(5)菌种鉴定1)形状特征鉴定。在28℃黑暗条件下培养菌株tf-08，在pda平板上观察，其菌落形状呈现圆形，等直径辐射，呈平铺地毯状生长，开始为柠檬黄色，而后颜色初步加深，并且表面散生出黄色或橙色的小点状子囊壳，可产生色素，渗透入培养基内，菌丝不发达。可产生分生孢子和子囊孢子，分生孢子梗呈现扫帚状，2轮分枝,梗基2～4个，轮生，其上轮生2～6个瓶梗，顶端着生长链状串生的分生孢子,分生孢子呈现椭圆形，大小3～3.5μm*2～3μm。子囊壳呈球形，大小为237～352μm，挑取子囊壳进行压片显微观察，可看到散落的子囊和子囊孢子；子囊球形，大小为8.1～9.6μm，内含8个子囊孢子。根据菌落形态特征，初步鉴定ft-06菌株为青霉属(penicillium)。2)its测序鉴定。以its1和its4为引，扩展500～600bp的基因片段，将该片段进行dna测定，生成系统发育树，its序列和黄蓝状菌(talaromycesflavus)的相应序列同源性高达100％，见图9。3)β-tubulin测序鉴定以t1和t224为引，在dna基因组中扩增出一条900～1000bp的片段。经回收测序，将该测序结果在genbank中进行blast比对，结果表明β-tubulin序列和黄蓝状菌(talaromycesflavus)的相应序列同源性高达98％。可以鉴定菌株tf-08为黄蓝状菌(talaromycesflavus)。由tf-08的生物学特性表明，tf-08在pda培养基和psa培养基上菌落生长良好，在查氏培养基和酵母膏葡萄糖琼脂培养基上产孢量最大；tf-08菌株在15～35℃温度范围内均可生长及产孢，菌落生长的最适温度为28～35℃，最适产孢温度为25～28℃，tf-08菌株的生长及产孢都较为适宜；偏酸性环境有利于tf-08菌株的生长，光照条件利于tf-08生长及产孢，参见图8。tf-08菌株对环境的强适应性，使它能够在各种生态环境下存活并繁殖。实施例2tf-08菌株的生防机制(1)转换载体构建。重组载体pgfp是以pcambia1300::hph(在pcambia1300载体中插入共进行30个循环；hph基因)为骨架，插入克隆自pbin质粒的ptrp-gfp和ttrp基因。重组载体prfp是在以构建成功的pgfp的基础上，以克隆自puc-rfp质粒的rfp基因替换gfp基因所构建。(参见图3、图4与图5)(2)农杆菌转化。泳道1-6是以转化pgfp后的农杆菌为模板，以gfp-pv&egfp-bm为引物进行pcr扩增，目的条带为gfp基因片段，长度应为720bp，所扩增片段与目的片段一致，因此经pcr验证正确，重组的pgfp质粒已成功导入农杆菌中。同前,泳道7-17是以转化prfp后的农杆菌为模板,以rfp-pv&rfp-bm为引物进行pcr扩增，目的条带为rfp基因片段，长度应为700bp,所扩增片段与目的片段一致。(3)草莓炭疽病菌潮霉素敏感性测定。参见图2，重组载体pgfp和prfp以hph为筛选标记，因此在进行真菌转化前需先对tf-08菌株和草莓炭疽病菌的潮霉素敏感性进行测定。结果表明，tf-08菌株的菌丝生长在潮霉素浓度为300μg/ml时受到明显的抑制，而草莓炭疽病菌对潮霉素敏感，20μg/ml的潮霉素就能明显抑制草莓炭疽病菌菌丝的生长，当潮霉素的浓度达到50μg/ml时，草莓炭疽病菌菌丝的生长完全受到抑制。由此结果，确定tf-08菌株的潮霉素筛选浓度为300μg/ml，草莓炭疽病菌的潮霉素筛选浓度为50μg/ml。(3)tf-08发酵液对多种病原菌的抑制效果。采用常规工艺制备菌株tf-08发酵液，参见图6，tf-08的发酵液对这10种病原菌均有一定的抑制率，最高抑制效果接近于50％。对tf-08发酵液进行4层擦镜纸过滤和微滤膜微过滤等操作,保证最终的发酵液中除tf-08的菌丝体和孢子，只留有tf-08菌株生长过程中产生的代谢产物，除tf-08菌株本身对病原菌菌丝生长的影响。tf-08可分泌具有抑菌效果的代谢产物，并且该代谢产物对供试的10种病原菌均具有一定效果的抑制作用，具广谱抗菌性，有广阔的应用前景。(4)tf-08发酵液的热稳定性。参见图7，tf-08发酵液在经40～70℃处理30min后，对莴苣菌核病菌的抑制效果明显随温度升高而减弱，在经40-60℃处理30min后，对茭白胡麻斑病菌的抑制效果随温度升高而减弱，在70℃以上温度处理30min后，tf-08发酵液对这两种病原菌的抑制效果没有明显变化。(5)tf-08菌珠的抑制机理。分泌的代谢产物能够作用于病原菌，致使其细胞病变并最终抑制病原菌的生长，其活性物质是葡萄糖氧化酶,它能分解葡萄糖产生葡萄糖酸和过氧化氢，而过氧化氢对病原菌具有杀伤作用；tf-08菌珠能够重寄生病原菌，菌丝能够缠绕或穿透病原菌菌丝，吸收病原菌的营养用于自身的生长，从而拮抗病原菌的生长，与其重寄生作用有关的分子机制主要是几丁质酶等的产生。tf-08对草莓炭疽菌的抑制作用主要是通过重寄生机制来实现。(6)荧光载体标记方法。两个荧光表达载体pgfp和prfp，分别用于标记tf-08和草莓炭疽病菌，拟利用荧光标记研究tf-08菌株对草莓炭疽病菌的生防机制。atmt转化得到的转化子经荧光显微观察发现，红色荧光在草莓炭疽病菌中表达微弱，tf-08菌株因其本底荧光较强，较难观察到绿色荧光的表达。通过将pgfp载体转化到稻瘟病菌中，对经过验证的转化子进行荧光显微观察，发现绿色荧光在稻瘟病菌中表达较强,可以明显观察到菌丝中的绿色荧光，说明所构建的载体pgfp和prfp均可在真菌中表达荧光，但是因在构建载体的过程中采用的启动子构巢曲霉启动子ptrpc在tf-08菌株和草莓炭疽病菌中表达不强的原因，导致荧光表达弱，可考虑更换启动子，进行下一步研究工作。实施例3tf-08菌株的应用案例(1)草莓炭疽病的防治。通过组织分离的方法测定tf-08菌株在草莓苗上的定殖力,在草莓的叶片、叶柄、匍匐茎上都分离到了黄蓝状菌,且菌体显微镜检形态与tf-08一致,表明该菌在草莓上具有较好的定殖力。接种不同浓度菌液对菌株的定殖量有一定影响,其中10倍稀释菌液的定殖量高于100倍稀释菌液。另外,在草莓的不同器官上的定殖力也有差异,其中匍匐茎上的定殖力最强,10倍稀释菌液和100倍稀释菌液的定殖力都达到了100％,而匍匐茎正是草莓繁育子苗的关键器官,这一定殖特点更有利于菌株tf-08对草莓苗的防病效果。在草莓繁苗期田间试验中,黄蓝状菌菌株tf-08对草莓炭疽病表现出了较好的防治效果。10倍稀释菌液和100倍稀释菌液的防治分别达到了78.3％和71.3％,而同期化学药剂10％苯醚甲环唑水分散粒剂的防治是63.9％。结果见表2。表2、对草莓炭疽病防治对比表实施例4tf-08菌株的应用案例黄瓜白粉病的防治。tf-08稀释10倍菌液在施药后3d达到最高84.89％，在每个调查时间点均高于三唑酮，且在施药后11d的5％水平上tf-08稀释10倍菌液防治效果显著优于三唑酮。随着施药后时间延长，各组治疗效果也下降，下降趋势与保护试验一致。保护试验与治疗试验相比，除施药后7dtf-08各梯度孢子液和发酵液防治外，在其余各组调查数据中发现保护效果均优于治疗效果。通过组织分离的方法对菌株tf-08在在黄瓜的叶片、叶柄上都可分离到菌株tf-08，且菌体形态与接种前一致，表明该菌在黄瓜上具有较好的定殖力。在发酵液及农药处理中，分离不出tf-08。黄瓜的不同器官对菌株的定殖量有一定影响，相同处理的叶柄定殖率高于叶片；在叶柄上的定殖率仅为85％，其余孢子液及菌液梯度定殖率均为100％；接种不同浓度菌液和孢子液在叶片上定殖率较低且不同梯度存在差异，tf-08菌液10倍稀释液在叶片上的定殖率最高为40％。随着菌液浓度下降，定殖率也降低；孢子液浓度为1×107个·ml。1时定殖率为25％，但1×106与1×105个·ml定殖率均为15％。见表3。表3对黄瓜白粉病的防治效果实施例5tf-08菌株的应用案例小麦赤霉病的防治。培养4d的结果显示，稀释10倍后的tf-08菌液对禾谷镰刀菌丝生长抑制率为40.1％，表明tf-08菌液对禾谷镰刀菌具有较强的抑制作用。tf-08菌液对镰刀菌分生孢子萌发的影响平板抑制试验表明，与等量tf-08菌液混合后，禾谷镰刀菌分生孢子不能萌发，抑制率达100％。凹玻片抑制试验镜检显示，与等量tf-08菌液混合的禾谷镰刀菌分生孢子胞壁和隔膜变厚，两头变钝，不能正常萌发，与水混合的禾谷镰刀菌分生孢子能正常萌发伸长产生菌丝。表明tf-08对禾谷镰刀菌分生孢子的萌发具有强烈的抑制作用。随着培养时间的增加，tf-08菌液的抑菌效果增强，到第14天时达到峰值。随着培养时间延长，tf-08菌液的抑菌效果逐步减弱，到第28天后，抑制率曲线趋于平缓。由此推测，tf-08菌液中，具有抑菌活性的组分不止一种，既有易于降解的活性组分，也有性质较稳定的组分。见表4。表4、对小麦赤霉病的防治效果以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。序列表<110>浙江省农业科学院<120>一种生物防治型菌株tf-08、培养方法及其应用<141>2020-04-28<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tccgtaggtgaacctgcgg19<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tcctccgcttattgatatgc20<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3aacatgcgtgagattgtaagt21<210>4<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gagggaacgacggagaaggtgg22当前第1页12