一株生产豆豉的毛霉及其应用的制作方法

本发明属于酿造发酵领域，具体涉及一种生产豆豉的毛霉及其应用。
背景技术：
：豆豉是我国传统的发酵豆制品。其中，毛霉型豆豉色黑、油润有光泽，成品油润化渣、散粒成型，是各类豆豉中的佳品，深受人们的喜爱。豆豉发酵生产过程中，在以豆豉毛霉为主的微生物及酶的作用下，对大豆原料中的大分子有机物分解和重组，使得豆豉含有丰富的蛋白质、可溶性糖、可溶性氮、维生素a、维生素b等营养成分，同时还含有大豆异黄酮、乙酰胆碱磷脂酶抑制剂、大豆多肽、γ-亚麻酸、活性酶、大豆低聚糖等多种功能因子，具有抗氧化、降血压、抗菌等生理功能。但是，就毛霉型豆豉而言，其规模型的工业化生产技术还相对落后，主要包括菌种的不耐高温(霉菌的最适生长温度为25～28℃)导致的生产周期受限和生产成本高；菌株主要组成的酶系活力低，如蛋白酶、淀粉酶、肽酶、纤维素酶等，导致的氨基酸生成率相对较低、鲜味不足；发酵盐分含量高导致的发酵周期长；工业化的技术改进导致的传统豉香、酱香、醇香、酯香风味弱化。因此，筛选一株耐高温、产蛋白酶、淀粉酶、肽酶等主要酶系能力强、氨基酸生成率高、香气浓郁且性能稳定的豆豉新菌种是非常重要的。技术实现要素：本发明的目的是提供一种新的毛霉菌株，以及一种毛霉型豆豉的发酵方法。本发明的技术方案如下：一株总状毛霉(mucorracemosus)菌株，所述菌株于2020年03月16日保藏于位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏号为cgmccno.19279。一种豆豉生产方法，该方法以前述毛霉为发酵菌株生产豆豉。如前述的豆豉生产方法，包括如下步骤：1)泡发并蒸煮大豆，使大豆变熟；2)大豆冷却后接种权利要求1所述毛霉菌株，通风环境静置32～38h，得豆曲；3)豆曲中加入盐浓度4％～8％(g/ml)、酒精含量为3％～7％(ml/ml)的食盐水，食盐水与豆曲用量比为(0.7～0.9):1(ml/g)；4)分3个阶段发酵：阶段i：第0～10天，温度42～45℃发酵；阶段ii：第10～30天，接种球拟酵母和鲁氏酵母，温度30～32℃发酵；阶段iii：第30～50天，温度20-25℃发酵。如前述的豆豉生产方法，步骤2)制曲时间为32～38小时。如前述的豆豉生产方法，步骤3)的盐浓度为6％(g/ml)。如前述的豆豉生产方法，步骤3)的酒精含量为5％(ml/ml)。如前述的豆豉生产方法，步骤3)的食盐水与豆曲用量比为0.8:1(ml/g)。如前述的豆豉生产方法，步骤2)中按0.3％～0.5％的质量比接种毛霉菌株。如前述的豆豉生产方法，步骤4)的阶段ii中每10g豆曲接种0.2～0.4ml的球拟酵母和鲁氏酵母混合培养液，所述混合培养液中鲁氏酵母密度为(2.0～2.5)×108个/ml，球拟酵母密度为(1.0～1.5)×108个/ml。前述方法制备得到的豆豉。本发明的有益效果如下：⑴本发明得到的豆豉毛霉菌株，属于中温型，最适生长温度为33-37℃。用该菌种发酵豆豉克服了传统毛霉不耐高温的问题，能够全年生产，提高工厂设备利用率以及降低成本。⑵本发明得到的豆豉毛霉菌株产蛋白酶、淀粉酶、肽酶、纤维素酶的能力强，氨基酸生成率较高，而且经过10代以上的传代仍能保持稳定的遗传特性，未发生退化现象。⑶通过本发明得到的豆豉毛霉进行发酵试验，能够赋予产品浓郁的酱香、豉香、鲜香，使得产品口感醇厚，滋味鲜美。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明图1：豆豉感官品鉴雷达图；图2：豆豉毛霉菌丝在pda培养基平板上的菌落形态图；图3：豆豉毛霉菌种的电镜扫描图。具体实施方式实施例1本发明的毛霉菌株的制备1.方法1.1菌株的活化和诱变筛选将原始毛霉菌株接种于新的马铃薯葡萄糖琼脂试管斜面，进行传代活化。将活化后的菌株进行纯培养，制备成孢子悬浮液，对所述悬浮液进行紫外诱变操作，紫外诱变操作时间为5-10min。诱变完成后，将孢子悬浮液均匀涂布于酪蛋白平板培养基上，30℃培养32-36h。以原始毛霉菌株为对照菌株，选取单菌落透明圈直径和菌落直接比值最大的菌株为目标菌株。1.2菌株的耐高温驯化及遗传稳定性分析将初筛得到的目标菌株制成单孢子悬浮液，涂布于马铃薯葡萄糖培养基平板上，置于33-37℃恒温培养箱内，进行高温驯化培养操作。将培养基上生长速度快、菌丝健壮、菌落大而饱满的单个菌落移接斜面，观察其生长情况。再将目标菌株进行连续10次的转接传代培养，取斜面培养菌种制备成二级种子，分别测定其产酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、肽酶以及淀粉酶的能力，本发明最终以主要代表酶类即中性蛋白酶的活力来评估目标菌株的产酶稳定性。制备二级种子的培养基为麸皮培养基，麸皮经润水后进行加压蒸煮，压力0.18-0.20mpa，时间5min，麸皮含水量为48-50％。中性蛋白酶酶活力的测定方法如下：称取研磨均匀的成曲样品5g于烧杯中，加入事先40℃预热的蒸馏水100ml，置于40℃水浴锅中水浴1h，水浴期间要间断搅拌样品。水解结束后用脱脂棉过滤入200ml的容量瓶中，用ph7.20磷酸盐缓冲液反复冲洗烧杯、脱脂棉，定容至刻度。取15×100mm试管3支，编号1、2、3，每管内加入样品稀释液1ml，置于40℃水浴中预热2min，再各自加入经同样预热的酪蛋白1ml，精确保温10min，时间到后，立即再各加入0.4mol三氯乙酸2ml，以终止反应，继续置于水浴锅中保温20min，使残余蛋白质沉淀后过滤，然后另取15×100mm试管3支，编号1、2、3，每管内加入滤液1ml，再加入0.4mol碳酸钠5ml，已稀释的福林试剂1ml摇匀，40℃保温发色20min后在波长为660nm条件下进行光密度(od)测定。空白试管也取3支，编号(1)、(2)、(3)，测定方法同上，唯在加酪蛋白之前先加0.4mol三氯乙酸2ml，使酶失活，再加入酪蛋白。1.3目标菌株的感官品鉴和理化指标检测将生理性能稳定的目标菌株进行豆豉发酵小试，具体操作如下：将大豆用水泡发(本例中，室温泡豆8-10h)，在0.20mpa，121℃条件下蒸煮20-25min，冷却后按照0.3％-0.5％质量比接种目标菌株，在培养箱内进行通风制曲，制曲时间为34-38h。将豆曲置于发酵桶内，并加入盐浓度为5％-7％(g/ml)、酒精含量为3％-5％(ml/ml)的食盐水，盐水加入体积为原料用质量的0.8倍(ml/g)。发酵前期(0-10天)温度控制在42-45℃，发酵中期(第10天-第30天)温度控制在30-32℃，并加入体积质量比(其中曲料以质量计)为2％-4％的球拟酵母和鲁氏酵母混合培养物(所述混合培养物中鲁氏酵母数(2～2.5)×108个/ml；球拟酵母数(1.0～1.5)×108个/ml)，发酵后期(第30天-第50天)温度控制在20-25℃。发酵结束后分别对豆豉的感官进行品鉴和理化指标(总酸、氨基酸态氮、食盐)进行检测，以豆豉生产的原始菌株为对照菌株。感官品鉴评分标准如表1。表1感官品鉴评分标准1.4目标菌株的工业化生产豆豉的应用将目标菌株制备成二级种曲，待大豆蒸煮完成后，按照质量比的0.5％接种目标菌株，混合均匀后输送至曲房进行厚层通风制曲。曲床装量为1.5t/床，曲料厚度为15-20cm，整个制曲过程通过冷风机控温，制曲最高温度不超过37℃，制曲时间为32-38h。制曲完成后，将豆曲置于发酵缸内，并加入盐浓度为7％(g/ml)、酒精含量为4％(ml/ml)的食盐水，盐水加入质量为原料质量的0.8倍。发酵前期(0-10天)温度控制在42-45℃，发酵中期(第10天-第30天)温度控制在30-32℃，并加入3％(体积质量比)混合培养的球拟和鲁氏酵母，发酵后期(第30天-第50天)温度控制在20-25℃。以豆豉生产的原始菌株为对照，进行发酵操作。为了验证目标菌株在工业化生产中的稳定性，需要连续进行5次以上的发酵试验，通过感官和理化指标进行整体评价。2.结果2.1菌株的活化和诱变筛选以原始毛霉菌株为对照菌株，选取单菌落透明圈直径和菌落直径比值k最大的菌株为目标菌株，结果如表2所示。表2菌株初筛结果2.2菌株的耐高温驯化及遗传稳定性分析菌株高温下传代过程中，中性蛋白酶的活力如表3所示。表3酶活力测定由表3结果可以看出，目标菌株产蛋白酶能力强，蛋白酶活明显高于原始菌株；并且经过连续传代10次后，目标菌株的发酵产酶能力变化不大，说明该菌株的遗传特性比较稳定。连续传代10次后，得到的目标菌株即为本发明的毛霉菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc，位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为cgmccno.19279。2.3目标菌株的感官品鉴和理化指标检测感官品鉴结果如表4和图1所示，可见目标菌株在豉香、酱香、鲜香、醇厚感方面优于原始菌株，并且具有与原始菌株同等优良的色泽与酯香。总体上目标菌株更优。表4目标菌株发酵产品感官品鉴结果项目原始菌株目标菌株色泽5.05.0豉香3.54.5酱香3.54.5酯香4.04.0鲜香3.04.5醇厚感4.05.0理化指标检测结果如表5所示，可见目标菌株的总酸产量和氨基酸产量比原始菌株更高。表5理化指标检测结果菌株原始菌株目标菌株总酸(g/100g)0.72±0.060.80±0.05氨基酸态氮(g/100g)0.66±0.040.88±0.04食盐(g/100g)4.3±0.124.3±0.102.4目标菌株用于豆豉工业化生产所得豆豉的品鉴与检测目标菌株用于豆豉工业化生产后，所得豆豉的感官品鉴和理化检测结果如表6所示。表6目标菌株应用于工业化生产的感官品鉴和理化检测结果由表6可知，经过大生产连续5批次的发酵试验得出，经筛选得到的目标菌株制备的豆豉在风味和理化指标上均优于原始菌株，且稳定性较好。综上，本发明的菌株能够克服传统毛霉不耐高温的问题，且其产生的蛋白酶的活性高，进而氨基酸生成率高。将其应用于豆豉发酵，能赋予产品浓郁的酱香、豉香、鲜香，使得产品口感醇厚，滋味鲜美。当前第1页12