一种分子层析PCR检测方法与流程

本发明涉及分子生物学检测技术，特别是微生物、病毒和动物源性和种属检验技术,具体是涉及一种分子层析pcr检测方法。

背景技术：

胶体金免疫层析法(colloidalgoldimmunochromatography)是九十年代兴起的一种快速诊断技术，其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维膜的一个区带，当干燥的硝酸纤维膜一端接触样品液后，由于毛细管作用，样液将沿着该膜向前平行流动，当流动至固定有抗体的区域时，样液中相应的抗原与抗体发生特异性结合，可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。在胶体金免疫层析法的基础上，胶体金核酸层析也逐渐发展起来，通过生物素(biotin)-生物素抗体，荧光素(fitc)-荧光素抗体，地高辛(dig)-地高辛抗体等系统将pcr和胶体金免疫层析结合起来。

目前，胶体金核酸层析并没有成熟的发展起来，已有的核酸层析试纸具有以下缺点：

1.试纸外观仍然是传统的长型纸条，操作人员直接接触测试纸条，存在样品污染的情况；

2.加样区和检测区处于同一水平的两个区域，通过经毛细管侧向流的方式进行检测，存在样液回流的情况；

3.侧向流导致检测时间过长，降低检测灵敏度。样液回流导致假阳性结果。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种方便操作和显著提高检测准确度和灵敏度的分子层析pcr检测方法，解决现有胶体金核酸层析试纸所具有的上述问题和缺陷。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种分子层析pcr检测方法，采用一种多层垂直流动型层析检测卡盒，该检测卡盒具有一体化的壳体构件，包括位于卡盒上部的第一壳体构件以及位于卡盒下部的第二壳体构件，所述第一壳体构件上设有加样窗，加样窗下设置检测试纸，该检测试纸由上至下包括：由过滤衬垫和第一过滤膜组成的缀合物垫、由加固垫和第二过滤膜层组成的结合物垫、一至若干层吸水垫；该检测试纸将加样区与检测区结合在一起，形成一种垂直流动型层析结构；该卡盒的第二壳体构件内具有一个受力支撑构件和一个与缀合物垫连接在一起的收缩构件，受力支撑构件挤压缀合物垫、结合物垫和吸水垫，使之与加样窗紧密贴合在一起；触动收缩构件，移开与收缩构件连接在一起的缀合物垫，使缀合物垫与结合物垫相互分离，使位于结合物垫上的检测区暴露于加样窗，从而使结果可视化；

所述检测方法包括如下步骤：

第一步，将待测样品进行pcr反应，得到pcr产物；

第二步，将待测样品标记的pcr产物放置于所述检测卡盒的缀合物垫上，待测样品标记的pcr产物会将缀合物垫上的交联体溶解，通过第一过滤膜的渗透过滤作用，将液体渗透到包被了抗体的结合物垫上，包被在结合物垫上检测线或点的抗体与样本中的待检片段及胶体金形成一个双抗体夹心的免疫复合物，出现紫红色沉淀带；过量的样品胶体金复合物会继续渗透到包被在结合物垫上的质控线或点，与质控线或点上的biotin-牛血清白蛋白结合，也出现紫红色沉淀带，质控线或点若没有出现紫红色沉淀带，表示该检测是无效的；

第三步，激活检测卡盒开关，查看结果。

优选地，第一步中，所述待测样品在进行pcr反应之前，增加如下步骤：

(1)待测样品在增菌培养基中36℃增菌培养18-24小时；

(2)取上述增菌后液体，加入到含缓冲剂的ep管内，100℃煮沸10min；

(3)ep管冷却至室温，取部分管内液体，加入到含反应试剂的pcr管中。

优选地，第一步中，将pcr管放入热循环仪中，反应90min；取出pcr管，滴加4滴缓冲液。

优选地，第二步中，将pcr管内所有液体加至所述检测卡盒中反应2min后，再滴加4滴缓冲液，反应1min。

优选地，所述多层垂直流动型层析检测卡盒将传统的免疫胶体金侧向流水平层析优化成垂直流多层层析，去掉传统试纸条两端吸水垫的设置，将加样区和检测区有机的整合在一起，保证检测样液全部接触到检测区，从而提高了检测灵敏度。所述检测层析卡盒可以呈扁平状或立体的柱状。

优选地，所述缀合物垫是由挠性或刚性过滤衬垫和第一过滤膜为贴合在一起的一体结构；所述检测卡的缀合物垫包括含有标记物的胶体金交联体或生物素或荧光素或地高辛抗体等的交联体，可以直接用来结合pcr产物或无损dna或抗原以产生信号。所述结合物垫由加固垫和第二过滤膜为贴合在一起的一体结构，加固垫中间正对加样窗的部位开有导流窗口；第二过滤膜上位于正对导流窗口的部位包括含有检测信号的捕获剂或抗体的检测线或点和质控线或点，即构成了检测区。观察质控线或点上是否显色，从而可以判断该卡盒的检测是否有效。

优选地，所述多层垂直流动型层析检测卡的试纸中设置两层过滤膜，所述吸水垫和加固垫通过第二过滤膜相互连接，所述过滤衬垫和加固垫通过第一过滤膜相连接。所述结合物垫的第二过滤膜上设有与加样窗边缘垂直相对的凹陷的环形导流槽，用于疏导液体向下流动，从而让样液集中在检测区域。

优选地，所述检测试纸的检测区与所述加样窗位置相垂直对应，样液流动方向为从加样窗口向位于底层的吸水垫方向垂直流动；所述加样窗与所述缀合物垫密切接触，所述加样窗包括套环或o型环状窗框，缀合物垫不与第一壳体构件直接接触，而是在支撑受力构件的挤压下通过加样窗压紧缀合物垫，使周围不留一丝缝隙，这样也起到了屏蔽干扰和污染的作用。将样液滴加到加样窗，则待测样液中的pcr产物或无损dna或抗原接触并渗透缀合物垫，到达结合物垫底层的第二过滤膜；多余的液体直接渗透到吸水垫或沿环形导流槽汇入吸水垫。这一过程中只有待测样液中的液体和它携带的pcr产物或抗体能够渗透缀合物垫和加固垫，其他杂质和空气中的分子无法通过缀合物垫。

优选地，第三步中，所述激活检测卡盒开关具体为触动所述收缩构件；所述检测卡盒为机械触动设计，所述第一壳体构件上一端设有加样窗，另一端设有滑动槽或小孔；所述第二壳体构件内的收缩构件的开关从第一壳体构件的滑动槽伸出，拉动收缩构件的开关使收缩构件沿着滑动槽向另一端滑动，通过滑动收缩移开与收缩构件连接在一起的缀合物垫，使得缀合物垫与结合物垫相互分离，从而释放压力，收缩构件触动后，位于上层的缀合物垫收缩到滑动槽位置，位于下层的结合物垫上的检测区暴露在加样窗内，从而呈现出可视的反应结果；或者通过第一壳体构件上所设小孔以线绳或胶带或螺栓拉动或转动收缩构件移开缀合物垫，使位于结合物垫上的检测区暴露于加样窗，从而使结果可视化；检测结果读取不受外界污染和影响，整个检测卡盒一体成型，方便使用。所述收缩构件是向另一端水平拉动或水平转动或垂直按压的方式被拉松、转动或激活被移动、收缩或激活。

优选地，所述受力支撑构件用于支撑吸水垫、结合物垫以及缀合物垫并施加向上的压力；受力支撑构件的受力面大小与加样窗大小一致，至少不小于加样窗的面积，受力支撑构件以活塞状的方式放置在第二壳体构件内；受力支撑构件采用柱状或蘑菇型或高脚杯型形状；受力支撑构件是单个整体或由多个部件组成。

优选地，所述检测线或点和质控线或点设置于结合物垫的环形导流槽中间垂直正对加样窗的环岛上，构成了试纸的检测区。由于检测区位于加样区正下方，所以包被在环岛上的质控线或点和检测线或点上的捕获剂的量得以减少，从而在保证检测准确度的同时降低成本。

优选地，所述第一壳体构件和第二壳体构件为一整体，所述第一壳体构件平行于第二壳体构件的边缘彼此相接紧密扣合在一起；或者第一壳体构件和第二壳体构件可通过弹簧、铰链等附件进行连接或栓式连接，第一壳体构件和第二壳体构件的连接方式不受限制。所述检测卡盒可采用各种形状，例如长方体、正方体、多边体、柱体等。

优选地，所述检测试纸的材料具有渗透性和过滤作用；所述过滤衬垫采用挠性或刚性的过滤材料介质，包括聚丙烯纤维(丙纶)、聚丙烯、金属或非金属过滤介质、金属纤维烧结粘、粉末烧结材料、多空陶瓷、烧结多空塑料烧结吕氧化物、或玻璃过滤介质；所述过滤衬垫用于有效屏蔽样液中的杂质和可能潜在的气溶胶等物质；所述第一过滤膜采用乙酸纤维素膜或玻璃纤维膜或聚酰胺膜或聚乙烯膜或硝酸纤维素膜等具有过滤作用的材料；所述第一过滤膜用于过滤样液中细小杂质，均匀分散液体，包被化学显色或发光物质；所述加固垫采用天然纤维素、聚乙烯(pe)、聚氯乙烯(pvc)、聚丙烯(pp)、聚苯乙烯(ps)等，用于加固第二过滤膜上检测区域(包含检测线或点&质控线或点)，构成具有一定空间的独立检测区域；所述第二过滤膜采用乙酸纤维素膜或玻璃纤维膜或聚酰胺膜或聚乙烯膜或硝酸纤维素膜等具有过滤作用的材料；所述第二过滤膜用于包被捕获样品中待测物质(pcr产物或无损dna或抗原)以产生信号的免疫物质和生物素、血清白蛋白等质控物质。缀合物垫的上层的采用挠性或刚性的过滤材料介质的过滤衬垫和下层的第一过滤膜可以有效屏蔽样液中的杂质和可能潜在的气溶胶等物质，有效过滤样液中细小杂质，均匀分散液体，包被化学显色或发光物质，有效防止假阳性的可能性，因此具有无需设立阴性、阳性和基质对照，降低成本的优点。

优选地，所述吸水垫是一至若干层具有吸水性的材料制成，位于结合物垫下方和受力支撑构件上方，用以吸收流经缀合物垫和结合物垫的多余的样液，防止回流。

和现有技术相比，本发明具有以下有益效果：该检测卡盒采用垂直流层析技术，受力支撑构件施加压力使缀合物垫与结合物垫紧密结合，中间设有导流槽，因而在检测时，不会存在样品液回流的现象而影响检测结果(可以消除样液回流从而防止假阳性检测结果)，并且在过滤衬垫、加固垫和滤膜的过滤下，可以将样品液中的干扰物质过滤，使检测不受影响(可以使检测不受样液中复杂基质的影响)；并直接与所述缀合物垫上的标记物接触，快速准确反应，通过肉眼观察加样区的显示来判定结果。所述检测卡盒将传统的免疫胶体金水平层析优化成多层垂直层析，减少两端吸水垫的设置，将加样区和检测区有机的整合在一个部分，保证检测样品全部接触到检测区，从而提高了检测灵敏度，具有无需设立阴阳对照，降低成本的优点。与现有方法相比，本发明具有操作方便、适用样本广泛，防止污染、灵敏度高、结果判断直观、省事省力等优点可用于临床、食品等多种样本的检测，检测结果准确。

附图说明

参照示意性附图，对本发明的多层垂直检测卡盒的特征和优点将更加清楚，其中：

图1为本发明的实施例1(采用长方体外形)的正视图；

图2为图1的侧视立体分解图；

图3为图1的平面结构分解示意图；

图4为本发明实施例1的代表性装置的底部视图；

图5为本发明实施例1的代表性装置的一些组件；其中，图5a代表结合物垫(采用正方形)，图5b代表结合物垫(采用圆形)，图5c代表缀合物垫；

图6为本发明实施例2(采用圆形)的正视图；

图7是图6的侧面结构分解示意图；

图8为本发明实施例2(采用圆形)的正面结构示意图；

图9为本发明实施例2的代表性装置的底部视图；

图10为本发明实施例1和实施例2的代表性装置的一些组件；其中，图10a代表收缩构件(采用长方形外观)，图10b代表受力支撑构件，图10c代表收缩构件(采用圆形外观)。

附图标记说明：1-第一壳体构件；2-第二壳体构件；3-过滤衬垫；4-第一过滤膜；5-加固垫；6-第一吸水垫；7-第二吸水垫；8-受力支撑构件；9-方形收缩构件；10-加样窗；11-第二过滤膜；12-o型环；13-滑动槽；14-导流槽；15-缀合物垫；16-结合物垫；51-质控线或点；52-检测线或点；91-圆形收缩构件。

具体实施方式

本发明提供的多层垂直型层析检测卡盒，包括检测试纸与塑料卡套，以下结合附图来描述该检测卡盒的制造过程与具体结构。

实施例1采用长方体外形多层垂直型层析检测卡盒

如图1-图5、图10所示，本发明一种多层垂直型层析检测卡盒，包括检测试纸与卡盒，该检测卡盒具有一个一体化的壳体构件，包括位于卡盒上端的第一壳体构件1以及位于卡盒下端的第二壳体构件2，第一壳体构件1以及第二壳体构件2之间存在缝隙，方便安装(见图2)。所述检测试纸的检测加样区结构具有至少两个吸水垫(第一吸水垫6和第二吸水垫7)，第一壳体构件1上一端设有加样窗10，另一端设有滑动槽13或小孔，加样窗10下设置检测试纸，该检测试纸由上至下包括：由过滤衬垫3和第一过滤膜4组成的缀合物垫15、由加固垫5和第二过滤膜层11组成的结合物垫16、第一吸水垫6和第二吸水垫7；该检测试纸将加样区与检测区结合在一起，形成一种垂直流动型层析结构。

该卡盒的第二壳体构件2内具有一个受力支撑构件8和方形收缩构件9，能将第一吸水垫6、第二吸水垫7、结合物垫16、缀合物垫15紧密连接在一起；

所述第一壳体构件1表面设有加样窗10和滑动槽13，所检测试纸的检测加样区与该加样窗10位置相对应，样品流动方向为垂直流动。第二壳体构件2内方形收缩构件9的开关从滑动槽13伸出。方形收缩构件9与缀合物垫15相连接，方形收缩构件9通过向另一端滑动可释放压力，使得缀合物垫15与结合物垫16相互分离，使检测区暴露在加样窗内，从而呈现出可视的反应结果；检测结果读取不受外界污染和影响；整个检测卡盒一体成型，方便使用；方形收缩构件9是水平移动、水平旋转或垂直按压的方式被拉松、转动或激活被拉动、转动或激活。

所述缀合物垫15为采用挠性或刚性的过滤材料介质的过滤衬垫3以及第一过滤膜4组合成的一体结构。

所述缀合物垫15的过滤衬垫3采用挠性或刚性的材料介质，包括聚丙烯纤维(丙纶)、聚丙烯、金属或非金属过滤介质、金属纤维烧结粘、粉末烧结材料、多空陶瓷、烧结多空塑料烧结吕氧化物、或玻璃过滤介质；过滤衬垫3用于有效屏蔽样液中的杂质和可能潜在的气溶胶等物质；第一过滤膜4采用乙酸纤维素膜或玻璃纤维膜或聚酰胺膜或聚乙烯膜或硝酸纤维素膜等具有过滤作用的材料；第一过滤膜4用于过滤样液中细小杂质，均匀分散液体，包被化学显色或发光物质；缀合物垫15包括含有标记物的胶体金交联体，用来结合待检测物产生信号。

所述结合物垫16为加固垫5和第二过滤膜11组合成的一体结构，包括含有检测信号的捕获剂，所述结合物垫16的第二过滤膜11上设有与加样窗10边缘垂直相对的凹陷的环形导流槽14，用于疏导液体向下流动，从而让样液集中在检测区域。加固垫5采用天然纤维素、聚乙烯(pe)、聚氯乙烯(pvc)、聚丙烯(pp)、聚苯乙烯(ps)等，用于加固第二过滤膜上检测区域(包含检测线或点&质控线或点)，构成具有一定空间的独立检测区域；第二过滤膜11采用乙酸纤维素膜或玻璃纤维膜或聚酰胺膜或聚乙烯膜或硝酸纤维素膜等具有过滤作用的材料；第二过滤膜11用于包被捕获样品中待测物质(pcr产物或无损dna或抗原)以产生信号的免疫物质和生物素、血清白蛋白等质控物质。

所述方形收缩构件9连接缀合物垫15，加样区与检测区分隔开，检测结果读取不受外界污染和影响。

所述方形收缩构件9是水平移动、水平旋转或垂直按压的方式被拉松、转动或激活被拉动、转动或激活。

所述检测线或点52和质控线或点51设置于第二过滤膜11上导流槽围起的环岛上、加固垫5上的窗口内，由于检测区位于加样窗口正下方，所以包被在质控线或点51上的抗体或抗原的量减小(见图5a)。

实施例2采用圆柱形外形的多层垂直型层析检测卡盒

如图6-图10所示，本发明一种多层垂直型层析检测卡盒，包括检测试纸与卡盒，该检测卡盒具有一个一体化的壳体构件，包括位于卡盒上端的第一壳体构件1以及位于卡盒下端的第二壳体构件2，所述检测试纸的检测加样区结构具有至少两个吸水垫(第一吸水垫6和第二吸水垫7)，第一壳体构件1上一端设有加样窗10，另一端设有滑动槽13或小孔，加样窗10下设置检测试纸，该检测试纸由上至下包括：由过滤衬垫3和第一过滤膜4组成的缀合物垫15、由加固垫5和第二过滤膜层11组成的结合物垫16、第一吸水垫6和第二吸水垫7；该检测试纸将加样区与检测区结合在一起，形成一种垂直流动型层析结构。

该卡盒的第二壳体构件2内具有一个受力支撑构件8和圆形收缩构件91，能将第一吸水垫6、第二吸水垫7、第二过滤膜11、加固垫5、第一过滤膜4和过滤衬垫3紧密连接在一起；

所述第一壳体构件1表面设有加样窗10，所检测试纸的检测加样区与该加样窗10位置相对应，样品流动方向为垂直流动。

所述缀合物垫15是由采用挠性或刚性的过滤材料介质的过滤衬垫3和第一过滤膜4贴合在一起的一体结构。缀合物垫15的过滤衬垫3采用挠性或刚性的材料介质，包括聚丙烯纤维(丙纶)、聚丙烯、金属或非金属过滤介质、金属纤维烧结粘、粉末烧结材料、多空陶瓷、烧结多空塑料烧结吕氧化物、或玻璃过滤介质；过滤衬垫3用于有效屏蔽样液中的杂质和可能潜在的气溶胶等物质；第一过滤膜4采用乙酸纤维素膜或玻璃纤维膜或聚酰胺膜或聚乙烯膜或硝酸纤维素膜等具有过滤作用的材料；第一过滤膜4用于过滤样液中细小杂质，均匀分散液体，包被化学显色或发光物质；缀合物垫15包括含有标记物的胶体金交联体，用来结合待检测物产生信号。所述缀合物垫15包括含有标记物的胶体金交联体，用来结合反应产物或抗原产生信号。

所述结合物垫16由加固垫5和第二过滤膜11为贴合在一起的一体结构，包括含有检测信号的捕获剂。结合物垫16的第二过滤膜11上设有与加样窗10边缘垂直相对的凹陷的环形导流槽14，用于疏导液体向下流动，从而让样液集中在检测区域。加固垫5采用天然纤维素、聚乙烯(pe)、聚氯乙烯(pvc)、聚丙烯(pp)、聚苯乙烯(ps)等，用于加固第二过滤膜上检测区域(包含检测线或点&质控线或点)，构成具有一定空间的独立检测区域；第二过滤膜11采用乙酸纤维素膜或玻璃纤维膜或聚酰胺膜或聚乙烯膜或硝酸纤维素膜等具有过滤作用的材料；第二过滤膜11用于包被捕获样品中待测物质(pcr产物或无损dna或抗原)以产生信号的免疫物质和生物素、血清白蛋白等质控物质。

所述圆形收缩构件91连接缀合物垫15，加样区与检测区分隔开，检测结果读取不受外界污染和影响。

所述圆形收缩构件91是水平移动、水平旋转或垂直按压的方式被拉松、转动或激活。

所述检测线或点52和质控线或点51设置于第二过滤膜11上，由于检测区位于加样区正下方，所以包被在质控线或点51上的抗体或抗原的量减小(见图5b)。

实施例3

以一种检测食源性致病菌的检测卡的制备方法为例，介绍本发明所述的检测卡及其检测试纸的结构如下：

步骤1、将信号产生单元分区域均匀地包被在第一过滤膜4上，与过滤衬垫3贴合在一起得到缀合物垫15，本实施例中所使用的原料包括链霉亲和素、胶体金以及牛血清白蛋白。

1)用0.2mk2co3将一定量的30nm胶体金溶液ph调整为7.0，加入6μl10mg/ml链霉亲和素混匀，用10％(w/v)牛血清白蛋白进行封闭。

2)用10％(w/v)牛血清白蛋白进行二次封闭，9000rpm离心30min，用金标稀释液将离心沉淀复溶，用biodot点膜仪包被在第一过滤膜4上，形成方形或圆形的包被面，与过滤衬垫3贴合在一起，从而形成缀合物垫15，如图5c所示；

步骤2、结合物垫的抗体包被

1)将nhs-biotin与牛血清白蛋白(bsa)偶联过夜，调节ph至7.4，以第二过滤膜11作为反应膜，将上述混合液包被于第二过滤膜11上的质控线或点51，将鼠抗-fitc包被于第二过滤膜11上的检测线或点52，37℃烘干保存。如图5a、5b所示，将所述质控线或点51、检测线或点52优选地构造为窄条或圆点形式，其位于第二过滤膜11上方形或圆形区域上。

步骤3、检测层析卡盒的组装

将上述经过处理后的缀合物垫15放置在方形收缩构件9上，并将结合物垫16、第一吸水垫6和第二吸水垫7(材质为吸水性材料，包括但不限于吸水纸)依次叠加在一起，放置在第二壳体构件2上，再将第一壳体构件1和第二壳体构件2组合在一起，备用，如图2所示。

由图2和图3可知，本发明提供的多层垂直型层析检测卡盒，包括检测试纸与第一壳体构件1、第二壳体构件2，其中：

该层析检测卡盒具有第一壳体构件1、第二壳体构件2，在该第二壳体构件2内部，依次叠加有第一吸水垫6、第二吸水垫7和结合物垫16，该结合物垫16具有至少两个包被膜，每两个包被膜之间通过第二过滤膜11相互连接，该至少两个包被膜与过滤衬垫3也通过第一过滤膜4相连接；该过滤衬垫3上包被有标记物，该标记物是链霉亲和素—胶体金，不限于固定的组合，也可以标记二抗等磁颗粒。

由图1、图6可知，该第一壳体构件1对应缀合物垫15开设有一个加样窗10，该加样窗10也是观察检测结果的观察视窗。

由图8可知，圆形收缩构件91与缀合物垫15相连接,圆形收缩构件91通过向另一端滑动可释放压力，缀合物垫15在圆形收缩构件91的作用下可以被移除，使检测区暴露在加样窗10内，从而呈现出可视的反应结果,并看到位于结合物垫16上显示的结果，该加样窗10的形状可以是圆形、正方形和多边形。检测结果读取不受外界污染和影响；整个检测卡盒一体成型，方便使用；

由图4可知，本发明提供的多层垂直型层析检测卡盒的启动方式可通过滑动操作(即滑动方形收缩构件9)，释放受力支撑构件8，方形收缩构件9通过向另一端滑动可释放压力，使得缀合物垫15与结合物垫16相互分离，方形收缩构件9触动后，缀合物垫15缩到滑动槽13位置，启动检测。

由图9可知，本发明提供的多层垂直型层析检测卡盒的启动方式可通过旋转圆形收缩构件91，释放受力支撑构件8，启动检测。

由图10可知，本发明提供的多层垂直型层析检测卡盒中，方形收缩构件9对应图1、图2和图3中层析检测卡盒，构成单次层析检测卡盒；圆形收缩构件91对应图6、图7和图8所示层析检测卡盒，构成多重层析检测卡盒。

上述实施例中，是以第二过滤膜11作为吸水垫上和结合物垫16的包被介质和连接、第一过滤膜4作为缀合物垫15和结合物垫16的包被介质和连接，第二过滤膜11和第一过滤膜4可以是硝酸纤维素膜，而实际上完全可用乙酸纤维素膜、玻璃纤维膜、聚酰胺膜、聚乙烯膜等替代上述硝酸纤维素膜，此乃本领域技术人员结合本申请内容可以作出的简单等效替换，具体过程在此不予赘述。

另外，上述实施例中，该层析检测卡盒包括受力支撑构件8，受力支撑构件8可以在图10中看到，这些实施例对本发明而言只是说明性的，而非限制性的，也可以使用其他形式的受力支撑构件。在一些实施例中，受力支撑构件8可由任何材料制成，不限于塑料。图3所示，这些非限制性实施例中受力支撑构件8用于对吸水垫6、吸水垫7、结合物垫16以及缀合物垫15施加压力。受力支撑构件8以活塞状的方式放置在第二壳体构件2上。如图10b所示，在一些实施例中，受力支撑构件8可以具有蘑菇型、高脚杯型等形状，由头部和杆组成，且头部比杆宽，受力支撑构件8可以是单个整体也可以是多个部件组成，受力支撑构件8是保证层析检测卡盒为垂直流层析而不是侧向流。

受力支撑构件8可施加垂直于结合物垫16的压力，压力作用下，结合物垫16和缀合物垫15紧密接触，减轻压力即可停止流动，使得测试样品停留在结合物垫16上，便于提高检测灵敏度并预防测试样品回流。

上述实施例中，所述层析检测卡盒包括收缩构件(例如方形收缩构件9、圆形收缩构件91)，接触缀合物垫15，受力支撑构件8分别从上方和下方压缩缀合物垫15、结合物垫16、吸水垫6、吸水垫7。由图2可知，方形收缩构件9可以施加压力，使得受力支撑构件8与结合物垫16、缀合物垫15构成第一壳体构件1主体；收缩构件向检测卡盒后方滑动可释放压力，使得缀合物垫15与结合物垫16相互分离，测试样品与捕获剂的反应结果只存在于结合物垫16上，收缩构件可以采用水平移动、水平旋转、垂直按压以及侧面滑动等方式操作。

在一些实施例中，缀合物垫15接触的加样窗10可以包括套环或o型环12(见图3)等构件，套环或o型环12可以使样液不会流到检测区以外的地方，直接接触检测区；相对于加样窗10周边压缩缀合物垫15，缀合物垫15不与第一壳体构件1直接接触，而是通过加样窗10，将样品施加到加样窗10，则待测样液接触缀合物垫15。

而且，上述实施例中，该层析检测卡盒对应缀合物垫15设有一个加样窗10，实际中，该加样窗10也是对应结合物垫16结构位置的一个观察窗口，通过一个观察窗了解所有检测结果。

第一壳体构件1和第二壳体构件2为一整体，在实施例1中，第一壳体构件1平行于第二壳体构件2的边缘彼此相接扣合在一起。在一些实施例中，第一壳体构件1和第二壳体构件2通过弹簧、铰链等附件进行连接或栓式连接。第一壳体构件1和第二壳体构件2的连接方式不受限制。

在介绍上述检测层析卡的制造过程后，再介绍上述检测卡的使用方法如下：

选取肉类、鸡蛋、牛奶为验证样品，总共28份，样品分为阳性菌添加样(22个)、自然样品(4个)和阴性样(2个)三类，每个阳性菌添加样品添加对应检测项目的一种菌种。自然样品直接从市场购买，不做特殊处理。阴性样品为熟食(确保为目标菌阴性)。该28份样本采用实施例1中制备的层析检测卡盒检测，同步采用gb4789.4-2010检测方法进行检测。结果如表1所示，显示了该层析检测卡盒具有良好的检测结果。

试验例1

试验例1中，检测沙门氏菌时，用沙门氏菌的保守基因的片段作为模板产生专有的pcr反应，用fitc、生物素标记pcr产物，然后将其放置于缀合物垫15上，缀合物垫15上包被了链霉亲和素-胶体金交联体，待测样品标记的pcr产物，会将缀合物垫15上的交联体溶解，通过第一过滤膜4的渗透过滤作用，将液体渗透到包被了特异性抗体的结合物垫16上，包被在结合物垫16上检测线或点52的兔抗fitc抗体与样本中的待检片段及链霉亲和素-胶体金形成一个双抗体夹心的免疫复合物，出现紫红色沉淀带。过量的样品链霉亲和素-胶体金复合物会继续渗透到包被在结合物垫16上的质控线或点51，与质控线或点51上的biotin-牛血清白蛋白结合，也出现紫红色沉淀带，质控线或点51若没有出现，表示该检测是无效的。

表1.28份食品样本层析检测卡盒和gb4789.4-2010检测结果

检测结果显示，通过不同浓度沙门氏菌、不同食品基质的检测，沙门氏菌检测24份样品。与国家标准检测方法结果相比，判定阳性符合的18例，阴性符合的6例，阳性不符合的0例，阴性不符合的0例。试验例1的检测结果阳性符合率100％，阴性符合率100％，层析检测卡盒的结果与背景相符，显示了该方法制备的层析检测卡盒具有较好的检测结果。

试验例2

试验例2中，检测单核细胞增生李斯特氏菌时，用单核细胞增生李斯特氏菌的保守基因的片段作为模板产生专有的pcr反应，用fitc、生物素标记pcr产物，然后将其放置于缀合物垫15上，缀合物垫15上包被了链霉亲和素-胶体金交联体，待测样品标记的pcr产物，会将缀合物垫15上的交联体溶解，通过第一过滤膜4的渗透过滤作用，将液体渗透到包被了特异性抗体的结合物垫16上，包被在结合物垫16上检测线或点52的兔抗fitc抗体与样本中的待检片段及链霉亲和素-胶体金形成一个双抗体夹心的免疫复合物，出现紫红色沉淀带。过量的样品链霉亲和素-胶体金复合物会继续渗透到包被在结合物垫16上的质控线或点51，与质控线或点51上的biotin-牛血清白蛋白结合，也出现紫红色沉淀带，质控线或点51若没有出现，表示该检测是无效的。

表2.28份食品样本层析检测卡盒和gb4789.30-2010检测结果

检测结果显示，通过不同浓度单核细胞增生李斯特氏菌、不同食品基质的检测，单核细胞增生李斯特氏菌检测28份样品。与国家标准检测方法结果相比，判定阳性符合的24例，阴性符合的4例，阳性不符合的0例，阴性不符合的0例。试验例2的检测结果阳性符合率100％，阴性符合率100％，层析检测卡盒的结果与背景相符，显示了该方法制备的层析检测卡盒具有较好的检测结果。

试验例3

试验例3中，检测大肠埃希氏菌o157：h7时，用大肠埃希氏菌o157：h7的保守基因的片段作为模板产生专有的pcr反应，用fitc、生物素标记pcr产物，然后将其放置于缀合物垫15上，缀合物垫15上包被了链霉亲和素-胶体金交联体，待测样品标记的pcr产物，会将缀合物垫15上的交联体溶解，通过第一过滤膜4的渗透过滤作用，将液体渗透到包被了特异性抗体的结合物垫16上，包被在结合物垫16上检测线或点52的兔抗fitc抗体与样本中的待检片段及链霉亲和素-胶体金形成一个双抗体夹心的免疫复合物，出现紫红色沉淀带。过量的样品链霉亲和素-胶体金复合物会继续渗透到包被在结合物垫16上的质控线或点51，与质控线或点51上的biotin-牛血清白蛋白结合，也出现紫红色沉淀带，质控线或点51若没有出现，表示该检测是无效的。

表3.24份食品样本层析检测卡盒和gb4789.36-2008检测结果

检测结果显示，通过不同浓度大肠埃希氏菌、不同食品基质的检测，大肠埃希氏菌检测24份样品。与国家标准检测方法结果相比，判定阳性符合的16例，阴性符合的8例，阳性不符合的0例，阴性不符合的0例。试验例3的检测结果阳性符合率100％，阴性符合率100％，层析检测卡盒的结果与背景相符，显示了该方法制备的层析检测卡盒具有较好的检测结果。

试验例4

试验例4中，检测沙门氏菌时，将单克隆抗体8h10-b3标记胶体金，与对应的一定量的热灭活的沙门氏菌于酶标孔中孵育5min，0.1％pbst洗涤三遍后，用3％牛血清蛋白封闭，37℃封闭1h。甩干封闭液，用0.1％pbst洗涤四遍后，加入已知浓度的原始单抗及其标记胶体金后的离心上清液，喷涂于缀合物垫15上。准备二抗，用0.1％pbst洗涤5遍稀释5000倍的羊抗鼠酶标二抗，弃去二抗，加入显色液，37℃反应15min，加入2m硫酸终止反应。采用bio-dot三维点膜仪，将稀释好的混合单抗喷于结合物垫16的检测线或点52上，驴抗鼠二抗稀释为1mg/ml，喷于结合物垫16的质控线或点51上，将结合物垫放置在30℃真空干燥箱干燥2.5h以上。将缀合物垫15、结合物垫16、吸水垫6、吸水垫7按一定次序和位置叠合好。通过第一过滤膜4的渗透过滤作用，将液体渗透到包被了特异性抗体的结合物垫16上，包被在结合物垫16上检测线或点52的单抗与样本中的沙门抗原形成一个双抗体夹心的免疫复合物，出现紫红色沉淀带。过量的样品胶体金复合物会继续渗透到包被在结合物垫16上的质控线或点51，与质控线或点51上的二抗发生反应，也出现紫红色沉淀带，质控线或点51若没有出现，表示该检测是无效。

表4.24份食品样本层析检测卡盒和gb4789.36-2008检测结果

检测结果显示，通过不同浓度沙门氏菌、不同食品基质的检测，沙门氏菌检测20份样品。与国家标准检测方法结果相比，判定阳性符合的16例，阴性符合的4例，阳性不符合的0例，阴性不符合的0例。试验例4的检测结果阳性符合率100％，阴性符合率100％，层析检测卡盒的结果与背景相符，显示了该方法制备的层析检测卡盒具有较好的检测结果。

从上述实施例及试验例可知，本发明具有以下突出优点：

1.所述层析检测卡盒可以快速灵敏的进行指标的检测；

2.所述层析检测卡盒将缀合物垫15与结合物垫16紧密整合，独有的垂直流层析，有利于提高检测效率，减少样品消耗。

3.所述层析检测卡盒将检测与结果显示设置与卡盒内部，防止外源样品干扰及污染。

以上实施例中所述的链霉亲和素-胶体金、牛血清白蛋白、nhs-biotin以及鼠抗-fitc仅仅是本发明的大量可行实施方案中的数个实例而已，其还可以包被一抗、二抗等物质，且缀合物垫15、结合物垫16中抗体、链霉亲和素、胶体金、荧光素的组合方式不限制于以上实施例，本领域的技术人员可以在不偏离本发明的范围内，进行调整。在本发明中，为了表述方便，将上述信号产生分析单元包被至过滤衬垫3，并通过第一过滤膜4连接结合物垫16，该缀合物垫15是由过滤衬垫3与第一过滤膜4组成的一体结构，也可以是粘接在一起所形成，如图3所示。

上文参照附图及相关数据所示实施例对本发明进行了详细的说明，但是本领域的技术人员应该理解，本发明并不限于这些特定的实施例，而是可以在不偏离本发明的范围或者精神实质的情况下对其进行各种变化和修改。