一种莫氏巴贝斯虫检测试剂盒的制作方法

本发明涉及一种非疾病诊断为目的的，用于检测和鉴别动物是否带有病原寄生虫的方法与试剂盒，确切讲本发明涉及一种利用交叉引物恒温扩增结合免疫层析技术检测和鉴别莫氏巴贝斯虫的方法与试剂盒。

背景技术：

羊的巴贝斯虫病(ovisbabesiosis)是一种由媒介蜱传播的寄生于绵和山羊的红细胞内引起的血液原虫病，感染动物表现为发热、黄疸、血红蛋白尿，严重感染时会引起动物死亡(uilenberg,2006)。全世界报道的引起羊巴贝斯虫病的病原有莫氏巴贝斯虫(babesiamotasi)、绵羊巴贝斯虫(babesiaovis)、粗糙巴贝斯虫(babesiacrassa)、叶状巴贝斯虫(babesiafoliata)和泰氏巴贝斯虫(babesiataylori)。在我国流行的巴贝斯虫有两个种，即莫氏巴贝斯虫和巴贝斯虫未定种新疆株(guanetal.,2002,2009；liuetal.,2007；niuetal.,2009)。利用its、hsp90、coi、cob、cox3、rps8、trap、ama1、ron2等基因对我国的巴贝斯虫分离株进行分类研究表明，莫氏巴贝斯虫被分成两个小分支，即河北株/宁县株(莫氏巴贝斯虫hn亚种)和临潭株/天祝株(莫氏巴贝斯虫lt亚种)(baietal.,2002；guanetal.,2002；liuetal.,2007b；niuetal.,2009a)。

羊的巴贝斯虫病在我国流行范围广，危害严重，对我国养羊业的健康持续发展造成了巨大的威胁。关贵全等和王锦明等分别利用以莫氏巴贝斯虫lt亚种和巴贝斯虫未定种裂殖子可溶性抗原建立的间接elisa方法，对我国22个省份羊巴贝斯虫病的流行状况调查显示，莫氏巴贝斯虫的平均阳性率为43.5％，羊巴贝斯虫未定种为31.66％，该病在全国范围内均有流行(guanetal,2012；wangetal,2013)。

目前用于羊巴贝斯虫感染检测的方法有经典的血涂片染色法，该方法在染虫率很低的情况下难以检出病原，而且对操作人员的技能要求较高。基于分子生物学开发的巴贝斯虫鉴别检测方法有实时荧光定量pcr、反向线性印迹、多重pcr等，这些方法灵敏度高、特异性也较高，但是实时荧光定量pcr和多重pcr需要昂贵的仪器；反向线性印迹操作繁琐、耗时长。而且上述方法不利于现场快速检测的应用。因此，亟待开发一种快速、高灵敏度和特异性的可用于临床现场检测的可靠方法。

技术实现要素：

本发提供一种可克服现有技术不足，用于莫氏巴贝斯虫鉴别检测的交叉引物恒温扩增联合免疫层析试纸检测的方法及试剂盒。

本发明的莫氏巴贝斯虫检测试剂盒中包括有用于恒温扩增的五条引物：序列为seqidno.3的一条交叉引物、序列为seqidno.1和序列为seqidno.2的置换引物、fitc标记的探针引物seqidno.4和生物素标记的探针引物seqidno.5。试剂盒还包括有免疫层析试纸条。

优选地，为方便使用，本发明的莫氏巴贝斯虫检测试剂盒中还包括：10×isothermalamplificationbuffer、100mmmgso4、2.5mmdntpmix，bstdna聚合酶。

采用前述本发明的莫氏巴贝斯虫检测试剂盒用于非疾病诊断的使用方法是：以提取的待检样品基因组dna为模板，用试剂盒内的引物和探针建立的交叉引物恒温扩增反应体系进行扩增，再将扩增产物滴加至免疫层析试纸条，根据试纸条的质控线与检测线是否同时显色确定待检样品是否有莫氏巴贝斯虫。如果质控线和检测线均显色，则结果判定为阳性；若只有质控线处显色，则结果判定为阴性。

优选地，本发明的试剂盒使用方法的最佳扩增的反应条件为：63℃，50min；80℃，2min。

本发明所用的核酸检测试纸条购自twistdx公司。

本发明利用了交叉引物扩增技术。交叉引物扩增是一种新型的恒温扩增诊断检测方法，一种具有链置换活性的dna聚合酶(bstdna聚合酶)及多条引物，在恒温条件下可实现目标区域高效、快速的扩增。该方法的重点和难点在于引物组和标记探针引物的设计，整个检测过程只需要一台恒温水浴锅即可完成检测反应，结果的判定结合层析试纸条，以肉眼可见的方式完成，所以特别适合有大量样品非实验室场所的临床检测使用。

本发明具有以下优点：

(1)本发明操作简便、快速：整个检测过程在一个小时内全部完成，对操作人员素质要求低，只需要具备普通pcr操作的人员均可进行本操作。

(2)灵敏度高：本发明所建立的方法可以检测0.06pg的莫氏巴贝斯虫基因组dna，相当于染虫率为0.00006％时然可以检测到阳性样品，是多重pcr灵敏度的100倍。

(3)本发明特异性高：交叉引物扩增中两条标记探针引物lt-2a、lt-3a和交叉引物lt-2a1s识别莫氏巴贝斯虫特异的序列，保证了本方法的高度特异性；恒温扩增的检测产物两端分别标记有fitc和生物素，用于与层析试纸条上的fitc单抗和生物素单抗的特异性结合，进一步保证了该检测方法的特异性。

(4)使用范围广：交叉引物扩增不需要昂贵的荧光定量pcr仪或pcr仪，只要有提供恒温的设备，如水浴锅、干烤箱等均可进行本检测，适用于基层临床样品的检测和流行病学调查。

(5)检测结果可用肉眼读取：结果经试纸条显色后，以肉眼可见的方式来读取，不需要进行专门的技术培训就可完成。

附图说明

图1.莫氏巴贝斯虫交叉引物扩增最佳反应温度的优化。1-4号试纸条反应温度分别为58℃、61℃、63℃、68℃。

图2.莫氏巴贝斯虫交叉引物扩增最佳反应时间的筛选。1-5号试纸条反应时间分别为35min、40min、45min、50min、60min。

图3.莫氏巴贝斯虫交叉引物特异性检测。1为莫氏巴贝斯虫临潭株，2为莫氏巴贝斯虫河北株，3为莫氏巴贝斯虫宁县株，4为巴贝斯虫未定种新疆株，5为尤氏泰勒虫，6为绵羊泰勒虫，7为吕氏泰勒虫，8为阴性对照。

图4.莫氏巴贝斯虫交叉引物扩增灵敏度检测。1模板浓度为4ng/μl，2为800pg/μl，3为160pg/μl，4为32pg/μl，5为6.4pg/μl，6为1.28pg/μl，7为0.3pg/μl，8为0.06pg/μl，9为0.012pg/μl.。

具体实施方式

本发明试剂盒中的引物如下：

置换引物lt-5a(seqidno.1)：

5'-gctaattgtagggctaatacaag-3'seqidno.1

置换引物lt-4s(seqidno.2)：5'-cttgaatggaacatcgctaa-3'

交叉引物lt-2a1s(seqidno.3)：

5'-cgatgccttttggcggcgcgattcgcaagtttattatg-3'

探针引物lt-2a(seqidno.4)：5'-fitc-cgatgccttttggcggcg-3'

探针引物lt-3a(seqidno.5)：5'-bio-gcttttaaaccaattgttgg-3'

本发明试剂盒所用引物序列合成及测序工作均由南京金斯瑞股份有限公司完成，核酸检测试纸条购自twistdx公司。

本发明的使用方法为：

(1)提取待检样品全血基因组dna，取待检动物全血200μl，利用血液基因组dna提取试剂盒提取基因组dna(试剂盒购自qiagen公司，货号51306)，操作方法参照说明书进行。

(2)交叉引物扩增反应体系

(3)扩增反应条件：优选地，所述交叉引物扩增反应条件为58～71℃，50min，85℃，2min。更优选地，所述交叉引物扩增反应条件为63℃，50min，85℃，2min。

(4)进行检测

取恒温扩增产物10μl滴至试纸条的吸收垫上，随后将免疫试纸条插入到含有100μl层析缓冲液的1.5ml离心管中，静置3～5min，判定检测结果。

(5)检测结果判定

当免疫试纸条质控线显色，检测线也显色，则判定为阳性；

当免疫试纸条质控线显色，检测线不显色，则判定为阴性；

当免疫试纸条质控线不显色，则检测结果不成立。

以下为本发明实际检测的实施例。

实施例1：交叉引物恒温扩增最佳反应温度和时间的优化

1.血液基因组dna提取

用qiaampdnaminikit(qiagen,germany)进行血液dna的提取，具体操作步骤参照说明书进行。

2.引物设计

根据genbank公布的莫氏巴贝斯虫、巴贝斯虫未定种新疆株、绵羊泰勒虫、尤氏泰勒虫等的18srrna基因序列，比对分析后，在种类保守，种间变异的序列设计交叉扩增引物，靶标序列选择位于18srrna5’端，扩增长度为150bp。

置换引物lt-5a：5'-gctaattgtagggctaatacaag-3'

置换引物lt-4s：5'-cttgaatggaacatcgctaa-3'

交叉引物lt-2a1s：

5'-cgatgccttttggcggcgcgattcgcaagtttattatg-3'

探针引物lt-2a：5'-fitc-cgatgccttttggcggcg-3'

探针引物lt-3a：5'-bio-gcttttaaaccaattgttgg-3'

经过恒温扩增，最终形成两端带有fitc和生物素标记的核苷酸片段，滴加于试纸条上后，胶体金标记的fitc鼠单抗与核酸片段形成复合物，当扩散到检测线时，复合物被生物素配体捕获；未被生物素标记的核酸复合物质控线上被羊抗鼠抗体捕获，在质控线处显色。

3.交叉引物恒温扩增

反应体系：

将上述反应管分别在58℃、61℃、63℃、68℃进行反应50min，80℃2min灭活。选择最佳反应温度后，进行反应时间的优化，即在选择的最优反应温度下反应20min、30min、40min、50min、70min，80℃2min灭活。

4.扩增产物试纸条检测

取上述反应产物10μl，滴加至层析试纸条的吸收垫上，插入装有100μl层析缓冲液的1.5ml离心管中，静置3-5min，读取实验结果。

5.检测结果判定

当质控线显色，检测线也显色，则判定为阳性；

当质控线显色，检测线不显色，则判定为阴性；

当质控线不显色，则检测结果不成立。

实验结果结果表明(图1)，反应温度对扩增结果的影响不大，考虑到bst聚合酶活性最佳温度，扩增反应温度选择63℃；反应时间选择50min(图2)。

实施例2：交叉引物扩增检测的特异性检测

1.羊梨形虫基因组dna提取

取-20℃保存的莫氏巴贝斯虫临潭株阳性、莫氏巴贝斯虫河北株阳性、莫氏巴贝斯虫宁县株阳性、巴贝斯虫未定种新疆株阳性、绵羊泰勒虫阳性、尤氏泰勒虫阳性、梨形虫阴性的绵羊血液200μl用qiaampdnaminikit(qiagen,germany)进行的提取，具体操作步骤参照说明书进行。

2.交叉引物恒温扩增

反应体系：

将上述反应管分别在63℃进行反应50min，80℃2min灭活。

3.扩增产物试纸条检测

取上述反应产物10μl，滴加至层析试纸条的吸收垫上，插入装有100μl层析缓冲液的1.5ml离心管中，静置1min，读取实验结果。

4.检测结果判定

当质控线显色，检测线也显色，则判定为阳性；

当质控线显色，检测线不显色，则判定为阴性；

当质控线不显色，则检测结果不成立。

实验结果见图3，结果表明，本发明所使用的扩增引物组和检测探针对莫氏巴贝斯虫具有良好的特异性，与感染羊的其它梨形虫没有发生交叉反应。

实施例3：交叉引物扩增的灵敏度试验

1.莫氏巴贝斯虫裂殖子dna提取

取-80℃保存的纯化的莫氏巴贝斯虫临潭株裂殖子100μl用qiaampdnaminikit(qiagen,germany)进行的提取，具体操作步骤参照说明书进行。

2.基因组dna梯度稀释样品的制备

提取的莫氏巴贝斯虫裂殖子基因组dna样品用微量核酸测定仪进行测定(nanodrop2000，thermoscientific,usa)。浓度为20ng/μl，利用超纯水将基因组dna样品进行梯度稀释，依次为4ng/μl、800pg/μl，160pg/μl、32pg/μl、6.4pg/μl、1.28pg/μl、0.3pg/μl、0.06pg/μl、0.012pg/μl。

3.交叉引物恒温扩增

反应体系：

将上述反应管分别在63℃进行反应50min，80℃2min灭活。

4.扩增产物分析

取上述反应产物10μl，滴加至层析试纸条的吸收垫上，插入装有100μl层析缓冲液的1.5ml离心管中，静置3-5min，读取实验结果。

当质控线显色，检测线也显色，则判定为阳性；

当质控线显色，检测线不显色，则判定为阴性；

当质控线不显色，则检测结果不成立。

实验结果见图4，结果表明，本发明所使用的扩增引物组和检测探针对莫氏巴贝斯虫具有高的灵敏度，可以检测含虫体dna浓度0.06pg/μl的样品，相当50μl红细胞染虫率为0.00006％的基因组dna量。

实施例4：山羊或绵羊血液样品中莫氏巴贝斯虫的检测

1.血液基因组dna提取

采自甘肃省甘南藏族自治州的200份绵羊血液样本用qiaampdnaminikit(qiagen,germany)进行血液dna的提取，具体操作步骤参照说明书进行。

2.交叉引物恒温扩增

反应体系：

将上述反应管在58℃恒温扩增50min，80℃2min灭活。

4.扩增产物试纸条检测

取上述反应产物10μl，滴加至层析试纸条的吸收垫上，插入装有100μl层析缓冲液的1.5ml离心管中，静置3-5min，读取实验结果。

5.检测结果判定

当质控线显色，检测线也显色，则判定为阳性；

当质控线显色，检测线不显色，则判定为阴性；

当质控线不显色，则检测无效。

结果显示，在甘肃采集的200份绵羊基因组中，检测到3份(1.5％)莫氏巴贝斯虫感染的样本。这些结果与前期使用lamp、rlb和real-time方法调查的结果基本相一致。

序列表

<110>中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>一种莫氏巴贝斯虫检测试剂盒

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(置换引物lt-5a)

<400>1

gctaattgtagggctaatacaag23

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(置换引物lt-4s)

<400>2

cttgaatggaacatcgctaa20

<210>3

<211>38

<212>dna

<213>人工序列(交叉引物lt-2a1s)

<400>3

cgatgccttttggcggcgcgattcgcaagtttattatg38

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(探针引物lt-2a)

<400>4

cgatgccttttggcggcg18

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(置换引物lt-5a)

<400>5

gcttttaaaccaattgttgg20