一种检测葡萄糖-6-磷酸异构酶的试剂盒及试剂盒的使用方法与流程

本发明涉及酶检测
技术领域：
，具体涉及一种检测葡萄糖-6-磷酸异构酶的试剂盒及试剂盒的使用方法。
背景技术：
：葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose-6-phosphateisomerase,gpi；ec5.3.1.9)是一类具有多功能生物活性的天然蛋白质，它参与糖代谢的磷酸戊糖途径和糖酵解作用，催化葡萄糖6-磷酸(glucose6-phosphate,g6-p)和果糖-6-磷酸(fructose-6-phosphate,f-6-p)的相互转化，从而催化f-6-p异构化为g6-p。pgi具有多种功能：在细胞内，pgi在糖酵解和糖异生中其关键作用；在细胞外，pgi(又称为自分泌运动因子，autocrinemotilityfactor(amf))作为细胞因子，刺激细胞运动，并与肿瘤的发生和转移相关。现有技术中，主要是elisa抗原抗体检测葡萄糖6磷酸异构酶的含量，采用免疫标记吸附技术抗原抗体结合反应原理制成的诊断试剂盒，但是该试剂盒需要复杂的程序操作，如抗体的制备，抗体的标记，包被抗体聚苯乙烯微孔板的制备，得到检测结果需要较长的时间。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种检测葡萄糖-6-磷酸异构酶的试剂盒，采用本发明提供的试剂盒在6min20s～9min40s能够得知结果，缩短了检测时间。本发明提供了一种检测葡萄糖-6-磷酸异构酶的试剂盒，所述试剂盒中包括试剂1和试剂2，所述试剂1以tris缓冲液为溶剂，每升包括0.5～5mmol三磷酸腺苷、1～10mmol氧化型辅酶ⅰ、0.5～20g保护剂和0.5～5g防腐剂；所述试剂2以tris缓冲液为溶剂，每升包括1～10mmol氯化镁、50～500mmol果糖-6-磷酸、1～50ku葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、5～50g稳定剂和0.5～5g防腐剂；所述tris缓冲液的浓度为50～500mmol/l。优选的，所述试剂1的ph值为7.5～9。优选的，所述试剂2的ph值为7.5～9。优选的，所述保护剂包括聚氧乙烯十二烷基醚、聚乙二醇对异辛基苯基醚、聚乙二醇单月桂酸酯、4-壬基苯基-聚乙二醇、烷基聚烯烃基乙二醇醚和烷基聚乙烯乙二醇醚中的一种或多种。优选的，所述防腐剂包括山梨酸钾、亚硝酸钠、叠氮钠、pc300和苯甲酸钠中的一种或多种。优选的，所述稳定剂包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鳌合剂edta类、聚乙二醇、二糖类、多元醇和双甘肽中的一种或多种。优选的，所述二糖类包括山梨醇、甘露醇、蔗糖或海藻糖。优选的，所述多元醇包括乙二醇、丙三醇或丙二醇。本发明还提供了上述技术方案所述的试剂盒的使用方法，包括：将样品与试剂1混合后在35～42℃下孵育3～5min，得到第一孵育物；所述样品与试剂1的体积比为(1～5):(220～260)；将所述第一孵育物与试剂2混合后在35～42℃下孵育50～70s，得到第二孵育物；所述试剂2与样品的体积比为(50～70):(1～5)；将所述第二孵育物在波长340nm处，读取吸光度值a1，2.5～3.5min后读取吸光度值a2，根据以下公式计算样品中葡萄糖-6-磷酸异构酶的含量；本发明提供了一种检测葡萄糖-6-磷酸异构酶的试剂盒的检测原理为：在磷酸葡萄糖异构酶(pgi)催化下，将果糖-6-磷酸转化为葡萄糖-6-磷酸。葡萄糖-6-磷酸在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的催化下脱氢，生成6-磷酸-葡萄糖酸，同时使nadp+还原成nadph。在340nm的波长下，一定的浓度范围内，吸光度的变化率与葡萄糖-6-磷酸异构酶的活性成正比。本发明实施例的结果显示：采用本发明提供的试剂盒在6min20s～9min40s能够得到检测葡萄糖-6-磷酸异构酶的结果，缩短了检测时间。附图说明图1为准确性实验中的实施例1和实施例2的比对结果，其中横坐标是实施例1测定40个血清样本的值，纵坐标为实施例2测定40个血清样本的值；图2为准确性实验中的实施例3和实施例2的比对结果，其中横坐标是实施例2测定40个血清样本的值，纵坐标为实施例3测定40个血清样本的值；图3为准确性实验中的实施例3和实施例1的比对结果，其中横坐标是实施例1测定40个血清样本的值，纵坐标为实施例3测定40个血清样本的值。具体实施方式本发明提供了一种检测葡萄糖-6-磷酸异构酶的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括试剂1和试剂2，所述试剂1以tris缓冲液为溶剂，每升包括0.5～5mmol三磷酸腺苷、1～10mmol氧化型辅酶ⅰ、0.5～20g保护剂和0.5～5g防腐剂；所述试剂2以tris缓冲液为溶剂，每升包括1～10mmol氯化镁、50～500mmol果糖-6-磷酸、1～50ku葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、5～50g稳定剂和0.5～5g防腐剂；所述tris缓冲液的浓度为50～500mmol/l。在本发明中，所述所述试剂1以tris缓冲液为溶剂，每升优选包括1～4mmol三磷酸腺苷、3～8mmol氧化型辅酶ⅰ、1～15g保护剂和0.5～5g防腐剂；更优选包括2～3mmol三磷酸腺苷、4～7mmol氧化型辅酶ⅰ、5～10g保护剂和1～4g防腐剂。本发明对所述试剂1在试剂盒中的放置量没有特殊限定，采用常规在试剂盒中放置试剂的量即可。在本发明中，所述试剂1的ph值优选为7.5～9，更优选为8～8.5。在本发明中，所述试剂2以tris缓冲液为溶剂，优选每升包括2～8mmol氯化镁、100～400mmol果糖-6-磷酸、5～40ku葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、10～40g稳定剂和0.5～5g防腐剂；更优选包括3～6mmol氯化镁、200～300mmol果糖-6-磷酸、10～30ku葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、20～30g稳定剂和0.5～5g防腐剂。本发明对所述试剂2在试剂盒中的放置量没有特殊限定，采用常规在试剂盒中放置试剂的量即可。在本发明中，所述试剂2的ph值优选为7.5～9，更优选为8～8.5。在本发明中，所述tris缓冲液的浓度为50～500mmol/l，优选为100～400mmol/l，更优选为200～300mmol/l。在本发明中，所述保护剂包括聚氧乙烯十二烷基醚、聚乙二醇对异辛基苯基醚、聚乙二醇单月桂酸酯、4-壬基苯基-聚乙二醇、烷基聚烯烃基乙二醇醚和烷基聚乙烯乙二醇醚中的一种或多种，所述多种具体为两种或两种以上。当所述保护剂为两种或两种以上时，各组分等质量混合。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。在本发明中，所述防腐剂包括山梨酸钾、亚硝酸钠、叠氮钠、pc300和苯甲酸钠中的一种或多种，所述多种具体为两种或两种以上。当所述防腐剂包括两种或两种以上时，各组分等质量混合。在本发明中，所述pc300的活性成分主要为2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。在本发明中，所述稳定剂包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鳌合剂edta类、聚乙二醇、二糖类、多元醇和双甘肽中的一种或多种，所述多种具体为两种或两种以上。当所述稳定剂为两种或两种以上时，各组分等质量混合。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。在本发明中，所述二糖类优选包括山梨醇、甘露醇、蔗糖或海藻糖。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。在本发明中，所述多元醇优选包括乙二醇、丙三醇或丙二醇。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。本发明还提供了上述技术方案所述的试剂盒的使用方法，包括：将样品与试剂1混合后在35～42℃下孵育3～5min，得到第一孵育物；所述样品与试剂1的体积比为(1～5):(220～260)；将所述第一孵育物与试剂2混合后在35～42℃下孵育50～70s，得到第二孵育物；所述试剂2与样品的体积比为(50～70):(1～5)；将所述第二孵育物在波长340nm处，读取吸光度值a1，2.5～3.5min后读取吸光度值a2，根据以下公式计算样品中葡萄糖-6-磷酸异构酶的含量；在本发明中，所述公式中的时间为检测所需的总时间。本发明将样品与试剂1混合后在35～42℃下孵育3～5min，得到第一孵育物；所述样品与试剂1的体积比为(1～5):(220～260)。在本发明中，所述样品优选为血清。本发明对所述血清的制备方法没有特殊限定，采用常规制备血清的方法即可。在本发明中，所述样品与试剂1混合后优选在37℃下孵育3.5～4.55min，得到第一孵育物。在本发明中，所述样品与试剂1的体积比优选为(1～5):(220～260)，更优选3:240。本发明将所述第一孵育物与试剂2混合后在35～42℃下孵育50～70s，得到第二孵育物；所述试剂2与样品的体积比为(50～70):(1～5)。在本发明中，所述第一孵育物与试剂2混合后优选在37℃下孵育60s，得到第二孵育物。该步骤发生的反应为：在磷酸葡萄糖异构酶(pgi)催化下，将果糖-6-磷酸转化为葡萄糖-6-磷酸；葡萄糖-6-磷酸在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的催化下脱氢，生成6-磷酸-葡萄糖酸，同时使nadp+还原成nadph。在本发明中，所述试剂2与样品的体积比优选为60:3。本发明将所述第二孵育物在波长340nm处，读取吸光度值a1，2.5～3.5min后读取吸光度值a2，根据上述公式计算样品中葡萄糖-6-磷酸异构酶的含量。在本发明中，在340nm的波长下和浓度范围内，吸光度的变化率与葡萄糖-6-磷酸异构酶的活性成正比。本发明在读取吸光度值a1，优选3min后读取吸光度值a2。在本发明中，所述校准品以tris缓冲液为溶剂，每升优选包括：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶1～50ku/l，牛血清白蛋白0.5～5g，叠氮钠0.05～5g；所述tris缓冲液的浓度优选为0.05～500mmol/l。下面结合具体实施例对本发明所述的一种检测葡萄糖-6-磷酸异构酶的试剂盒及试剂盒的使用方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。实施例1检测葡萄糖-6-磷酸异构酶的试剂盒，试剂盒中包括试剂1和试剂2；试剂1以双蒸水为溶剂，含有：tris100mmol/l，三磷酸腺苷2mmol/l，氧化型辅酶ⅰ5mmol/l，聚乙二醇对异辛基苯基醚20g/l，抗坏血酸0.005g/l和叠氮钠1g/l。试剂2以双蒸水为溶剂，含有：tris100mmol/l，无水氯化镁2mmol/l，果糖-6-磷酸100mmol/l，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶15ku/l，牛血清白蛋白5g/l和叠氮钠1g/l。实施例2检测葡萄糖-6-磷酸异构酶的试剂盒，试剂盒中包括试剂1和试剂2；试剂1以双蒸水为溶剂，含有：tris150mmol/l，三磷酸腺苷12mmol/l，氧化型辅酶ⅰ8mmol/l，聚氧乙烯十二烷基醚1g/l，谷胱甘肽0.1g/l和pc3000.5g/l。试剂2以双蒸水为溶剂，含有：tris150mmol/l，无水氯化镁5mmol/l，果糖-6-磷酸60mmol/l，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶12ku/l，聚乙二醇20g/l，海藻糖45g/l和pc3000.5g/l。实施例3检测葡萄糖-6-磷酸异构酶的试剂盒，试剂盒中包括试剂1和试剂2；试剂1以双蒸水为溶剂，含有：tris200mmol/l，三磷酸腺苷8mmol/l，氧化型辅酶ⅰ12mmol/l，聚乙醇单月桂酸酯5g/l，谷胱甘肽0.1g/l和叠氮钠2g/l。试剂2以双蒸水为溶剂，含有：tris200mmol/l，无水氯化镁5mmol/l，果糖-6-磷酸85mmol/l，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶12.5ku/l，甘露醇20g/l，海藻糖45g/l和叠氮钠1g/l。实施例4实施例1～3的试剂盒测定血清结果比对，评价其相关性：用不少于40个在检测浓度范围内的不同浓度的人源样品，每份样品按待测试剂(盒)操作方法分别检测。使用线性回归方程，两两计算得出相关性系数r。测定血清中的gpi浓度，单位为u/l。两种实施例之间两两比对。血清的制备：获得的血液不能抗凝，盛于离心管或可以离心的器皿中，静置或置37℃环境中促其凝固，待血液凝固后，将其平衡后离心(一般为3000rpm，离心5～10min)，得到的上清液即为血清，可小心将上清吸出(注意切勿吸出细胞成分)，分装备用。结果见表1和图1～3。表1gpi浓度检测结果根据表1可以得出，使用本发明方法的实施例1～3做准确性实验，使用线性回归方程，两两计算得出相关性系数r均≥0.99，相对偏差≦10％，证明本试剂结果准确，可靠。实施例5将实施例1～3的试剂盒进行重复性检测，重复性实验：用临床标本或质控血清测试试剂盒，重复测试10次，计算测量值的平均值和标准差(s)。按公式计算变异系数(cv)，要符合变异系数cv≤5％,相对偏差r≤10％的要求。结果见表2。要求质控浓度：靶值60u/l范围50-70u/l表2试剂盒重复性检测结果根据表2可以得出，本发明提供的试剂盒的重复性好。对实施例1～3的试剂盒进行线性范围检测，其中临床标本或者质控样本，高浓度样本将其值控制在800u/l，低浓度样本将其值控制在50u/l。用接近线性范围上限的高浓度样品和接近线性范围下限的低浓度样品，按示例混合成5个稀释浓度(xi)。分别测试试剂盒，每个稀释浓度平行测试3次，取其均值作为检测结果(yi)。以稀释浓度(xi)为自变量，以测定结果值(yi)为因变量求出线性回归方程。按公式计算线性回归的相关系数(r)，用稀释浓度(xi)代入线性回归方程，计算yi的估计值及yi实测值与估计值的相对偏差或绝对偏差。结果见表3。x为稀释倍数，比如样本号2低浓度样本0.75x,高浓度样本0.25x,意思就是低浓度样本：高浓度样本＝3:1的倍数关系进行稀释，得到样本号2，理论值为0.75*50+0.25*800＝237.5。表3实施例1～3的试剂盒进行线性范围结果根据表3可以得出，线性范围：在线性范围50～800u/l内，线性回归的相关系数r≥0.990，相对偏差不大于10％。实施例6将实施例1～3试剂盒中的试剂1和试剂2于37℃、100rpm下摇床，检测热破坏稳定性，结果见表4。表437℃的热稳定性结果天数实施例1(单位u/l)实施例2(单位u/l)实施例3(单位u/l)059.758.860.4159.858.161.2260.258.360.8359.557.762.4459.455.063.2559.958.864.1660.557.864.5760.860.165.0从表4中可以得出，试剂热稳定性良好，能长期运输和保质期长。将实施例1～3试剂盒中的试剂1和试剂2于4℃下开瓶检测试剂的稳定性，结果见表5。表54℃稳定性结果从表5中可以证明试剂1和试剂2开瓶稳定性良好，在试剂仓内开瓶使用，在15天内能保证各项指标符合要求。实施例7使用实施例1～3提供的试剂盒，采用常规方法测定样品中的rf和gpi结果见表6。表6葡萄糖-6-磷酸异构酶测定结果值与rf(类风湿因子)比对结果从表3中可以得出，gpi与rf有显著相关性。相关性系数r＝0.837。而与其他指标crp(c反应蛋白)，抗ccp(抗环瓜氨酸肽)相比均无特异性。类风湿关节炎病人的gpi活性明显高于健康人。实施例8回收实验：当所分析的试样组分复杂，不完全清楚时，向试样中加入已知量的被测组分，然后进行测定，检查被加入的组分能否定量回收，以判断分析过程是否存在系统误差的方法。将纯品的葡萄糖-6-磷酸异构酶加入到缓冲体系中，在加标实验中作为标准物质，单位u/l。表7标准物质测定结果标准物质编号标准物质测定值1475.992243.713120.16447.42539.96表8血清样品测定结果样品编号血清样品测定值单位u/l177.492112.873523.614287.33取50ul样品分别与50ul标准物质混匀，将样本和标准物质以1:1的关系进行稀释，稀释样品使用本发明实施例1～3提供的试剂盒进行测定，重复测定三次，计算平均值，结果见下表。通过回收率公式计算，确定试剂测定结果是否存在系统误差。测定结果见表9。表9测定结果从表6中可以得出，本葡萄糖-6-磷酸异构酶测定试剂检测样品中的葡萄糖-6-磷酸异构酶活性测定值结果准确，可靠，回收率平均值＝95.60％。回收率计算公式：p＝(c2－c1)/c3×100％式中:p为加标回收率；c1为试样浓度,即试样测定值,c1＝m1/v1；c2为加标试样浓度，即加标试样测定值,c2＝m2/v2；c3为加标量,c3＝c0×v0/v2：m＝c0×v0；m1为试样中的物质含量；m2为加标试样中的物质含量；m为加标体积中的物质含量；v1为试样体积；v2为加标试样体积,v2＝v1+v0；v0为加标体积；c0为加标用标准溶液浓度。由以上实施例可以得出，采用本发明提供的试剂盒在10min内检测时间能够得到检测葡萄糖-6-磷酸异构酶的结果，缩短了检测时间，降低了操作难度，使gpi检测更加普遍容易。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12