一种阿魏酸酯酶及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物工程领域，包括一种新型阿魏酸酯酶及其制备方法和应用，具体涉及到阿魏酸酯酶的宏基因筛选技术、新型阿魏酸酯酶基因的重组、表达，阿魏酸酯酶的制备及其应用。

背景技术：

阿魏酸酯酶(feruloylesterase，fae，ec3.1.1.73),也称肉桂酸酯酶，属于水解酶家族中的羧酸酯酶亚类，可以水解碳水化合物和酚酸之间的酯键，并释放酚酸，如阿魏酸(ferulicacid)、咖啡酸(caffeicacid)、香豆酸(p-coumalicacid)等，这些酚酸具有抗氧化、抗菌消炎、抗癌、抗血栓、抗动脉粥样硬化等良好的生理功能。由于阿魏酸酯酶的这种特性，使得它在食品、制药、化妆品、动物饲料、纸浆和造纸工业，以及生物燃料生产等方面有着广泛的应用前景。

阿魏酸酯酶来源广泛，存在于植物、真菌和细菌中。大多数分泌的阿魏酸酯酶来源于微生物，已发现的菌株有黑曲霉(aspergillusniger)，米曲霉(aspergillusoryzae)，梭菌(clostridiumthermocellum)、乳酸杆菌(lactobacilli)等。研究表明阿魏酸酯酶与其他水解酶(纤维素酶、木聚糖酶等)之间存在协同作用，能提高植物细胞壁降解率和木质纤维素的糖化效率。

现阶段阿魏酸酯酶的研究方法有发酵提取法和异源表达法。前者是以可溶性的羟基肉桂酸酯类化合物(如阿魏酸乙酯等)或者富含阿魏酸的农业原料(如甜菜浆、燕麦木聚糖)为底物和酶诱导剂，筛选产阿魏酸酯酶的活性菌株并从该菌株的发酵产物中得到阿魏酸酯酶，然而，这种阿魏酸酯酶活性响应度低，酶活通常小于1u/ml，极大限制了该类酶在工业中的广泛应用。后者是通过分子克隆的方法，重组阿魏酸酯酶基因使其能够在合适的异源宿主中表达(如大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、丝状真菌等)，经分离纯化得到重组酶。两种方法相比，异源表达法能够明显提高酶的产量和酶的活性。

传统的阿魏酸酯酶的筛选方法基于可培养微生物的纯化与筛选，以能否降解特定底物为筛选标准，但是自然界中有超过99％的微生物无法在实验室条件下培养，到目前为止自然界中仍然存在大量未发现的阿魏酸酯酶基因。随着生物信息学和分子生物学的发展，宏基因组学逐渐兴起，这种科学技术可广泛应用于不可培养微生物基因簇的发掘，有效绕开微生物传统分离培养的环节。宏基因组学技术不依赖于传统分离培养，直接提取环境中所有微生物的基因组dna，克隆到载体并转化至易培养的宿主，构建宏基因组文库。文库包含了样本中可培养和不可培养微生物的全部核酸信息，利用序列筛选或功能筛选的方式可从文库中获得有用的目标产物，如酶、抗生素和活性物质等。宏基因组技术已成功地从荷斯坦牛瘤胃、污泥渗滤液、白蚁肠道菌群及土壤等不同样本中鉴定了新型的阿魏酸酯酶，这充分说明宏基因组学是挖掘和发现新型阿魏酸酯酶的一种有力工具。进一步，生物信息学技术的发展为提高酯酶的性能提供了更多的可能，如同源建模来进行虚拟筛选，设计定点诱变实验或理性的改造氨基酸序列。

技术实现要素：

本发明基于土壤宏基因组策略筛选技术得到一种新型阿魏酸酯酶基因，并对该基因克隆及异源表达。重组酶对阿魏酸甲酯具有高酶活，具有良好的热稳定性，且含有阿魏酸酯酶中罕见的sxxk保守基序，并对氨苄青霉素有高水解活性等特点，使其在食品、制药与饲料等领域中具有应用潜力。

本发明采取的技术方案如下：

本发明的第一个目的是提供一种新型阿魏酸酯酶dlfae4，所述阿魏酸酯酶dlfae4的氨基酸序列如seqidno.2所示：

mtmdtifriasmtkavtsvaamqlveqgklqldqpvasvipafgelqvlvgfygdnpalrppasqatirhllthtsglgyeiwnadlgryqkvtntpgivsgqkaafrnplvadpgstwnygintdwlgrvveevggqtlgvymrrnifdplgmkdtgfseteeqkkrlvtvharqadgslapidfswpagrefengghglvstardylafvrmllnegtysgarvlradtvaqmrqnhigdllvtmmksanpamsndaeffpgmkkkhglgfvinteqwpgmravgsccwaglfnsfywfdptkriaaaifmqilpfadpkamevytafekavyasv

进一步的，所述阿魏酸酯酶dlfae4含有一个四肽sxxk基序，催化三联体由丝氨酸(s11)，组氨酸(h74)和天冬氨酸(d302)组成。该阿魏酸酯酶dlfae4酶催化三联体结构的确定方法为：催化三联体通过多序列比对分析及三维结构模拟得到，并通过定点突变技术确认。

具体的：确定丝氨酸(s11)，组氨酸(h74)和天冬氨酸(d302)作为突变位点，构建相应的突变子；依据各自的突变位点设计定点突变引物，以pet-dlfae4为扩增模板，进行全质粒pcr，将突变引入目的片段中，挑取克隆子测序，经序列分析及活性验证确认突变位点；所述定点突变引物为：

s11a-f:5’-cgtatcgcggcgatgacgaaagcggtcacatc-3’(seqidno.5)

s11a-r:5’-cgtcatcgccgcgatacgaaagatcgtatcca-3’(seqidno.6)

h74a-f:5’-ctgctgactgccacctcgggactcggctac-3’(seqidno.7)

h74a-r:5’-tcccgaggtggcagtcagcaggtggcgaa-3’(seqidno.8)

d320a-f:5’-ctactggtttgctccgaccaaacgtatcgctg-3’(seqidno.9)

d320a-r:5’-gtttggtcggagcaaaccagtagaagctgt-3’(seqidno.10)

本发明的第二个目的是提供编码前述新型阿魏酸酯酶dlfae4的基因dlfae4，所述基因dlfae4的核苷酸序列如seqidno.1所示：

atgacgatggatacgatctttcgtatcgcgtcgatgacgaaagcggtcacatcagtagcagcgatgcagttggtcgaacaaggcaagctgcaactcgaccaaccggtcgccagtgtgattccggcatttggcgagctgcaagtgttggtgggattttacggtgataatccagcactccgtccacccgcgtcccaagccactattcgccacctgctgactcacacctcgggactcggctacgagatttggaatgctgatctcggcaggtatcagaaagtgacaaacacgcctggtatcgtttccggccagaaggcggcgttccgcaatccgttagtggcagaccccggctcgacgtggaactacggaattaacaccgactggcttggccgcgtggtcgaagaagtgggtgggcaaacgctcggtgtgtatatgcggcgtaacatcttcgacccgctcgggatgaaagacactggcttcagcgaaaccgaagagcagaaaaaacgcctggtgacagtccatgcgcgtcaggcagacgggtcacttgcgccaatcgacttttcgtggccggcaggcagagagttcgaaaatggcggtcacggcttggtttccacggcacgtgactacctagcgttcgtgagaatgctcctgaatgaaggaacgtatagtggagctcgggtgttgcgtgcggatacagtcgcgcaaatgcggcagaatcacatcggtgatctgctggtgaccatgatgaagtctgcgaacccggcgatgagcaacgacgccgaattctttcccggtatgaagaagaaacacggcctgggctttgtgatcaacaccgagcaatggccgggtatgcgtgcagtaggaagttgttgctgggctggcctattcaacagcttctactggtttgatccgaccaaacgtatcgctgcggcgatctttatgcaaatcctgccgttcgctgatccaaaagcaatggaagtgtacaccgcgttcgagaaggcggtgtatgcgagtgtatga

进一步的，seqidno.1所述的核苷酸序列存在于可培养微生物中和/或不可培养微生物中。

含有上述编码阿魏酸酯酶dlfae4的基因dlfae4的表达盒、重组载体、转基因细胞系和转基因重组菌也在本发明的保护范围内。

本发明的第三个目的是提供前述编码新型阿魏酸酯酶的基因dlfae4的宏基因组学功能性筛选方法，包括以下步骤：

s1：提取及纯化土壤总dna，构建cosmid宏基因组文库；

s2：功能性筛选阳性克隆子；

s3：采取亚克隆策略及生物信息学分析获得编码阿魏酸酯酶的基因dlfae4。

进一步的，所述s1具体步骤为：采用ctab抽提法提取土壤总dna(样品来自表层土壤5-10厘米)，利用电泳纯化土壤总dna，利用cosmid(epicenter，usa)试剂盒构建宏基因组文库；按照试剂盒说明，土壤dna经末端修复酶修复后与pweb载体连接，经λ-噬菌体包装后侵染大肠杆菌e.coliepi100，构建文库；将文库以4000～6000(优选大约5000)个克隆子为单位分装，加入15％甘油贮藏，以备筛选；

所述s2具体步骤为：以阿魏酸乙酯作为筛选底物，取适量稀释后的文库菌液进行涂布，经培养后，观察筛选平板上透明圈的产生情况；挑取产透明圈的克隆子，将其接种于含有阿魏酸甲酯的lb液体培养基中过夜摇菌，取部分发酵液上清进行hplc分析确认阿魏酸酯酶活性；

所述s3具体步骤为：提取阳性克隆子质粒，利用sau3ai进行部分酶切，电泳后回收1-5kb大小的dna片段，将其连接至具有相同酶切位点的puc118载体上并转化至大肠杆菌dh5α；使用相同的底物平板筛选法筛选阳性亚克隆，经测序及orffinder在线分析工具预测该酶的开放阅读框；经分析后确认筛选得到seqidno.1所示的阿魏酸酯酶编码基因dlfae4。

本发明的第四个目的是提供一种重组阿魏酸酯酶dlfae4的制备方法，培养含有上述编码阿魏酸酯酶dlfae4的基因dlfae4的转基因重组菌，经iptg诱导，从培养物中分离，镍柱纯化得到所述重组阿魏酸酯酶dlfae4。

优选的，含有所述编码阿魏酸酯酶dlfae4的基因dlfae4的转基因重组菌的构建方法为：采用特异性引物对，扩增所述的阿魏酸酯酶基因dlfae4，所述引物对包括以下两条序列：

上游引物fae-f/ncoi:5’-catgccatggatgacgatggatacg-3’(seqidno.3)

下游引物fae-r/xhoi5’-ccgctcgagtacactcgcatacacc-3’(seqidno.4)

其具体步骤为：利用如seqidno.3、seqidno.4所示的特异性引物对，以s2中筛选的阳性克隆子质粒为模板扩增如seqidno.1所示的阿魏酸酯酶基因dlfae4，pcr扩增产物经ncoi和xhoi双酶切，与相同酶切线性化的表达载体pet-28a(+)连接，构建得到重组表达载体pet-dlfae4；将重组表达载体pet-dlfae4转化至宿主菌种大肠杆菌bl21(de3)，筛选阳性转化子即为含有编码阿魏酸酯酶dlfae4的基因dlfae4的转基因重组菌。

本发明的第五个目的是提供前述新型阿魏酸酯酶dlfae4在降解内酰胺底物中的应用。优选的，所述内酰胺底物为氨苄青霉素、青霉素和头孢唑林等。本发明首次发现新型阿魏酸酯酶可以水解氨苄青霉素、青霉素和头孢唑林等多种内酰胺类抗生素。

本发明的第六个目的是提供前述新型阿魏酸酯酶dlfae4在降解植物木质纤维素中的应用。优选的，在纤维素酶的存在下，阿魏酸酯酶dlfae4能够显著提高从植物木质纤维素中释放阿魏酸的量。研究表明，在纤维素酶的存在下，阿魏酸酯酶dlfae4可明显提高从去淀粉麦麸中释放阿魏酸的量。阿魏酸酯酶与纤维素酶联合作用于植物(如麦麸等)，可提高植物木质纤维素的水解率并释放出高价值的阿魏酸。

本发明的第七个目的是提供前述新型阿魏酸酯酶dlfae4在食品工业、制药工业、造纸工业和饲料工业中的应用。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种来源于土壤宏基因文库的阿魏酸酯酶基因，其核苷酸序列和氨基酸序列如seqidno.1和seqidno.2所示。其氨基酸序列含有一般阿魏酸酯酶中极为罕见的sxxk保守基序，将该酯酶基因插入到质粒pet-28a(+)后，转化至大肠杆菌bl21

(de3)中实现异源表达。

纯化后的重组酶分子量为38.3kda。dlfae4可以水解阿魏酸甲酯、咖啡酸甲酯、芥子酸甲酯和对香豆酸甲酯，其中对阿魏酸甲酯的催化能力最强(酶活为123.78u/mg)。对dlfae4的酶学性质研究表明该酶的最适反应ph8.6，最适反应温度50℃，具有良好的热稳定性，在60℃下孵育3h仍然具有50％残余活性。根据氨基酸序列相似性分析，将dlfae4鉴定为第ⅷ族酯酶。dlfae4还对氨苄青霉素具有高水解活性(酶活为35.78u/mg)。定点诱变实验表明dlfae4的催化三联体由丝氨酸(s11)，组氨酸(h74)和天冬氨酸(d302)组成，三者中任何氨基酸的突变都会导致dlfae4失去催化能力。

在纤维素酶的存在下，dlfae4可明显提高从去淀粉麦麸中释放阿魏酸的量。本发明的新型阿魏酸酯酶，由于其特有的活性及酶学特性，使其可应用于饲料、造纸、食品、制药等领域。

附图说明

图1.实施例1中土壤宏基因文库中产阿魏酸酯酶的平板初筛。

图2.实施例1中阳性克隆子发酵液高效液相色谱图(a：阿魏酸对照分析品；b：克隆子发酵液)。

图3.实施例2中阿魏酸酯酶的sds-page蛋白分析图谱。

m：蛋白marker；1：阴性对照；2：未诱导粗酶液；3：诱导后粗酶液；4：纯化后的dlfae4。

图4.实施例3中阿魏酸酯酶最适ph及ph稳定性与最适温度及热稳定性折线图(a，ph对dlfae4活性的影响；b，dlfae4的ph稳定性；c，温度对dlfae4活性的影响；d，dlfae4的温度热稳定性)。

图5.实施例3中金属离子、有机试剂和表面活性剂对阿魏酸酯酶活性的影响(a，金属离子对dlfae4活性的影响；b，有机试剂对dlfae4活性的影响；c，表面活性剂对dlfae4活性的影响)

图6.实施例3中阿魏酸酯酶dlfae4的系统发育树。

图7.实施例4中阿魏酸酯酶dlfae4的多序列比对。

图8.实施例4中阿魏酸酯酶dlfae4的三维结构模拟图。

图9.实施例6中阿魏酸酯酶dlfae4降解麦麸柱状图(a，麦麸经10u的dlfae4处理；b，麦麸经100u的木聚糖酶处理；c，麦麸经100u的纤维素酶处理；d，麦麸经100u的果胶酶处理，a-e，表示存在显著差异，p<0.05)。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步阐述本发明。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。

实施例1：土壤宏基因组文库的构建、阳性克隆子的筛选及相应阿魏酸酯酶基因的鉴定

土壤宏基因组文库的构建：称取土壤样品10g，加入ctab抽提液，37℃振摇混匀培养并振荡混匀培养45min。组分中加入适量溶菌酶和蛋白酶k，裂解细胞及除去蛋白。加入2.5ml20％sds(g/100ml)，65℃条件下水浴2h，再加入预冷的氯仿3ml，混匀后离心收集上清。加入等体积预冷的苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1体积比)溶液，颠倒混匀后离心，取上层水相加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1体积比)，再次离心，取水相加入0.6倍体积的预冷异丙醇，室温水浴醇沉1h，离心收集沉淀。最后用70％乙醇清洗沉淀2次，吹干，te缓冲液溶解粗dna。将提取的粗dna使用1％的琼脂糖凝胶(不含eb)，25v电泳11h。割下大小在30-40kb胶条，放入装有1×tae的透析袋中，100v电泳7-8h，收集洗脱液超滤浓缩，异丙醇醇沉，用少量tris-hcl重溶dna并测浓度。依据cosmid试剂盒方法构建土壤宏基因文库。将获得的dna片段经过末端修复变成平末端，然后经过5'-磷酸化、大小筛选，从低融点琼脂糖凝胶回收。将大小选定的dna连接到pweb载体上。用试剂盒附带的高效maxplax^tmλ噬菌体包装蛋白进行包装，接种到大肠杆菌epi100细胞中。菌液离心浓缩均匀涂布在氯霉素抗性的平板上，倒置过夜培养，计算克隆子，并以每管约5000个克隆子为一个亚库，加入15％甘油贮藏，-80℃保种。

阳性克隆子的筛选：利用平板法和高效液相色谱法筛选阳性克隆子。制备阿魏酸酯酶筛选平板。向lb固体培养基中添加阿魏酸乙酯(终浓度为1.5mg/ml)，氨苄青霉素(终浓度为100μg/ml)，摇匀，在超净台中倒平板。每块筛选平板上涂布已活化的cosmid文库菌液，37℃培养1天，观察菌落周围透明圈的形成(图1)。

初筛后将产透明圈的克隆子接种至5mllb液体培养基(阿魏酸甲酯1mg/ml，氨苄青霉素100μg/ml)发酵，发酵条件为37℃，24h，转速为180r/min。发酵完成后，取过膜后的发酵液进行高效液相色谱检测。色谱条件如下：采用zorbaxsb-c18色谱柱，紫外检测波长320nm，梯度洗脱，流动相为有机相(甲醇)和水相(1％v/v冰醋酸)，柱温30℃，进样量20μl，流速为1ml/min。发酵液中检测到降解产物阿魏酸，表明已筛选到具有阿魏酸酯酶活性的阳性克隆子(图2)。

提取阳性克隆子质粒，利用稀释1000倍的sau3ai对阳性克隆子质粒进行部分酶切，酶切体系酶切体系(100μl)为：sau3ai12μl，10×hbuffer10μl，0.1％bsa(g/100ml)10μl，dna5μg，反应时间10min。将酶切产物进行电泳，割胶回收1-5kb大小的dna片段。将回收片段和具有相同酶切位点的puc118载体按照10:1的摩尔比例混合，加入t4dna连接酶，16℃连接12h。将10μl连接产物加入100μl大肠杆菌dh5α感受态细胞，冰上孵育30min，42℃水浴热激45s，静置5min后加入800μllb液体培养基孵育1h(37℃，150rpm)。将菌液离心(4000×g，1min)，去掉上清液800ul后将菌体进行重悬，全部涂于lb平板(阿魏酸乙酯1.5mg/ml，氨苄100μg/ml)，37℃过夜培养，产透明圈的转化子即为含有阿魏酸酯酶的阳性克隆子。对其进行测序，并利用orffinder在线分析工具预测该酶的开放阅读框，分析后确认阿魏酸酯酶编码基因dlfae4。

实施例2：阿魏酸酯酶基因的分子克隆及表达纯化

阿魏酸酯酶基因的分子克隆：利用以下引物扩增阿魏酸酯酶基因dlfae4fae-f/ncoi:5’-catgccatggatgacgatggatacg-3’(seqidno.3)和fae-r/xhoi5’-ccgctcgagtacactcgcatacacc-3’(seqidno.4)(ncoi和xhoi的酶切位点用下划线标注)。pcr反应体系(50μl)：超纯水20μl，2×taqmastermix25μl，上下游引物(10μm)各2μl，dna模板1μl(实施例1中制备的阳性克隆子质粒dna)。pcr反应条件：95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。将pcr产物电泳，割胶回收，得到纯化的阿魏酸酯酶基因pcr产物。pcr产物进行双酶切，酶切时间3h。酶切体系(100μl)为：ncoi5μl，xhoi5μl，10×kbuffer10μl，0.1％bsa10μl，dna5μg，无菌水。割胶回收得到纯化的酶切片段。pet-28a(+)质粒进行双酶切，酶切时间5h。酶切体系(100μl)为：ncoi5μl，xhoi5μl，10×kbuffer10μl，0.1％bsa10μl，dna5μg，无菌水。割胶回收得到纯化的酶切载体。将经过双酶切的dna片段和pet-28a(+)载体按照10:1的摩尔比例混合，加入t4dna连接酶，16℃过夜连接。将10μl连接产物加入100μl大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，冰上孵育30min，42℃水浴热激60s，后加入800μllb液体培养基孵育1h(37℃，150rpm)。将菌液离心(4000×g，1min)，去掉上清液800ul，剩余培养基将菌体进行重悬，涂布于lb平板(阿魏酸乙酯1.5mg/ml，卡那霉素50μg/ml)，37℃培养1天，产透明圈的转化子即为重组成功的表达菌株。对其进行测序，测序结果显示与dlfae4的核苷酸序列(如seqidno.1所示)一致，并将已整合dlfae4基因的pet-28a(+)质粒命名为pet-dlfae4。

阿魏酸酯酶基因的表达纯化：将重组表达菌株，接种至lb液体培养基(阿魏酸甲酯1mg/ml，卡那霉素50μg/ml)中，37℃过夜培养。取菌液，以1％接种量加入到150ml的lb液体培养基中(阿魏酸甲酯1mg/ml，卡那霉素50μg/ml)，于37℃，180rpm培养至od600＝0.6-0.8，加入终浓度为0.5mm的iptg，16℃，12h，180rpm。离心收集发酵后的菌液。根据ni-nta纯化树脂预装柱(sangon，china)的使用说明处理大肠杆菌菌体，步骤如下：缓冲液重悬，超声破碎，留上清液作为粗酶液，将粗酶液过ni-nta纯化树脂预装柱进行洗脱纯化。洗脱后的蛋白通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测分析(图3，图中m：蛋白marker；1：阴性对照；2：未诱导粗酶液；3：诱导后粗酶液；4：纯化后的dlfae4)。

实施例3：阿魏酸酯酶dlfae4的酶学性质表征

酶活测定：取1mlph8.6的gly-naoh缓冲液，分别加入5μmol的阿魏酸甲酯溶液，加入3μl重组酶，50℃下反应，利用hplc测定320nm下的底物降解情况。

酶活定义：50℃、ph8.6的反应条件下，每分钟降解阿魏酸甲酯生成1μmol阿魏酸所需酶量定义为1个酶活力单位(u)。

最适ph及ph稳定性分析：在37℃条件下，测定不同ph(3.0-11.0)条件下的酶活力，根据酶活大小确定酶的最适ph(图4a)。将3μl重组酶分别加入不同ph的缓冲液中，4℃孵育3h，测定剩余酶活，确定酶的稳定性(图4b)。

最适温度及热稳定性：在ph8.0条件下，测定不同温度(10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃)条件下的酶活力，确定该酶催化最适温度(图4c)。将酶液分别放置于30℃、40℃、50℃、60℃水浴中4h，期间每隔1h测定残余酶活，确定该酶的热稳定性(图4d)。

金属离子、有机溶剂和表面活性剂对阿魏酸酯酶dlfae4活性的影响：反应体系内分别加入1mm的cu²⁺,fe³⁺,ca²⁺,zn²⁺,mg²⁺,mn²⁺,co²⁺，10％的甲醇(methanol)、乙醇(ethanol)丙酮(acetone)、异丙醇(isopropanol)、二甲基亚砜(dmso)，10mm、十二烷基硫酸钠(sds)、十六烷基三甲基溴化铵(ctab)、乙二胺四乙酸(edta)、1％v/vtween80、tritonx-100，在最适条件下测定酶活，以不加任何试剂的反应体系作为对照(图5)。

底物特异性及酶催化动力学分析：基于酶活测定方法及最适条件下，比较该酶对不同底物的水解能力，包括阿魏酸甲酯(mfa)、咖啡酸甲酯(mca)、对香豆酸甲酯(mpca)、芥子酸甲酯(msa)，并计算其相关动力学参数。dlfae4对底物的催化能力：mfa>mpca>msa>mca(表1)。

表1dlfae4的底物特异性及相关动力学参数

系统发育树分析：将dlfae4及其他已知的酯酶通过mega6.0软件构建系统发育树。酯酶分为八个亚族ⅰ-ⅷ族，dlfae4与第ⅷ族酯酶位于同一个进化分支上，表明dlfae4归于第ⅷ族酯酶(图6)。

实施例4：阿魏酸酯酶dlfae4的生物信息学分析及催化三联体验证

多序列比对分析：利用程序clustalx2对dlfae4及其同源序列进行多序列比对。

如图7所示，表明dlfae4含有一个罕见的四肽sxxk基序，与其他阿魏酸酯酶的保守五肽基序gxsxg不同。其中，残基s11位于四肽基序中发挥亲核试剂的作用，残基lys14构成氧离子洞，s11与高度保守的h74和d302构成了阿魏酸酯酶中的催化三联体。

三级结构预测：利用在线工具swiss网站进行阿魏酸酯酶三维结构模拟。以4ivk为模板进行同源建模，预测dlfae4三级结构。如图7所示，dlfae4推测的催化三联体用球棍模型标出。

催化三联体验证：设计特异性引物，确定s11、h74和d302作为突变位点，构建相应的突变子。以pet-dlfae4为扩增模板，进行全质粒pcr。依据各自的突变位点设计特异性引物，通过引物将突变引入目的片段中。引物序列如表3所示，标有下划线部分为互补区域，粗体的三个核苷酸即为编码突变后的氨基酸。定点突变pcr反应体系(50μl)：超纯水20μl，2×high-fidelitymastermix25μl，上下游引物(10μm)各2μl，dna模板1μl。pcr反应程序：98℃2min；98℃10s，62℃10s，72℃1min，10个循环；98℃10s，62℃1min，72℃2min，10个循环；98℃10s，62℃10s，72℃3min，10个循环；72℃10min。将pcr产物电泳，割胶回收目标片段，测定浓度。按照试剂盒说明，构建突变质粒，对线性化pcr产物进行重组，构建突变质粒。其中，连接体系(10μl)：线性载体50ng，2×sosoomix5μl，ddh2o。线性载体重组反应条件：50℃反应25min。将连接好的10μl突变质粒加入至100μl大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，冰上孵育30min，42℃水浴热激90s，后加入800μllb液体培养基孵育1.5h(37℃，150rpm)。将菌液离心(4000×g，1min)，去掉上清液800ul，剩余培养基将菌体进行重悬，涂布于lb平板(卡那霉素50μg/ml)，37℃培养12h，转板至含有底物阿魏酸乙酯1.5mg/ml，卡那霉素50μg/ml的lb平板上，观察有无透明圈产生。挑取克隆子测序，经序列分析及活性验证确认突变位点。

表2pet-dlfae4的定点突变引物

实施例5：阿魏酸酯酶dlfae4对内酰胺底物的降解反应

实验分为氨苄青霉素组；青霉素组；头孢唑林组，使用分光光度法测定dlfae4对各个底物的酶动力学常数，各底物分别使用ph8.6的gly-naoh缓冲液配置成1-200μm浓度梯度溶液，先使用uv-2102pc制作各底物的标准曲线，其中氨苄青霉素和青霉素的检测波长为225nm，头孢唑林的检测波长为273nm。

取重组酶3ul加入含不同浓度底物的反应体系中，于50℃反应3min后，迅速取100μl测定吸光度，计算底物消耗量。

酶动力学常数如表3所示，三种内酰胺底物均可以被dlfae4降解，其中对氨苄青霉素的降解活力最高。

表3dlfae4降解内酰胺底物的酶动力学参数

实施例6：阿魏酸酯酶dlfae4在降解麦麸方面的应用

将麦麸粉碎后浸没在0.25％的乙酸钾溶液(g/100ml)中，用90℃高温水浴20min，用热水反复洗涤后尽可能去除淀粉，烘干至恒重，过筛获取去淀粉麦麸。

将实验分为：未经处理组；麦麸经10u的dlfae4处理组；麦麸经100u的木聚糖酶处理组；麦麸经100u的纤维素酶处理组；麦麸经100u的果胶酶处理组；麦麸经10u的dlfae4和100u的木聚糖酶共同处理组；麦麸经10u的dlfae4和100u的纤维素酶共同处理组；麦麸经10u的dlfae4和100u的果胶酶共同处理组。

各组称取去淀粉麦麸100mg，在gly-naoh缓冲液中加入单一酶或酶组合，反应体系1ml，37℃下水浴反应10h，每过1小时进行颠倒混匀一次。将反应液以4000×g离心5min，取上清过膜，利用hplc检测阿魏酸。

结果如图9所示，重组酶dlfae4与纤维素酶协同作用于去淀粉麦麸时，阿魏酸释放量明显增加，即在纤维素酶的存在下，阿魏酸酯酶dlfae4能够明显提高从去淀粉麦麸中释放阿魏酸的量。

序列表

<110>南京农业大学

<120>一种阿魏酸酯酶及其制备方法和应用

<160>10

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1017

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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