一种与猪生长速度相关的SNP分子标记及其应用的制作方法

本发明涉及分子遗传学领域，特别是涉及与猪生长速度相关的snp分子标记及该分子标记在育种中的应用。
背景技术：
：猪肉长久以来一直着占据我国肉类消费总量的60％以上，是畜牧业生产的主体。随着人们的环保意识逐渐增强，国内环保政策逐步收紧，养猪业的成本也逐步攀升；较快地生长速度对应着高生产效率，因此生长速度是猪遗传改良工作中的重要目标性状。而猪种生长速度受到多种转录因子、表观遗传等的复杂调控，一直是遗传育种领域研究的难题之一。传统的育种主要利用表型来推断基因型、估计育种值，其耗时长、成本高，且不能选择基因型纯合的个体。分子标记辅助选择技术可以对不同发育时期的个体、器官甚至细胞作检测，直接反映dna的序列差异，同时标记位点丰富，遍及整个基因组，多态性高，遗传稳定，不受环境及基因表达与否的限制。该遗传改良方法经济、快捷而有效，是对传统育种你的必要补充。我国的地方猪种资源丰富且各具特色，为世界猪种基因库提供了宝贵资源，也为研究重要经济性状的基因和分子标记提供良好的材料。藏猪是我国特有的高原型猪种，是我国目前已知的小型猪品系中体重最轻的之一，母猪出生重0.4～0.6kg，肥育猪增重缓慢，12月龄体重为20～25kg，24月龄35～40kg，生后2～3年体重才40～50kg；但同时具有耐寒、耐粗饲，肉质鲜嫩味美，高钙低脂，营养丰富，绿色健康等特点，具有较高的保种与培育价值。乌金猪是贵州的柯乐猪，云南富源的大河猪，昭通市的昭通猪和四川省的凉山猪的统称。乌金猪体型中等，成年体重公猪重48.2kg，母猪重69.5kg。生长速度慢，肥育期日增重200g左右，低于杜长大等商品化品种。同时又具有耐粗饲，优质健壮，适应高原低氧生态环境，脂肪沉积高，瘦肉率低肉质鲜美等特点。以上不同生长速度的藏猪和乌金猪是研究生长速度相关基因的良好材料。随着分子数量遗传学及分子生物技术的不断发展，目前已发现了一定数量影响猪生长速度的功能基因与分子标记，并应用在猪的育种工作中。如张浩等人发现猪lxrα基因第五外显子201bp位点为aa型的个体生长速度显著高于cc型个体(张浩，张博，徐艾诗，等.与猪生长速度相关的snp标记及其应用，cn104404133a[p].2015.)；vanlaere等人探明了igf2基因调控猪肌肉的生长，其第三外显子3072处的一个g/a突变可影响商业种群10-20％的产肉量，其中aa型为生长速度的优势基因型(vanlaereas,nguyenm,braunschweigm,etal.aregulatorymutationinigf2causesamajorqtleffectonmusclegrowthinthepig.[j].nature,2003,425(6960):832-836.)；fan等人发现了fto基因与猪的肌内脂肪含量及生长速度相关。其中，5个snp的单倍型2(-cttgg-)个体生长速度最快(fanb,duzq,rothschildmf.thefatmassandobesity-associated(fto)geneisassociatedwithintramuscularfatcontentandgrowthrateinthepig.[j].animalbiotechnology,2009,20(2):58-70.)；zhang等人同样发现了与猪生长速度显著相关的snp标记，ghsr基因启动子区的c-1595a位点的cc型个体生长速度显著快于ca型个体(zhangb,shangp,taoz,etal.effectofasinglenucleotidepolymorphisminthegrowthhormonesecretagoguereceptor(ghsr)geneongrowthrateinpigs[j].gene,2017,634.)。但目前仍缺少功能明确、效应显著且可直接应用于育种中的分子标记。trpc1(transientreceptorpotentialcationchannelsubfamilycmember1)基因编码的膜蛋白可形成非特异性离子通道，通过让阳性离子尤其是钙离子通过细胞膜而调节肌肉的生成和功能行使。目前对trpc1基因的研究多见于人和小鼠，发现该基因主要参与调控成肌细胞的分化与迁移，影响肌管发育。技术实现要素：本发明的目的在于提供与猪生长速度相关的snp分子标记。本发明的第二个目的是提供该snp分子标记在选育生长速度快的猪种中的应用。申请人在3000多头杜洛克猪群体gwas(全基因组关联分析，genome-wideassociationstudies，gwas)的结果中发现trpc1基因与猪的肌肉生长发育显著相关。通过对不同体型和生长速度的猪(生长速度由慢到快分别为藏猪、乌金猪、大约克猪)胚胎期60日龄的背最长肌进行转录组分析，结果显示trpc1基因在大约克和乌金猪中的表达量均极显著高于藏猪，qpcr检测结果也与此一致。目前仍未发现trpc1基因多态位点与猪生长速度的关联分析报道。因此，需要对该基因进行功能snp位点的筛选和鉴定，以直接应用于猪的选育改良。本发明将trpc1基因作为影响猪生长速度的候选基因，采用测序技术筛选不同类型猪群体间差异的snp位点，鉴定snp位点与猪生长速度的相关性，获得了影响猪生长速度的snp位点及基因型效应。本发明发现的与猪生长速度相关的snp分子标记有2个，分别位于trpc1基因(nc_010455.5)起始5’侧翼区密码子上游第1763bp处，记为c-1763t；位于猪trpc1基因起始密码子上游1604bp处，记为c-1604t。c-1763t中，c为与生长速度快相关的优势等位基因；c-1604t中，c为与生长速度快相关的优势等位基因。前述两个snp位点在基因组上完全连锁，只需检测c-1763t位点的基因型，就可得到c-1604t位点基因型。本发明所述snp分子标记中，c-1763t位于seqidno.1所示的核苷酸序列中第380位碱基；其可通过核苷酸序列如seqidno.2-3所示的引物对扩增获得；c-1604t位于seqidno.1所示的核苷酸序列中第539位碱基，其可通过核苷酸序列如seqidno.2-3所示的引物对扩增获得。本发明提供了一种用于鉴定生长速度快的猪的特异性引物对，其核苷酸序列如seqidno.2-3所示。含有上述特异性引物对的试剂盒属于本发明的保护范围。本发明提供了上述的snp分子标记、用于扩增snp分子标记的特异性引物对或含有该特异性引物对的试剂盒的以下任一所述的应用：(1)在猪的分子标记辅助选择育种中的应用；(2)在鉴定生长速度快的猪种中的应用；(3)在检测所述snp分子标记基因型中的应用。所述应用具体包括以下步骤：取待测猪基因组dna，用seqidno.2-3所示的引物进行pcr扩增，对扩增产物进行测序，检测待测样品猪在所述snp位点的基因型；基因型为cc的是生长速度快的个体，选择基因型为cc的个体可以加快生长速度选育的遗传进展。本发明的一个实施例的具体操作为：从猪耳组织中提取基因组dna，根据猪trpc1基因5'侧翼区序列设计引物，得到引物序列如下：正向引物f：5'-ctagagttgtgatgggtcttc-3'(seqidno.2)，反向引物r：5'-gctcattgtaaatctgtggc-3'(seqidno.3)。用所示的引物在猪基因组dna中进行pcr扩增，pcr产物纯化后测序。采用chromaspro软件打开测序文件，并于序列表seqidno.1所示核苷酸序列比对分析，判定c-1763t位点基因型，若该位点为单一的c峰，则判定为cc基因型；若该位点为单一的t峰，则判定为tt基因型；若该位点为c和t套峰，则判定为ct基因型。本发明还提供了猪背最长肌trpc1基因在促进肌肉快速生长中的应用。本发明证明了上述snp分子标记的cc基因型启动子上调猪trpc1基因的表达。本发明的有益效果在于：本发明提供的snp分子标记可以进行猪的生长速度选育；并且分子标记不受猪的年龄、性别、品种等限制，可以用于猪的早期选育，甚至在猪刚出生时就可准确地进行选留，可大大缩短世代间隔，加快猪的育种进展，提高群体的生长速度。本发明通过检测snp分子标记能够早期、快速、准确、低成本、有效的预测猪生长速度，在猪种改良方面具有广阔的应用前景，并能够取得优异的经济价值。附图说明图1为猪背最长肌中trpc1的mrna表达情况。tp代表藏猪，wj代表乌金猪，lw代表大约克猪。图2为猪trpc1基因5’侧翼区不同引物梯度退火。a-d分别代表第1-4对引物，marker为dm2000plus，退火温度从左至右分别为60，59.4，58.2，56，23.3，51.2，49.7，49℃。图3为猪trpc1基因5’侧翼区c-1763t位点的测序峰图。图4为猪trpc1基因启动子荧光素酶活性。control:pgl3-basic和prl-tk共转染c2c12细胞；cc和tt分别表示cc和tt纯合个体的启动子连接到pgl3-basic上，与prl-tk共转染细胞。图5为猪trpc1基因5’侧翼区c-1763t位点扩增结果；琼脂糖胶浓度为2.5％；图中marker为dm2000plus；图中各泳道片段大小均为595bp。图6为猪trpc1基因c-1763t位点个体测序图。具体实施方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例1猪背最长肌中trpc1基因的表达分析选择中国地方品种“藏猪”(采自西藏农牧学院教学实习牧场)、“乌金猪”(采自西藏农牧学院教学实习牧场)和引进品种“大约克猪”(采自安徽科鑫养猪育种有限公司)的6月龄时背最长肌组织样品，采用trizol传统法提取组织rna，并反转录成cdna。从ncbi上下载猪trpc1基因mrna序列(登录号nm_001145751.1)，利用软件primerpremier5.0，设计以下引物：正向引物f：5'-catccaaaggcaaggtta-3'反向引物r：5'-aagtccgaaagccaagta-3'用上述引物在藏猪、乌金猪和大约克背最长肌组织的cdna进行实时荧光定量pcr扩增，pcr扩增一般使用20ul反应体系：10μl2×superrealpremixplus，8μlddh2o，上下游引物各0.5μl，cdna模板1μl；将pcr扩增反应体系在95℃预变性15min；进行如下循环40个：95℃预变性20s,58℃退火20s，72℃延伸20s,melt6s。以β-actin(上游引物：5'-gccaaccgtgagaagatgact-3'；下游引物：5'-gtgaccccatccccagagt-3')为内参，利用2–δδct法进行trpc1基因在不同品种猪背最长肌中的相对表达分析(图1)。图中可见大约克猪背最长肌组织中trpc1基因表达量显著高原乌金猪和藏猪。该基因在大约克猪中的高表达，说明其可能对其肌肉快速生长起重要的调控作用。实施例2猪trpc1基因snp位点的筛选选择中国地方品种“藏猪”(采自西藏农牧学院教学实习牧场)、“乌金猪”(采自西藏农牧学院教学实习牧场)和引进品种“大约克猪”(采自安徽科鑫养猪育种有限公司)的耳组织样品，采用苯酚/氯仿法提取耳组织基因组dna。从ncbi上下载猪trpc1基因序列(登录号nc_010455.5)，利用软件primerpremier5.0，对从ncbi上下载的trpc1基因的dna序列，设计了四对引物，引物1扩增猪trpc1基因5'调控区-2142bp～-1548bp，目的扩增片段长度为595bp；引物2扩增猪trpc1基因5'调控区-1702bp～-942bp，目的扩增片段长度为761bp；引物3扩增猪trpc1基因5'调控区-1121bp～-662bp，目的扩增片段长度为550bp；引物4扩增猪trpc1基因5'调控区-678bp～+121bp，目的扩增片段长度为800bp。正向引物1f：5'-ctagagttgtgatgggtcttc-3'反向引物1r：5'-gctcattgtaaatctgtggc-3'正向引物2f：5'-ttacccctaaacactctgg-3'反向引物2r：5'-cattgggatcggctcta-3'正向引物3f：5'-caagcactaaggggaca-3'反向引物3r：5'-ggttgcaggtttgaggta-3'正向引物4f：5'-acctcaaacctgcaacc-3'反向引物4r：5'-acctcccgcacatcctt-3'用上述引物在藏猪、乌金猪和大约克基因组dna进行pcr扩增，pcr扩增使用20ul反应体系：10μl2×powertaqpcrmastermix，8μlddh2o，上下游引物各0.5μl，dna模板1μl；将pcr扩增反应体系在94-95℃预变性5min；进行如下循环35个：94-95℃预变性30s,梯度退火30s，72℃延伸40s；72℃延伸7min,即得到pcr产物，并确定最佳退火温度均为58℃(图2)。对上述3个猪种的pcr产物经gelextractionkit试剂盒(购自上海生物工程技术有限公司，按照试剂盒说明书操作)纯化。每个猪种分别选10个个体进行pcr扩增，每个个体的pcr产物各取5μl，混池成一个样本进行测序(华大基因)。三个猪种的混池测序结果经chromaspro软件比对分析，在猪trpc1基因上游约2000bp的区域中检测到7个snp位点，根据其在该基因起始密码子上游的距离和等位基因型，分别记为a-1825t、c-1763t、c-1604t、a-1166g、c-985a、a-730g和g-227t。根据测序峰图普安段，其中c-1763t(图3)和c-1604t可能为品种间基因型频率差异较大的位点。该两个位点距离123bp，且等位基因型-1763c与-1604c完全连锁，形成cc单倍型；-1763t与-1604t完全连锁，形成tt单倍型，可能是调控该基因差异表达的重要位点。因此本申请可以只检测c-1763t位点基因型，可以代表该2个位点(c-1763t、c-1604t)的单倍型组合。实施例3猪trpc1基因snp位点区段启动子调控活性检测根据猪trpc1基因5'调控区序列设计引物，引物序列为：正向引物f：5'-ctagagttgtgatgggtcttc-3'；反向引物r：5'-gctcattgtaaatctgtggc-3'该引物扩增猪trpc1基因5'调控区-2142bp～-1548bp，其中包含c-1763t和c-1604t两个snp位点，目的扩增片段长度为595bp，核苷酸序列如seqidno.1所示。以不同基因型的猪基因组dna为模板，利用pcr反应进行扩增，得到trpc1基因5'调控区c-1763t和c-1604t位点为c/c和t/t两种单倍型序列，分别记为cc和tt。对扩增的片段进行酶切、纯化及连接构成重组体pgl3-basic-trpc1，通过lipo2000脂质体的方法将重组载体转染进c2c12细胞中，以海肾荧光素酶载体prl-tk为内参，用双荧光素酶报告基因进行荧光素酶活性检测，检测结果如图4所示。图中可见cc型的序列片段的荧光素酶表达要显著高于tt型，说明当trpc1基因上游1763bp和1604bp位点均为c等位基因型时，该启动子片段具有较高的调控活性，在体内可能具有上调猪trpc1基因表达的作用。实施例4猪trpc1基因c-1763t位点基因型检测测序方法建立为了快速方便的检测猪trpc1基因c-1763t位点基因型，利用猪trpc1基因序列(登录号nc_010455.5)设计引物，引物序列如序列表中seqidno.2和seqidno.3所示。对猪的基因组dna进行pcr扩增，pcr反应体系为20ul体系：10μl2×powertaqpcrmastermix，8μlddh2o，上下游引物各0.5μl，dna模板1μl；将pcr扩增反应体系在94-95℃预变性5min；进行如下循环35个：94-95℃预变性30s,58℃退火30s，72℃延伸40s；72℃延伸7min,即得到pcr产物。pcr扩增产物用浓度为2.5％的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像系统中观察pcr扩增效果，可见到片段大小为595bp的清晰条带(见图5)。对pcr产物进行测序。采用chromaspro软件打开测序文件，并于序列表seqidno.1所示核苷酸序列比对分析，判定c-1763t位点基因型，若该位点为单一的c峰，则判定为cc基因型；若该位点为单一的t峰，则判定为tt基因型；若该位点为c和t套峰，则判定为ct基因型(图6)。实施例5本发明筛选的遗传标记在不同猪群中的基因型分布检测采集藏猪(采自西藏农牧学院教学实习牧场)、乌金猪(采自西藏农牧学院教学实习牧场)、大约克猪(安徽科鑫养猪育种有限公司)耳组织样品，采用苯酚/氯仿法提取猪个体基因组dna。采用实施例4建立的pcr产物测序技术，测定3个品种个体trpc1基因c-1763t位点的基因型，检测结果如表1所示。表1猪trpc1基因c-1763t位点基因型分布藏猪、乌金猪均属生长速度慢的中国地方猪品种，生长速度与体重均低于引进猪种大约克猪，其中乌金猪的生长速度与体重均略高于藏猪。表1中可见生长速度较快的猪种(大约克猪)在该位点的c等位基因频率为1，而在我国地方慢生长猪种(乌金猪)的c等位基因频率为0.621，另一种生长速度更慢的我国地方小型猪种(藏猪)的c等位基因频率为0.441。即猪的生长速度与群体中c等位基因的频率成正相关。由此初步判断trpc1基因c-1763t位点cc型为生长速度快的基因型，tt型为生长速度慢的基因型。结果表明该基因位点的基因型和等位基因分布在不同生长性能的猪群间差异明显，可能与生长性能相关。实施例6淮猪新品系群体中trpc1基因型与猪生长速度相关分析采集102头淮猪新品系(采自安徽科鑫养猪育种有限公司，为该新品系的第4世代群体)耳组织样品，个体间无亲缘关系，所有个体测定和计算达30kg体重的日龄和达90kg体重的日龄2个生长速度性状指标(见表2)。表2淮猪新品系生长速度性状指标采用实施例4中建立的技术测定102头淮猪新品系的trpc1基因c-1763t位点的基因型，结果见表3。淮猪新品系群体中trpc1基因c-1763t位点出现的3种基因型中cc型频率78.43％，ct型频率20.59％，tt型频率极低，仅为0.98％。表3淮猪新品系4世代trpc1基因c-1763t位点基因型分布对淮猪新品系群体中trpc1基因c-1763t位点基因型与生长速度性状进行关联分析，结果见表4。cc型猪达到30kg的日龄和达到90kg的日龄均显著小于ct型猪(p<0.05)，说明cc型猪的早期(30kg体重前)和生长期(30kg-90kg)的生长速度均高于ct型猪。cc型猪比ct型猪早8.59天达到30kg体重，早20.04天达到90kg体重，可见等位基因c是快速生长的分子标记，可以用于猪分子标记辅助育种。表4淮猪新品系4世代trpc1基因c-1763t位点不同基因型对生长性能的效应分析到达日龄cc(n＝80)ct(n＝21)tt(n＝1)30kg92.45±0.97a101.04±2.49b128.6690kg189.27±4.30a209.31±6.85b209.93注：cc，ct，tt代表三种基因型，n代表统计个数，不同字母间表示显著差异(p<0.05)，表中数值为平均数±标准误。tt基因型由于只有一个个体，未与其余两种基因型进行显著性分析。虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表<110>中国农业大学<120>一种与猪生长速度相关的snp分子标记及其应用<130>khp191110613.3<160>13<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>595<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ctagagttgtgatgggtcttctctctagtaccggaggttgagtgagtagctttaagtaat60gtgctggttctgaatcttacatgctattgttcatcatgaccttatcattggtctcctatc120atagatgcaaatagaggatcttaaaatatcccagtttatgctggataaaaatggacgaga180gaagcaagagagaatattctgcatctgagttgattcaaaaagaaatctacaacattagct240tactgtgaaggaggaaaaaccctctaataattttggaaagtctgctaggattatctccta300aattagactggaattacactgaatctaagaaatcaatccagcccctaagggagttctatg360gataaggagtcacctaatcctagaagctgaaataaacttcatattaatgtggtttctata420gttcagagccatctgaatttttacccctaaacactctggaacttttggatggatcagggt480tagagttctgccactgagtaaaaattttactggactccaaaatttgtaagcacacacaca540taaacaaacccaaatatgtaccactgtgttcactggccacagatttacaatgagc595<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ctagagttgtgatgggtcttc21<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gctcattgtaaatctgtggc20<210>4<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4catccaaaggcaaggtta18<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5aagtccgaaagccaagta18<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6gccaaccgtgagaagatgact21<210>7<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7gtgaccccatccccagagt19<210>8<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8ttacccctaaacactctgg19<210>9<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9cattgggatcggctcta17<210>10<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10caagcactaaggggaca17<210>11<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11ggttgcaggtttgaggta18<210>12<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12acctcaaacctgcaacc17<210>13<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13acctcccgcacatcctt17当前第1页12