本发明涉及生物工程
技术领域：
，具体涉及一种虎奶菇的发酵培养方法，以及从得到的发酵培养物中提取活性成分的方法。
背景技术：
：虎奶菇(pleurtustuberregium)，又名核耳菇、菌核侧耳、茯苓侧耳、虎奶菌等，是生长于热带与亚热带地区的一种珍稀食用与药用真菌。虎奶菇的结构可分为菌丝体和子实体两部分，菌丝体存在于基质内，具有贮存、分解以及运输的功能。子实体存在于基质外，具有食用与繁殖的功能。菌核呈不规则的团块状，类似于圆形或者扁球形，大小不一，并且表面多为黄白色，少数呈浅黄色，成熟时外皮为红褐色，内部接近白色，体轻、质松，能浮于水面，有颗粒性，气微、味淡，嚼之有颗粒感，具有微黏性。菌盖形如漏斗或杯状，平整且中心下凹，初期肉质表面光滑，中部有小的平伏状鳞片，呈灰白色至红褐色。由于它对生长环境要求苛刻，自然生长周期长，因此随着环境的破坏，虎奶菇菌核的产量越来越少，难以满足医药及保健上的广泛应用。虎奶菇性味甘、温、补气益血，具有滋补强壮、健脾胃、降血脂、防病治病、提高免疫力以及消除肺部污染物的功效，同时也适用于动脉硬化、冠心病、高血压以及重症肌无力的治疗，并且对慢性、过敏性、虚寒型顽咳、哮喘也有较为神奇的疗效。此外虎奶菇的营养极为丰富，富含氨基酸、蛋白质、纤维素、真核多糖和矿物质等营养成分。在东南亚国家以及我国的沿海地区，虎奶菇主要作用为强壮补品来食用，同时也是一味能够止咳平喘的中药。虎奶菇的菌核具有极强的抗病能力，其成品放置在室内干燥的环境下，保存时间长，质不变，虫不蛀，病菌、病毒不侵，霉菌不入，药性功效不变，入药极佳。目前在国内外，虎奶菇的栽培方法与普通食用菌的栽培方法相近，如okhuoyaj.a.等用钻孔的塑料袋分别装香蕉叶、玉米棒子、废棉、稻草、麦秆等农业废料，接入虎奶菇菌丝，28～32℃黑暗培养3.5月，虎奶菇形成菌核并长出子实体，生物学效率香蕉叶最低，为13.58％；废棉最高，为30.11％。黄年来等自1993年起对虎奶菇的栽培方法进行了多方面的研究。在夏秋雨后，将子实体连同菌核挖出，经过晾出水分与表面灭菌的过程后在pda培养基中获得纯菌种；使用阔叶树杂木屑、麸皮、棉籽壳等为培养基，在自然条件下，30℃～35℃袋料培养；30～45天洁白菌丝长满菌袋，4个月后可以采收菌核(120g-150g)。目前，虎奶菇人工栽培方法主要有两种，其一为袋培，利用木屑或者其他农作物秸秆麸皮培养料进行袋培，使之长出子实体或者形成菌棱；其二为利用阔叶树的短椴木进行窖栽，其方法和茯苓筒木窖栽方法相似，只是不能利用松木而已。虽然研究者普遍认为，液体深层发酵是生产菌丝最高效且产量最大的方法，但是有关虎奶菇液态培养获取菌种的工艺研究还需要完善。并需要对虎奶菇的有效成分进行药理药效分离提取。鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供一种虎奶菇的发酵培养方法。本发明的第二目的在于提供从上述得到的发酵培养物中提取活性成分的方法。为实现上述目的，本发明的技术方案如下：本发明涉及一种虎奶菇的发酵培养方法，所述方法包括以下步骤：(1)制备液体培养基，所述液体培养基中含有土豆150～250g/l，葡萄糖15～25g/l，无水硫酸镁0.3～0.8g/l，磷酸二氢钾0.5～1.5g/l，琼脂5-6g/l，亚硒酸钠200～1000μg/l，余量为水。(2)将所述液体培养基灭菌后，进行无菌接种，并在24～29℃，100～180r/min的转速下培养5～9天，得到发酵培养物；(3)将所述发酵培养物抽滤后清洗，得到虎奶菇菌丝。优选地，步骤(1)中，所述液体培养基通过以下方法制备得到：[1]将土豆切片后，加水煮沸4～7min，得到混合液；[2]将所述混合液过滤后得到滤液，并向所述滤液中加入无水硫酸镁、磷酸二氢钾、亚硒酸钠、葡萄糖和琼脂，煮沸使其完全溶解，得到溶液；[3]将所述溶液定容至1000ml，得到所述液体培养基。优选地，步骤(1)中，所述液体培养基的ph值为5～8，优选为7。优选地，步骤(2)中，灭菌在高压蒸汽灭菌锅中进行，条件为121℃下灭菌20min。优选地，步骤(2)中，培养条件为在25℃，120r/min的转速下培养7天。本发明还涉及从所述虎奶菇发酵培养物中提取活性成分的方法，所述方法包括：向所述虎奶菇菌丝中加入有机溶剂浸泡，抽滤后得到滤液，所述滤液即为虎奶菇活性成分提取液。优选地，所述有机溶剂选自石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、乙醚中的至少一种。优选地，所述浸泡时间为15～30h。优选地，将得到所述提取液蒸发浓缩后进行真空干燥，向得到膏状物中加入二甲基亚砜(dmso)溶解，然后在硅胶柱中用氯仿与甲醇的混合溶剂体系进行梯度洗脱，得到洗脱液。优选地，所述氯仿与甲醇的体积比为1：(1～9)。本发明的有益效果：本发明提供了一种虎奶菇的发酵培养方法，该方法通过对虎奶菇最适培养温度、生长时间、摇床转速以及ph四个方面对其发酵条件进行研究，得到最适宜的发酵培养条件。本发明进一步采用有机溶剂对得到的真菌菌丝进行提取，得到虎奶菇活性成分提取液。实验证明通过mtt法筛选出的虎奶菇有效成分具有抗肿瘤活性，对肺癌细胞的抑制率在80％以上。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。本发明实施例涉及一种虎奶菇的发酵培养方法，该方法包括以下步骤：(1)制备液体培养基，该液体培养基中含有土豆150～250g/l，葡萄糖15～25g/l，无水硫酸镁0.3～0.8g/l，磷酸二氢钾0.5～1.5g/l，琼脂5-6g/l，亚硒酸钠200～1000μg/l，余量为水。在本发明的一个实施例中，该液体培养基通过以下方法制备得到：[1]将土豆切片后，加水煮沸4～7min，得到混合液；[2]将混合液过滤后得到滤液，并向滤液中加入无水硫酸镁、磷酸二氢钾、亚硒酸钠、葡萄糖和琼脂，煮沸使其完全溶解，得到溶液；[3]将溶液定容至1000ml，得到液体培养基。进一步地，该液体培养基的ph值为5～8，优选为7时，最有利于菌丝生长。(2)将步骤(1)得到的液体培养基灭菌后，进行无菌接种，并在24～29℃，100～180r/min的转速下培养5～9天，得到发酵培养物；在本发明的一个实施例中，灭菌在高压蒸汽灭菌锅中进行，条件为121℃下灭菌20min。后续的培养条件为在25℃，120r/min的转速下培养7天。(3)将步骤(2)得到的发酵培养物抽滤后清洗，得到虎奶菇菌丝。本发明还涉及从虎奶菇发酵培养物中提取活性成分的方法，该方法包括：向经上述发酵培养得到的虎奶菇菌丝中加入有机溶剂浸泡15～30h，优选24h，抽滤后得到滤液，所得滤液即为虎奶菇活性成分提取液。在本发明的一个实施例中，有机溶剂选自石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、乙醚中的至少一种，上述有机溶剂的极性依次增加。进一步地，将得到的提取液蒸发浓缩后进行真空干燥，向得到膏状物中加入二甲基亚砜(dmso)溶解，然后在硅胶柱中用氯仿与甲醇的混合溶剂体系进行梯度洗脱，得到洗脱液。所述氯仿与甲醇的体积比为1：(1～9)。实施例证明，该活性成分提取液能够在体外抑制肿瘤细胞(例如肺癌肿瘤细胞)，因此可用于制作治疗肿瘤的药物。实施例虎奶菇购自江西省富民食用菌开发基地(宜黄县富民食用菌种植专业社)；癌细胞a549取自河北医科大学附属第四医院。(一)液体培养基的制备与接种1、实验材料：去皮土豆200g，葡萄糖20g，无水硫酸镁0.6g，磷酸二氢钾1g，琼脂5.5g，亚硒酸钠400μg/l，蒸馏水1000ml。2、实验步骤：[1]将土豆切片后加水煮，待其沸腾后再煮5分钟左右，得到混合液；[2]将混合液过滤后取滤液，并向滤液中加入硫酸镁、磷酸二氢钾、亚硒酸钠、葡萄糖和琼脂，煮沸使其完全溶解，得到溶液；[3]将所得溶液定容到1000ml，并分装到5个200ml的锥形瓶中，放置到高压蒸汽灭菌锅中，在121℃灭菌20min；[4]灭菌后，待培养基冷却后进行无菌接种，并放入摇床中进行培养。(二)发酵条件对菌丝生长的影响表1列举了其它条件不变，温度变化对菌丝生长的影响。单位“g/100ml”的含义为每100ml的培养基中含有的菌丝湿重。由表1数据可看出，培养温度对菌丝生长有影响，但其影响不明显，在24.5～26℃下具有较大湿重，说明最适合虎奶菇的培养温度为25℃。表1温度变化时的菌丝湿重表2列举了其它条件不变，培养时间变化对菌丝生长的影响。由表2数据可看出，培养时间对菌丝生长有影响，时间过短，菌丝生长不完全，时间过长菌丝自溶。其中最适合虎奶菇生长的培养时间为7天。表2培养时间变化时的湿重培养时间(天)56789湿重(g/100ml)9.64712.89516.89514.27510.516表3列举了其它条件不变，摇床转速变化对菌丝生长的影响。由表3数据可看出，摇床转速对菌丝生长有影响，但其影响不太明显，其中最适合虎奶菇生长的摇床转速为120r/min。表3摇床转速变化时的湿重表4列举了其它条件不变，ph值变化对菌丝生长的影响。由表4数据可看出，培养基ph值不同，其菌丝生长状态不同，从而得到的菌丝湿重不同，其中最适合虎奶菇生长的ph值为7。表4ph值变化时的湿重ph值55.566.577.58湿重(g/100ml)3.0405.44310.05012.24716.89512.1648.708上述实验说明，虎奶菇的最适培养温度为25℃，最适生长时间7天，最适摇床转速120r/min，最适ph值为7。表5列举了其它条件不变，亚硒酸钠加量变化对菌丝生长的影响。由表5数据可看出，亚硒酸钠加入量不同，其菌丝生长状态不同，从而得到的菌丝湿重不同。亚硒酸钠具有抗过氧化物的能力，能够提高细胞的生长速率和活性，但加入量过大会抑制菌丝生长。其中最适合虎奶菇生长的加入量为400μg/l。表5亚硒酸钠变化时的湿重亚硒酸钠(μg/l)020040060010001500湿重(g/100ml)9.14713.22516.78514.25612.76310.158(三)有效成分提取1、有机溶剂浸取将上述最适宜培养条件获得的虎奶菇发酵培养产物进行离心分离，沉淀干燥后粉碎，得到菌丝体粉末。将得到的菌丝体粉末分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇和乙醚进行浸泡，提取其中的活性成分。具体步骤如下：将50g菌丝体粉末置于锥形瓶中，加入150ml有机溶剂，搅拌均匀后密封，在室温条件下放置24h后抽滤，取澄清滤液。按照上述方式，得到虎奶菇菌丝体的石油醚滤液、乙酸乙酯滤液、正丁醇滤液、乙醇滤液和乙醚滤液。2、浓缩纯化与溶解⑴将上述浸取得到的石油醚滤液、乙酸乙酯滤液、正丁醇滤液、乙醇滤液和乙醚滤液分别用旋转蒸发仪蒸发浓缩后进行真空干燥，得到膏状物。⑵向上述膏状物中分别加入二甲基亚砜(dmso)溶解，得到虎奶菇菌丝体的石油醚提取液、乙酸乙酯提取液、正丁醇提取液、乙醇提取液和乙醚提取液。3、硅胶柱层析分离用氯仿与甲醇的混合溶剂体系，分别对步骤2溶解后得到的乙酸乙酯提取液和正丁醇提取液进行梯度洗脱。以乙酸乙酯提取液为例，具体步骤如下：将60g硅胶作为吸附剂，与溶剂混合后置于色谱柱中，加入乙酸乙酯提取液(乙酸乙酯提取液与硅胶的质量比为1：30。然后用溶剂进行冲洗，分段定量收集洗脱液。得到以下洗脱液：乙酸乙酯1:1洗脱相：氯仿与甲醇的体积比为1:1，对乙酸乙酯提取液采用氯仿与甲醇的混合溶剂进行洗脱，称为乙酸乙酯洗脱相a。乙酸乙酯1:2洗脱相：对乙酸乙酯提取液采用氯仿与甲醇的混合溶剂进行洗脱，氯仿与甲醇的体积比为1:2。称为乙酸乙酯洗脱相b。正丁醇1:9洗脱相：氯仿与甲醇的体积比为1:9,对正丁醇提取液采用氯仿与甲醇的混合溶剂进行洗脱，称为正丁醇洗脱相c。(四)mtt实验1、肺癌细胞的培养(1)rpmi1640培养基的配置①在室温15～30℃条件下，称取5.2g的rpmi1640粉末，加至475ml蒸馏水中，充分搅拌溶解后，将ph值调为7.0～7.4；②向上述溶液中加入碳酸氢钠，其浓度为2.0g/l，并将溶液定容至500ml；③在超净工作台中把灭菌的玻璃漏斗式滤器组装好，用0.22mm膜过滤到无菌的3个锥形瓶中，4℃冰箱保存，备用。2、肺癌细胞原代培养取自人肺腺癌细胞a549，已经进行过细胞复苏。将取回的培养瓶置于37℃，5％co2的二氧化碳培养箱中培养，每隔2-3天，待细胞基质变黄，换液一次。①配置pbs缓冲液(nacl8g、kcl0.2g、kh2po40.2g、na2hpo4·12h2o1.15g，加入蒸馏水定容至1000ml)，调ph值为7.4，灭菌后分装，每瓶100ml。②取冻存的胎牛血清(fcs)于4℃冰箱解冻2h，再于37℃水浴融化。完全融化后，将胎牛血清于56℃水浴加热30min，灭活。③超净工作台中，向配好的已预热到37℃的rpmi1640培养基中加入浓度为10％的15ml胎牛血清，得新鲜培养基。④换液：倒去培养瓶中的旧培养基，用pbs缓冲液冲洗1-2次后，加入新鲜培养液，在二氧化碳培养箱(37℃，5％co2)培养。3、肺癌细胞消化传代待细胞长满瓶底70％左右进行细胞传代。先将含10％fcs的rpmi1640培养基、pbs缓冲液和胰蛋白酶-edta溶液放入37℃水浴锅里预热，预热后用酒精棉擦拭后放入工作台。①弃去旧培养基，用pbs缓冲液冲洗。②加入0.5ml0.25％的胰蛋白酶溶液，37℃消化2min。③吸弃消化液，加入10ml左右的新鲜培养基终止消化。④用吸管将贴壁细胞反复吹打成细胞悬液，在37℃，5％co2条件下继续培养，每隔2-3天换液一次。4、mtt比色法测定肺癌细胞生长情况取传代后4-5天的a549细胞(细胞处于对数生长期)，进行mtt实验。(1)用胰蛋白酶消化在对数生长期的细胞。(2)加入新鲜培养基，吹打成细胞悬液，用rpmi1640培养基调整细胞至合适的浓度，约为每1ml有1×104个细胞。(3)取96孔板，在实验孔中接入100μl肺癌细胞悬液，37℃,5％co2预培养24h。(4)将5种有机溶剂浸取相的浸膏经硅胶柱层析后的产物用dmso溶解到64mg/ml，然后用含胎牛血清的rpmi1640培养基稀释至64μg/ml。(5)设置空白组、实验对照组、溶剂对照组和加样组，每组设定3个平行孔。空白组加培养基不加细胞，实验对照组加入细胞和培养基，溶剂对照组加入细胞、培养基和dmso，加样组加入细胞、培养液和各个待测样品(稀释后的浸膏)。(6)预培养后弃去培养基，按(5)分别加入每孔100μl待测样品，置于co2培养箱中培养48h。(7)培养结束后，每孔加入mtt10μl(5mg/ml)，继续培养4h，弃去培养基，每孔加入dmso150μl，轻轻震荡，待蓝色甲臢结晶溶解后，用酶标仪在490nm波长下测od值，记录。(8)按照以下公式，计算各样品粗品的抑制率。5、mtt实验结果与分析根据酶标仪测得的od值整理后，计算得到虎奶菇各组分对a549细胞的抑制率，结果见表5。表5虎奶菇各组分对a549细胞的抑制率由表5可以直观的看出石油醚提取液、乙醇提取液和水相提取液对肺癌细胞的抑制作用不明显；乙酸乙酯洗脱相a和正丁醇洗脱相c的抑制率分别为80.9％和69.8％，对肺癌细胞有明显的抑制作用，即这两相中含有的组分具有抗肺癌细胞活性。以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。当前第1页12