粉红粘帚霉、其固体发酵菌剂及其应用的制作方法

本发明涉及农业生物防治技术领域，具体涉及一种粉红粘帚霉、其固体发酵菌剂及其应用。

背景技术：

病虫害是影响农产品产量和品质的重要因素，其中根结线虫对作物生长的危害逐渐严重。根结线虫主要侵染植物根系，使根系产生根结或结瘿，重病株根系萎缩畸形，吸收营养物质功能受损，导致植株发育不良、早衰等症状，同时根结线虫的侵入在根部留下伤口，导致枯萎病、根腐病等真菌病害的发生。根结线虫病害发生后，一般减产10%～20%，严重的可达75%以上，已成为农业生产中的一大障碍。

防治根结线虫可通过农业防治、物理防治、抗病育种、化学防治和生物防治。目前对根结线虫的防治主要以化学防治为主，由于化学杀线剂的毒性强、残留高、破坏土壤生物区系，对人类和环境造成了严重的危害。

随着科学技术的发展，对生存环境的追求，农业资源的持续利用、野生生物的物种多样性及环境保护，生物防治是从生态角度研究的新方向。根结线虫生防菌的研究主要在筛选对植物根结线虫具有防治作用的菌株，然而，生防菌筛选过程复杂，工作量大；生长缓慢，生产工艺复杂，成本高，大大限制了生防菌的应用和推广。

因此，亟需研发探索新的对根结线虫具有生物活性的新生防资源，以促进农业无害生产和可持续发展。

技术实现要素：

本发明提供了一株新的粉红粘帚霉nf-06，制备了由粉红粘帚霉菌株nf-06固体发酵而得的固体发酵菌剂，并将粉红粘帚霉菌株nf-06或固体发酵菌剂在防治植物根结线虫病中应用。以解决化学防治污染、生防菌筛选复杂、生产工艺复杂的技术问题。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

筛选培养出一株粉红粘帚霉菌株nf-06，其分类命名为clonostachysrosea，于2018年9月12日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为cgmccno.16262。

利用上述粉红粘帚霉菌株nf-06经固体发酵可制得可用于生物防治的固体发酵菌剂。

所述固体发酵菌剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）将所述粉红粘帚霉nf-06接种到固体培养基中，25℃活化培养4～6d；

（2）将活化的菌接种至种子液培养基中，在25℃，180r/min条件下，培养45～50h，得种子液；

（3）将种子液按照重量百分比为3～10%的比例接种到发酵固体培养基中，在黑暗中于25℃培养12～15d；

（4）取固体发酵培养物在35～45℃下干燥至含水量为8%～10%，粉碎，过40～60目筛子，即得。

优选的，在步骤（1）中，所述固体培养基为pda培养基；

优选的，在步骤（2）中，所述种子液培养基为pd培养基。

优选的，在步骤（3）中，所述发酵固体培养基的配方为：以重量百分比计，玉米粉30%、淀粉20%、蚕豆粉5%、虾粉10%、麦麸15%，秸秆20%。

进一步的，所述秸秆的制备方法为：选成熟小麦脱粒后剩余的茎叶，粉碎至长1.5～2.5mm，宽1～2mm，即得。

优选的，在步骤（3）中，所述发酵固体培养基的初始含水量控制为30～60%，ph控制为6.0～7.5。

优选的，所得粉红粘帚霉固体发酵菌剂的有效活孢子数为7～9×10¹⁰个/克。

将所述粉红粘帚霉菌株nf-06或所述固体发酵菌剂在防治植物根结线虫病中应用。

优选的，施用方法为穴施，施用剂量为1～5g/株。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：

1.本发明筛选到一株新的抗根结线虫的粉红粘帚霉菌株nf-06，于2018年9月12日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为cgmccno.16262。

2.本发明的粉红粘帚霉菌株nf-06与其他粉红粘帚霉菌株相比，具有优越的特点，其产孢量更大，生长更快，能够快速定殖于土壤并发挥生防作用，而且对根结线虫具有独特的双重作用机制（既对二龄线虫具有强烈的致死作用，还对根结线虫具有强烈的寄生作用），鉴于其优越性和独特性，粉红粘帚霉nf-06菌株是一株非常有开发利用潜力的根结线虫生防菌。

3.本发明中固体发酵菌剂的制备方法简单易行、成本低，孢子粉有效活菌数高达8.73×10¹⁰个/克。

4.本发明的固体发酵菌剂对生态安全友好，能够避免或大大减少化学药剂的使用。

5.本发明优选了粉红粘帚霉菌株nf-06固体发酵菌剂的制备条件，生产工艺简单，成本低，有利于应用和推广。

附图说明

图1为菌株nf-06形态学特征中菌株正面照片；

图2为菌株nf-06形态学特征中菌株背面照片；

图3为菌株nf-06形态学特征中分生孢子梗与分生孢子的显微镜照片；

图4为菌株nf-06与菌株ff-128对根结线虫的寄生作用对比图；

图5为不同基础培养基的最大产孢量及平均产孢量统计柱状图；

图6为添加不同碳源nf-06菌株最大产孢量及平均产孢量统计柱状图；

图7为添加不同氮源nf-06菌株最大产孢量及平均产孢量统计柱状图；

图8为nf-06菌株发酵条件优化正交试验培养基对比统计柱状图；

其中，图中培养基1～9对应表3中处理1～9；

图9为不同初始含水量培养基nf-06菌株最大产孢量及平均产孢量统计柱状图；

图10为不同接种量nf-06菌株最大产孢量及平均产孢量统计柱状图；

图11为不同ph培养基nf-06菌株最大产孢量及平均产孢量统计柱状图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的分离或检测方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1：鉴定粉红粘帚霉

发明人从根结线虫上分离得到一株微生物菌株，命名为nf-06，其鉴定结果如下：

（1）形态学鉴定

菌株nf-06的正面如图1所示，背面如图2所示，分生孢子梗与分生孢子如图3所示。

从图中可知：菌株nf-06在pda培养基上菌落边缘整齐，菌丝匍匐，较疏松，初期为白色，后期变为淡粉红色，菌落底有橙红色色素产生。菌株nf-06菌丝有隔膜，分生孢子梗直接从菌丝生出，无色，顶端呈帚状分支，分生末端着生小梗，小梗呈安托瓶状，分生孢子着生于小梗顶端，长椭圆形，大小为2.0~3.5um×5.5～6.5um，经形态学鉴定为粘帚霉属（clonostachyssp.）的一种。

（2）分子生物学鉴定

提取菌株dna，测定菌株nf-06的rdna-its序列，与ncbi数据库进行blast比对分析，相似性最高的属种为粉红粘帚霉（clonostachysrosea）（序列号kt921200），序列相似度达到99%。

从ncbi数据库下载其近缘序列构建系统发育树，结果显示菌株nf-06与粉红粘帚霉的亲缘关系最近，结合形态学鉴定，将菌株nf-06鉴定为粉红粘帚霉（clonostachysrosea）。

实施例2：检测nf-06菌株对根结线虫二龄幼虫的寄生作用和致死作用

ff-128菌株为发明人（张洁）在2017年3月从河南省开封市祥符区罗王乡温室大棚的番茄根系土壤中分离而来的一株粉红粘帚霉，经室内测定发现其对番茄灰霉病、西瓜枯萎病等均具有较强的抑制效果。

本试验以粉红粘帚霉ff-128菌株作为对照，分别测定菌株nf-06和菌株ff-128对南方根结线虫二龄幼虫的致死作用和寄生作用。

具体步骤如下：将菌株nf-06和菌株ff-128的菌饼（9mm）接种至水琼脂培养基中，25℃培养3天后在菌落四周放置四个无菌小盖玻片，将10μl线虫液（2000条/ml）滴加到盖玻片上，再次将培养皿密封，放在真菌培养箱中培养3～7d，观察真菌对线虫的寄生情况。分别取200μl菌株nf-06和菌株ff-128的发酵滤液加入50μl线虫液（2000条/ml），同时设清水对照，放入15℃培养箱中，24h、48h和72h后观察二龄幼虫的死亡情况，通过用naoh刺激来判断线虫的死活。

如图4所示，nf-06菌株对根结线虫具有强烈的寄生作用，共培养7天后菌丝穿透虫体并从体内长出，而菌株ff-128对南方根结线虫没有寄生现象。统计菌株nf-06对根结线虫二龄幼虫的寄生率为75%～80%，而菌株ff-128对根结线虫二龄幼虫的寄生率为0。处理24h、48h和72h后，菌株nf-06对二龄幼虫的校正致死率分别为63.59%、75.51%、86.97%，而菌株ff-128对二龄幼虫的校正致死率分别为6.67%，13.09%，23.16%。

以上结果表明，与菌株ff-128相比，菌株nf-06对根结线虫二龄幼虫具有双重作用机制，既具有较强的寄生作用，还具有强烈的致死作用。

实施例3：制备粉红粘帚霉菌株nf-06固体发酵菌剂

（1）制备粉红粘帚霉菌株nf-06的种子液

将粉红粘帚霉菌株nf-06在pda固体培养基上进行活化，于25℃条件下培养5d；

将配置好的pd培养基用250ml三角瓶每瓶50ml进行分装，在121℃条件下高压灭菌半小时后备用，在超净工作台上用打孔器沿活化的菌落边缘打制成直径5mm的菌饼，用接种针挑起接种到pd培养基上，于25℃，180r/min培养48h后得种子液。

（2）筛选基础培养基

以麦麸、麦秸、豆粕为基础培养基原料，筛选基础培养基，如表1所示，初始含水量40%，按照3%（wt/wt）的接种量进行接种，ph为6.5，25℃条件下培养14d后检测每克培养物的孢子浓度。

其中，秸秆的制备方法为：选小麦成熟脱粒后剩余的茎叶部分，用粉碎机粉碎成长约2mm，宽约1.5mm的片段。

表1固体发酵基础培养基筛选

。

检测结果如图5所示，配方a（80%麦麸皮+20%麦秸）的最大产孢量及平均产孢量均高于另外两组，其中，最大产孢量可达8.64×10⁸个/g培养物，平均产孢量也可达8.52×10⁸个/g培养物。

因此确定最佳基础培养基为80%麦麸皮与20%麦秸。

（3）单因素试验

i.最佳碳源筛选

以80%麦麸加20%麦秸培养基为对照，分别向60%麦麸皮+20%麦秸中添加20%可溶性淀粉、20%玉米粉、20%小麦粉或者20%大米粉，进行单因素试验，所有培养基初始含水量40%，按照3%（wt/wt）的接种量进行接种，ph为6.5，筛选促进产孢的最佳碳源。

结果如图6所示，添加不同碳源对nf-06菌株产孢量影响明显不同，依次是玉米粉＞可溶性淀粉＞葡萄糖＞小麦粉，玉米粉对nf-06菌株产孢有明显的促进作用，最大产孢量可达1.16×10⁹/g，平均产孢量可达1.03×10⁹/g。其次是可溶性淀粉的促进作用较为明显，最大产孢量可达8.88×10⁸/g，平均产孢量可达7.98×10⁸/g。小麦粉与葡萄糖对nf-06菌株产孢的促进作用不明显，因此选用玉米粉与可溶性淀粉作为添加碳源进行后续正交试验。

ii.最佳氮源筛选

以80%麦麸皮加20%麦秸培养基为对照，分别向60%麦麸皮+20%麦秸中添加20%鱼粉、20%酵母粉、20%蚕豆粉和20%虾粉进行单因素试验，筛选促进产孢的最佳氮源，所有培养基初始含水量40%，按照3%（wt/wt）的接种量进行接种，ph为6.5。

结果如图7所示，添加不同氮源对nf-06菌株产孢量影响显著不同，依次是蚕豆粉＞虾粉＞鱼粉＞酵母粉，蚕豆粉对nf-06菌株产孢有明显的促进作用，最大产孢量可达8.60×10⁸/g，平均产孢量可达7.92×10⁸/g。其次是虾粉的促进作用较为明显，最大产孢量可达7.44×10⁸/g，平均产孢量可达7.12×10⁸/g。鱼粉和酵母粉对nf-06菌株产孢的促进作用不明显，因此选用蚕豆粉和虾粉作为氮源进行后续正交试验。

（4）正交试验

根据基础培养基筛选和单因素试验结果，选用玉米粉、可溶性淀粉作为添加碳源，蚕豆粉、虾粉作为添加氮源，进行四因素三水平正交试验，如表2所示，其中，每组配方中均添加20%秸秆，其余用麦麸皮填充，所有培养基初始含水量40%，按照3%（wt/wt）的接种量进行接种，ph为6.5。

表2nf-06菌株发酵条件筛选因素与水平

。

正交试验结果如表3和图8所示：

表3nf-06菌株发酵条件优化正交试验结果

。

由表3和图8可知：不同的碳氮源对菌株nf-06产孢量影响不同，依次为虾粉＞可溶性淀粉＞玉米粉＞蚕豆粉。最佳组合为玉米粉30%、淀粉20%、蚕豆粉5%、虾粉10%、麦麸15%，秸秆20%。

（5）筛选最佳含水量

根据固体发酵培养基正交试验结果，选择玉米粉30%、淀粉20%、蚕豆粉5%、虾粉10%、麦麸15%、秸秆20%为培养基配方，筛选培养基初始含水量（30%、40%、50%、60%）。所有培养基按照3%（wt/wt）的接种量进行接种，ph为6.5。

结果如图9所示：初始含水量为50%时对nf-06菌株产孢能力具有较大促进作用，最大产孢量可达6.28×10¹⁰个/g，平均产孢量可达5.8×10¹⁰个/g，选择50%作为最佳初始含水量。

（6）筛选最佳接种量

根据固体发酵培养基正交试验结果，选择玉米粉30%、淀粉20%、蚕豆粉5%、虾粉10%、麦麸15%、秸秆20%为培养基配方，筛选最佳接种量。分别将种子液按照3%、5%、10%三个梯度接种在固体发酵培养基上，所有培养基初始含水量为50%，ph为7.5。

结果如图10所示：接种量为5%时nf-06菌株产孢量最大，为8.44×10¹⁰个/g，平均产孢量可达7.86×10¹⁰个/g，选择5%作为最佳接种量。

（7）筛选最适宜ph

根据固体发酵培养基正交试验结果，选择玉米粉30%、淀粉20%、蚕豆粉5%、虾粉10%、麦麸15%、秸秆20%为培养基配方，筛选最适宜ph。设ph=6.0、6.5、7.0、7.5四个梯度进行nf-06菌株发酵条件优化中最适宜培养ph的实验，所有培养基初始含水量50%，接种量5%。

结果如图11所示：在ph=7.0条件下，以30%玉米粉、20%淀粉、5%蚕豆粉、10%虾粉、15%麦麸、20%秸秆为培养基配方，培养基初始含水量为50%，接种量为5%时，nf-06菌株产孢量最大，为8.73×10¹⁰个/g，平均产孢量为8.33×10¹⁰个/g。

（8）制备粉红粘帚霉nf-06菌剂

将按照上述方法黑暗培养的固体发酵培养基培养物在40℃条件下进行干燥，至含水量为8%～10%。利用超微粉碎机粉碎上述培养物，过40～60目筛子，得微生物菌剂。

实施例4：检测粉红粘帚霉菌株nf-06固体发酵菌剂对番茄根结线虫的防治效果

试验分组处理如下：

处理1：实施例3制备的粉红粘帚霉nf-06菌剂，移栽时1g/株穴施；

处理2：实施例3制备的粉红粘帚霉nf-06菌剂，移栽时5g/株穴施；

处理3：制备粉红粘帚霉ff-128菌剂，移栽时5g/株穴施

处理4：2.5mg/l阿维菌素颗粒剂，移栽时5ml/株穴施；

处理5：清水对照。

每组处理9株，在番茄移栽之前，利用“穴施法”将菌剂以及对照药剂施入穴内。移栽50天后，调查根结情况以及株高、地下鲜重等番茄生理指标，根据分级标准计算根结指数和防治效果。

根结指数和防治效果的计算公式为：

根结指数＝σ（各级病株数×级别）/调查总株数；

防治效果＝（对照根结指数－对照根结指数）/对照根结指数×100%。

其中，级别的分级标准为：

0级，根系健康，无根结；

1级，根结极少，根结率为1%～20%；

2级，根结较少，根结率为21%～40%；

3级，根结数量中等，根结率为41%～60%；

4级，根结数量很多，61%～80%根系有根结；

5级，根结相互连接成根结团块，81%以上根系有根结。

检测结果如表4所示：

表4各处理对番茄根结线虫的防治效果以及番茄生长的影响

。

从表4可以看出，nf-06菌剂5g/株穴施处理防治效果达75.7%，超过了阿维菌素2.5mg/l处理的73.0%，nf-06菌剂1g/株穴施处理对番茄根结线虫防治效果达67.6%，而粉红粘帚霉ff-128菌剂对番茄根结线虫的防治效果仅为32.6%。

此外，与对照相比，nf-06菌剂1g/株和5g/株穴施均显著增加了番茄植株的株高和地下鲜重，具有显著的促生作用。

上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。