一种植物灭螺剂螺威的制备方法与流程

本发明涉及一种已知化合物的合成方法，具体地说是一种植物灭螺剂螺威的制备方法，是以油茶皂素为原料，通过酯水解反应和分离制备获得植物灭螺剂螺威。

背景技术：

血吸虫病是危害人类身体健康最严重的寄生虫病之一，全世界约有70多个国家和地区流行血吸虫病，影响人口约31亿，约有2亿多人受感染，每年死于本病者达百万之多^[1-2]。血吸虫病防治实践表明，钉螺是血吸虫的唯一中间宿主，控制钉螺能有效控制血吸虫病传播，因此在血吸虫病多发地带，灭螺是预防血吸虫感染的直接有效措施之一。

经过多年的研究和实践，我国在控制钉螺的过程中总结出了一系列行之有效的技术和方法，这些方法主要包括生态灭螺、生物灭螺、药物灭螺和植物灭螺。生态灭螺工程长效持久，节省资源，但一次性投资大，灭螺效果缓慢；生物灭螺符合可持续发展的理念，是钉螺控制和实现血吸虫病根本性防治的有效措施，但有关捕食灭螺、微生物灭螺和竞争灭螺等生物灭螺的机制研究及现场大规模应用尚且不多；药物灭螺中的化学灭螺依然是目前最主要的灭螺方法，但目前国内常用灭螺剂多为化学合成药剂，存在其他靶生物(如淡水鱼类)毒性、环境污染和价格昂贵等问题^[3-4]。目前市场上出现了新型植物灭螺剂，其有效成分为根、茎、叶、花、果或籽等植物器官的提取物，具有低毒和易降解等优点，越来越受到who和各国疾控部门的关注^[5]。

螺威(分子式见下式1)是一种来自油茶科植物的五环三萜类物质，是一种新型植物灭螺剂，系植物源农药^[6]。螺威是油茶皂素脱去2-甲基-2-丁烯酸、乙酸的产物，水解掉上述两种酸对应的酯基后，油茶皂素对应部位变为羟基(该组分下文中用h2b表示)。虽然油茶皂素拥有一定的灭螺效果，但其脱去2-甲基-2-丁烯酸、乙酸组分杀的灭钉螺活性更高，因此脱羧组分含量越高，灭螺效果越好。螺威作为一种新型植物灭螺剂，主要通过与软体动物红细胞壁上的胆甾醇结合，生成不溶于水的复合物沉淀，破坏了血红细胞的正常渗透性，使细胞内渗透压增加而发生崩解，导致溶血现象，从而杀死软体动物。大量的室内与室外药效试验显示，螺威对钉螺杀灭效果好，具有高效、低毒、廉价、环保和使用方便等优点，相较之现有的杀螺剂——氯硝柳胺的强毒性，螺威生物安全性更好，更具有推广应用的价值^[7]。2013年，螺威产品通过农业部农药登记，登记证号为pd20131345和pd20131346。

油茶皂素又名茶皂甙(分子式见下式2)，是存在于山茶科(茶、山茶、油茶)植物中的一类齐墩果烷型三萜类皂苷混合物^[8]，它的基本结构由甙元(配基)、糖体、有机酸三部分组成，甙元为β-香树素衍生物。油茶皂素主要储藏于茶籽和茶叶中，其中干茶叶籽中含量4％-6％，在常规无水溶剂如乙醇、甲醇、丙酮中不溶，易溶于水和叔丁醇等大极性溶剂。我国茶叶资源丰富，油茶皂素作为茶叶生产的主要副产物，储存量大、价格低廉、易于获取，具有重要的研发和利用价值^[9]，以茶皂素作为原料制备植物灭螺剂螺威，方法简单，成本低廉。

虽然张向杰、陈剑峰等曾以专利报道过螺威的合成方法，但螺威水溶性好，热稳定性差，导致其在加热过程中容易变质，表现为溶液发黑发臭，且作为一种良好的起泡剂，螺威水溶剂在处理过程中易于起泡，因此高含量、高品质和高效率制备螺威的方法还存在问题。张向杰等直接将茶皂素用作杀螺药物，虽然简单方便，但其灭螺活性有待提高，需要大剂量的药物才能达到满意的灭螺效果，且大批量使用原料会导致环境污染，茶皂素原料利用率低^[10]。陈剑峰等用茶籽粕为原料，直接加入少量氢氧化钙，通过溶剂提取和膜过滤制备得到螺威，该方法不能确定茶皂素中乙酸酯、2-甲基-2-丁烯酸酯的水解状况，进而不能保证最终产物中活性组分含量，也无法保障螺威产品杀灭效果^[11]。刘瑞华等直接用茶籽粉为原料，应用氢氧化钠溶液和碱性蛋白酶水解后减压脱水制得螺威，但在脱水过程中螺威活性组分容易受热分解和变质，不能保障产品质量，进而不能保证产品中螺威有效成分的含量^[12]。张能敏等利用氢氧化钠和碱性蛋白酶水解茶皂素，经盐酸酸化沉淀得到螺威活性组分h2b，但茶皂素脱羧产物在水中溶解度很高，直接酸化沉淀回收螺威活性组分的分离效率较低，产物收率也低^[13]。宋冰蕾等利用胺解反应，选用偶极溶剂n,n-二甲基甲酰胺制得螺威，其缺点在于反应需严格控制反应条件、所用溶剂和原料等需进行严格的无水处理、最终产率仅有21.6％^[14]。此外，李晴川等通过两级沉淀法提纯油茶皂素，首先利用醇沉法对茶皂素粗提液进行初步纯化，再利用茶皂素和金属离子反应生成茶皂素金属离子络合物，形成络合物沉淀的原理，得到纯化的茶皂素^[15]。遗憾的是，该学者只在较温和的环境和较短的时间条件下制得纯度87.58％的茶皂素，并未深入到由茶皂素制备螺威的工艺中去。

参考文献：

[1]卫生部医学科学院血吸虫病研究委员会,寄生虫病学编委会.寄生虫病(下册)[m].上海：上海科学技术出版社，1964：860-885.

[2]柯常禄.灭螺药物研究概况及其应用研究的思考[j].医学动物防制，2002，18(4)：189--191.

[3]周晓农.实用钉螺学[m].北京：科学出版社.2005：266—290.

[4]陈昌.我国的杀螺剂及其应用[j].中国血吸虫病防治杂志，2003，15(5)：321.322.

[5]汪天平，操治国，林丹丹，等.“十二五”期间我国血吸虫病科学研究重点和方向[j].中国血吸虫病防治杂志，2011，23(2)：11l一113.

[6]纪明山,谷祖敏,张扬.生物农药研究与应用现状及发展前景[j].沈阳农业大学学报,2006,37(4):555-550.

[7]唐猛,范建儒,黄义,骆峰.四川省丹棱县丘陵地区螺威与氯硝柳胺灭螺对照试验[j].寄生虫病与感染性疾病，2017，15(1)：8-13.

[8]murakamit,nakamuraj,masudah,eta1.bioactivesaponinsandglycosides.xv.saponinconstituentswithgastroprotectiveeffectfromtheseedsofteaplant,camelliasinensisl.vat.assamicapierre,cultivateinsrilanka；structuresofassamsaponinsa,b,c,d,ande[j].chem.pharm.bull.(tokyo),1999,47(12):1759-1764.

[9]李国武,郭晨,段一凡,肖文军.茶皂素研究进展[j].茶叶通讯,2016,43(1):14-22.

[10]张向杰,胡国文.植物性杀螺剂及其茶皂素的用途[p].中国专利：cn101524067,2009-09-09.

[11]刘瑞华.植物生物复合杀螺剂及其制备方法[p].中国专利：cn1579168,2005-02-16.

[12]陈剑峰.一种植物性灭螺剂的制备方法[p].中国专利：cn1973633,2006-12-15.

[13]张能敏.一种植物灭螺剂及其制备方法和用途[p].中国专利：cn104521968a,2015-04-22.

[14]宋冰蕾,商士斌,宋湛潇,李梦和.脱酯基茶皂素的制备与性能[j].生物质化学工程,2011，45(3)：8-10.

[15]李晴川,茶皂素的提取纯化工艺及其对乙醇脱氢酶活性影响的研究[d].合肥工业大学,2016.

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，旨在提供一种植物灭螺剂螺威的制备方法。基于油茶皂素及其脱羧组分水溶性好、热稳定性差、极性大，皂素钙沉淀在水中溶解度小且容易转化为螺威等特点，本发明以茶皂素为原料得到高品质的螺威，将过剩的油茶皂素变废为宝，可以广泛应用于工业化生产，为螺威的推广提供技术支持。

本发明植物灭螺剂螺威的制备方法，是以油茶皂素为原料，利用ca(oh)2水解油茶皂素，水解后产生的2-甲基-2-丁烯酸、乙酸与ca²⁺形成可溶性钙盐，油茶皂素的糖基部分的羧基(a)也与ca²⁺生成不溶性钙盐皂素脱羧钙沉淀(式3)，过滤后，不溶性皂素脱羧钙沉淀再以去离子水分散，用硫酸酸化钙盐后过滤除去caso4沉淀，将滤液进行减压蒸馏，得到螺威h2b。

本发明植物灭螺剂螺威的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：水解和钙化

以质量分数60％的油茶皂素、氢氧化钙作为原料，以水为溶剂，加热条件下油茶皂素在碱性环境中水解，脱去乙酸与2-甲基-2-丁烯酸，油茶皂素的糖基上的羧基和ca(oh)2反应得到茶皂素脱羧钙沉淀，抽滤水溶性乙酸钙与2-甲基-2-丁烯酸钙和溶液，并将沉淀干燥，得到土黄色的茶皂素脱羧钙沉淀；

步骤1中，质量分数60％的油茶皂素与氢氧化钙的质量比为8：1～5，优选4:1。

步骤1中，水解反应的温度为25～90℃，优选40～60℃；水解反应的时间为5～30小时，优选为15小时。

步骤2：酸化

将步骤1获得的茶皂素脱羧钙沉淀加入分散剂中分散均匀，用稀硫酸溶液调节ph值，将茶皂素脱羧钙沉淀转化为硫酸钙固体与螺威溶液；

步骤2中，具体是先用分散剂分散茶皂素脱羧钙沉淀，再加入质量浓度为10～20％的稀硫酸溶液，调节混合液的ph值，将茶皂素脱羧钙沉淀转化为螺威溶液和caso4沉淀，过滤可将两者分离。

步骤2中，所述分散剂选自低沸点大极性溶剂，如去离子水、二甲亚砜、乙二醇、乙酸、硝基甲烷、丙酮、吡啶等中的一种或几种的混合。根据茶皂素脱羧钙沉淀、螺威、硫酸钙溶解性的差异，优选去离子水。

步骤2中，混合液的ph值调节至2～4。

步骤3：精制

根据螺威易溶于大极性溶剂、难溶于小极性溶剂的特点，向步骤2获得的螺威溶液中加入小极性溶剂，降低溶液极性，改变螺威溶液的极性环境，螺威固体可从溶液中析出，过滤获得螺威固体，对滤液进行减压蒸馏以回收小极性溶剂，回收小极性溶剂后所剩残液可以返回到油茶皂素水解、钙化反应环节作为溶剂。

步骤3中，所述小极性溶剂选自丙酮、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇、四氢呋喃等中的一种或几种的混合，优选丙酮。

油茶皂素分子中糖基与皂苷元通过苷键相连，在强酸环境下，苷键容易发生断裂，导致油茶皂素变质，同时油茶皂素的热稳定性差，在高温环境下很容易被氧化，导致溶液变黑伴有恶臭味。本发明利用合适的碱作为水解试剂，通过实验得到了油茶皂素制备螺威的最优反应温度、反应物投料比、反应时间、酸化ph、分离条件，保证油茶皂素分子在水解时糖基部分、皂苷元部分均不受到破坏，只脱去乙酸、2-甲基-2-丁烯酸部分而生成茶皂素脱羧组分。对产物用molish反应进行检测，发现糖基未遭到破坏，利用libermannburchard实验，发现皂苷元部分未遭到破坏。

本发明通过氢氧化钙一步水解茶皂素直接得到茶皂素脱羧钙沉淀，工艺简单可操作、能耗低、转化率高且副反应少，易于分离反应产物；将茶皂素脱羧钙沉淀酸化得到螺威溶液后，通过减压蒸馏可将水分除去，得到高纯度的螺威固体。

本发明方法可以实现油茶皂素的酯水解和茶皂素脱羧钙沉淀的一次性完成，便于产物的分离提纯，降低分离成本。过滤后的茶皂素脱羧钙沉淀进行下一步反应，反应液可返回到上一步循环使用。本发明的副产物乙酸钙和2-甲基-2-丁烯酸钙溶液可经浓缩后用硫酸酸化，再通过减压精馏提纯作为副产品，副产物硫酸钙也是一种重要的化工原料。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

1、氢氧化钙水解茶皂素一步直接得到茶皂素脱羧钙沉淀，反应工艺简单，产物分离方便。反应以油茶皂素为原料，排除了茶籽粉中蛋白质大分子、糖类物质等的干扰，可获得高质量螺威，并能实现连续化生产。

2、在茶皂素脱羧钙盐酸化得到螺威时，应用水作为溶剂，利用螺威溶解度与溶剂极性的关系，便于将螺威与其它物质分离，操作简单，成本低廉。

3、本发明原料与副产品均能够循环利用，副产品硫酸钙、乙酸、2-甲基-2-丁烯酸是重要的化工原料。本发明对环境污染极低，符合绿色化工生产要求。

4、较已有方法而言，以茶皂素为原料可得到高含量螺威原料药(经高效液相色谱法检测，含量为53.26％，如图3)，保障螺威质量(提纯后的螺威经高效液相检测纯度可达90％以上)，为螺威在生物农药领域的进一步应用提供了支持。

5、国内油茶皂素拥有巨大的年产量，价格低廉，但应用范围有限。通过本发明可以制得纯品螺威，使油茶皂素变废为宝，大幅提高其经济价值与农业价值。

附图说明

图1是本发明的制备流程示意图。

图2是螺威红外光谱图。特征吸收光谱是3427cm^-1，2927cm^-1，1727cm^-1，1645cm^-1，1375cm^-1，1234cm^-1，1078cm^-1，1045cm^-1，640cm^-1。

图3是螺威的高效液相色谱图。

具体实施方式

实施例1：

1、油茶皂素的水解、钙化

称取1.1g氢氧化钙于三口烧瓶中，加入75ml去离子，水搅拌均匀，再称取8.3g的油茶皂素(质量分数为60％，含油茶皂素5g)，搅拌混合均匀后，将其加热至40℃，使用搅拌器搅拌，稳定反应12h，获得土黄色的皂素钙，用少量去离子水洗涤1～2次。用真空泵抽滤后将皂素钙放入真空干燥箱50-75℃干燥12h，即可得到6.4g的干燥皂素钙，收率为77.1％。

2、皂素钙的酸化制螺威溶液

将上一步所得的皂素钙固体用100ml去离子水分散，并用磁力搅拌子进行搅拌，在室温下用分液漏斗逐滴加入质量分数为10％的硫酸，土黄色固体逐渐溶解，溶液底部有白色的硫酸钙沉淀生成。待溶液ph稳定在4～5之间时，停止加入硫酸，抽滤得到硫酸钙固体、螺威与油茶皂素的混合溶液。

3、螺威精制

向上一步所得的螺威与油茶皂素混合溶液中加入丙酮，溶液极性降低，硫酸钙、螺威、油茶皂素的溶解度会依次降低。随着丙酮逐渐加入，当加入的丙酮体积为50ml时，硫酸钙沉淀量最大，抽滤除去硫酸钙，继续向溶液中加入丙酮。当加入的丙酮体积为130ml时，螺威沉淀量最大，抽滤获得螺威固体与滤液，将固体螺威放入真空干燥箱50-75℃干燥12h，即可得到3.3g的干燥螺威固体，收率为40％。将滤液置于减压蒸馏装置中，蒸馏回收丙酮，蒸馏后剩余残液作为下一次油茶皂素水解、钙化的溶剂。

实施例2：

1、油茶皂素的水解、钙化

称取1.1g氢氧化钙于三口烧瓶中，加入75ml去离子，水搅拌均匀，再称取8.3g的油茶皂素(质量分数为60％，含油茶皂素5g)混合均匀后，将其加热至50℃，稳定反应12h，获得土黄色的皂素钙，用少量去离子水洗涤1～2次。用真空泵抽滤后将皂素钙放入真空干燥箱50-75℃干燥12h，即可得到7.1g的干燥皂素钙，收率为85.5％。

2、皂素钙的酸化制螺威溶液

按照实施例1中的操作步骤将上一步获得的皂素钙酸化得到螺威溶液。

3、螺威精制

按照实施例1中的操作步骤处理螺威溶液，可得到螺威固体3.8g，收率为46％。滤液的减压蒸馏同实施例1。

实施例3：

称取1.1g氢氧化钙于三口烧瓶中，加入75ml去离子，水搅拌均匀，再称取8.3g的油茶皂素(质量分数为60％，含油茶皂素5g)，搅拌混合均匀后，将其加热至90℃。使用搅拌器搅拌，稳定反应12h，未能得到皂素钙沉淀，反应液变黑并伴有恶臭味，对反应液进行molish实验libermannburchard实验，发现没有特征颜色，可判断在90℃的温度下反应12h会导致油茶皂素变质。

实施例4：

1、油茶皂素的水解、钙化

称取1.7g氢氧化钙，加入75ml去离子水，搅拌，配成饱和溶液，装入三颈烧瓶。称取8.3g的油茶皂素(含量为60％，含油茶皂素5g)，装入三颈烧瓶，搅拌混合均匀后，将其加热至50℃。使用搅拌器搅拌，稳定反应12h，获得土黄色的皂素钙，用少量去离子水洗涤1～2次。用真空泵抽滤后将皂素钙放入真空干燥箱50-75℃干燥12h，即可得到7.3g的干燥皂素钙，收率为87.9％。

2、皂素钙的酸化制螺威溶液

按照实施例1中的操作步骤将上一步获得的皂素钙酸化得到螺威溶液。

3、螺威精制

按照实施例1中的操作步骤处理螺威溶液，可得到螺威固体4.2g，收率为51％。滤液的减压蒸馏同实施例1。

实施例5：

1、油茶皂素的水解、钙化

称取2.2g氢氧化钙，加入75ml去离子水，搅拌，配成饱和溶液，装入三颈烧瓶。称取8.3g的油茶皂素(含量为60％，含油茶皂素5g)，装入三颈烧瓶，搅拌混合均匀后，将其加热至50℃。使用搅拌器搅拌，稳定反应12h，获得土黄色的皂素钙，用少量去离子水洗涤1～2次。用真空泵抽滤后将皂素钙放入真空干燥箱50-75℃干燥12h，即可得到8.1g的干燥皂素钙，收率为97.6％。

2、皂素钙的酸化制螺威溶液

按照实施例1中的操作步骤将上一步获得的皂素钙酸化得到螺威溶液。

3、螺威精制

按照实施例1中的操作步骤处理螺威溶液，可得到螺威固体4.4g，收率为53％。滤液的减压蒸馏同实施例1。

实施例6：

1、油茶皂素的水解、钙化

称取2.2g氢氧化钙，加入75ml去离子水，搅拌，配成饱和溶液，装入三颈烧瓶。称取8.3g的油茶皂素(含量为60％，含油茶皂素5g)，装入三颈烧瓶，搅拌混合均匀后，将其加热至50℃。使用搅拌器搅拌，稳定反应5h，获得土黄色的皂素钙，用少量去离子水洗涤1～2次。用真空泵抽滤后将皂素钙放入真空干燥箱50-75℃干燥12h，即可得到6.5g的干燥皂素钙，收率为78.3％。

2、皂素钙的酸化制螺威溶液

按照实施例1中的操作步骤将上一步获得的皂素钙酸化得到螺威溶液。

3、螺威精制

按照实施例1中的操作步骤处理螺威溶液，可得到螺威固体3.2g，收率为38.6％。滤液的减压蒸馏同实施例1。

实施例7：

1、油茶皂素的水解、钙化

称取2.2g氢氧化钙，加入75ml去离子水，搅拌，配成饱和溶液，装入三颈烧瓶。称取8.3g的油茶皂素(含量为60％，含油茶皂素5g)，装入三颈烧瓶，搅拌混合均匀后，将其加热至50℃。使用搅拌器搅拌，稳定反应15h，获得土黄色的皂素钙，用少量去离子水洗涤1～2次。用真空泵抽滤后将皂素钙放入真空干燥箱50-75℃干燥12h，即可得到8.2g的干燥皂素钙，收率为98.8％。

2、皂素钙的酸化制螺威溶液

按照实施例1中的操作步骤将上一步获得的皂素钙酸化得到螺威溶液。

3、螺威精制

按照实施例1中的操作步骤处理螺威溶液，可得到螺威固体4.7g，收率为57％。滤液的减压蒸馏同实施例1。

实施例8：

1、油茶皂素的水解、钙化

按照实施例7中的步骤制得8.2g的干燥皂素钙。

2、皂素钙酸化制螺威溶液

按照实施例1中的步骤将8.2g皂素钙酸化得到螺威溶液。

3、螺威精制

向上一步所得的螺威与油茶皂素混合溶液中加入乙醚，溶液极性降低，有固体析出，当加入的丙酮体积为30ml时，硫酸钙沉淀量最大，抽滤除去硫酸钙，继续向溶液中加入乙醚。当加入的乙醚体积为90ml时，螺威沉淀量最大，抽滤获得螺威固体与滤液，将固体螺威放入真空干燥箱50-75℃干燥12h，即可得到2.1g的干燥螺威固体，收率为25％。将滤液置于减压蒸馏装置中，蒸馏回收乙醚，蒸馏后剩余残液作为下一次油茶皂素水解、钙化的溶剂。

实施例9：

1、油茶皂素的水解、钙化

按照实施例7中的步骤制得8.2g的干燥皂素钙。

2、皂素钙酸化制螺威溶液

按照实施例1中的步骤将8.2g皂素钙酸化得到螺威溶液。

3、螺威精制

向上一步所得的螺威与油茶皂素混合溶液中加入乙酸乙酯，溶液极性降低。当加入的乙酸乙酯体积为60ml时，硫酸钙沉淀量最大，抽滤除去硫酸钙，继续向溶液中加入乙酸乙酯。当加入的乙酸乙酯体积为160ml时，螺威沉淀量最大，抽滤获得螺威固体与滤液，将固体螺威放入真空干燥箱50-75℃干燥12h，即可得到2.6g的干燥螺威固体，收率为31％。将滤液置于减压蒸馏装置中，蒸馏回收乙酸乙酯，蒸馏后剩余残液作为下一次油茶皂素水解、钙化的溶剂。