一种表达软骨素6-硫酸转移酶基因的重组菌及其应用的制作方法

本发明涉及一种表达软骨素6-硫酸转移酶基因的重组菌及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术：

硫酸软骨素(chondroitinsulfate，cs)是一种由葡萄糖醛酸(d-glcua)与n-乙酰半乳糖胺(galnac)以β-1,3键和β-1,4键交替连接而成的直链酸性粘多糖，其硫酸化结构具有多种形式，目前药用的主要是a和c异构体。硫酸软骨素c(csc)具有多种生物活性和药用价值，在临床上用于治疗风湿病和关节炎，可赋予软骨凝胶样特性和抗变形能力，享有人体“软黄金”之称，同时csc可以作为膳食补充剂和保湿剂，广泛应用于食品和化妆品领域。

目前，硫酸软骨素c工业化的主要生产方法为动物组织提取法，即采用碱水解、蛋白酶酶解等工艺方法从猪、牛、鲨鱼等动物软骨中制得。但是提取法自身存在诸多问题，如原材料限制、生产工艺复杂、产品质量不稳定、产业水平不高、环境污染严重等，严重制约了硫酸软骨素c产业的发展。

因此，国内外学者不断探索寻求利用生物法高效生产硫酸软骨素c的方法。酶法合成硫酸软骨素c的方法具有高选择性、高效性、无毒低污染等特点而逐渐受到了人们广泛的关注。软骨素可以在软骨素6-硫酸转移酶(c6st)的催化下一步合成硫酸软骨素c，目前软骨素6-硫酸转移酶主要从动物细胞中提取，成本高不利于工业化生产。zhouzhengxiong等人已经成功将rat来源的c6st通过ppic9k质粒连接，在p.pastoris宿主中进行了异源表达(zhouzhengxiong,biotechnologyandbioengineering,2018,115:1561-1570)，但其获得的c6st的酶活力仅为5.98u/l，无法达到工业上生产csc的需求。因此，如何获得高产量的c6st成为高效合成硫酸软骨素c的首要问题。

技术实现要素：

本发明通过对表达系统的筛选最终获得一株表达软骨素6-硫酸转移酶基因的重组大肠杆菌，其分泌表达的c6st的酶活力高达51.6u/ml，为硫酸软骨素c的高效合成创造了条件。

本发明的第一个目的在于提供一种表达软骨素6-硫酸转移酶的重组菌，是以大肠杆菌或枯草芽孢杆菌为宿主，表达氨基酸序列如seqidno.1所示的软骨素6-硫酸转移酶(c6st)基因。

在本发明的一种实施方式中，所述软骨素6-硫酸转移酶(c6st)的核苷酸序列如seqidno.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是以pht101为表达载体在枯草芽孢杆菌中表达。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是分别以pet22a、pet20b或ptrchisa为表达载体在大肠杆菌中表达。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是将c6st基因通过寡肽连接子gggs与麦芽糖融合蛋白基因连接后，再与表达载体相连。

在本发明的一种实施方式中，所述寡肽连接子gggs的氨基酸序列如seqidno.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述麦芽糖蛋白mbp基因的核苷酸序列如seqidno.3所示。

本发明的第二个目的在于提供一种所述重组菌的构建方法，是将麦芽糖融合蛋白、寡肽连接子gggs、软骨素6-硫酸转移酶c6st基因依次融合后，连接到表达载体上得到重组质粒，然后转化到宿主菌中。

在本发明的一种实施方式中，所述构建方法步骤如下：

(1)将氨基酸序列如seqidno.1所示的c6st基因通过氨基酸序列如seqidno.2所示的寡肽连接子gggs基因与麦芽糖融合蛋白mbp基因连接，得到融合蛋白mbp-c6st基因；

(2)将mbp-c6st基因分别与质粒pht101、pet22a、pet20b、ptrchisa连接，得到重组质粒pht101-mbp-c6st、pet22a-mbp-c6st、pet20b-mbp-c6st、ptrchisa-mbp-c6st；

(3)将上述获得的重组质粒分别转化到宿主菌b.subtilis或e.coli中得到重组菌：b.subtilis168-pht101-mbp-c6st和e.colibl21-pet22a-mbp-c6st、e.colibl21-pet20b-mbp-c6st、e.colibl21-ptrchisa-mbp-c6st。

本发明的第三个目的在于提供一种生产软骨素6-硫酸转移酶c6st的方法，是以所述的重组菌进行发酵生产。

本发明的第四个目的在于提供一种生产硫酸软骨素c的方法，其特征在于，所述方法是以软骨素为底物，利用所述重组菌的粗酶液进行发酵生产。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵生产是在硫酸根供体3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(paps)再生系统中进行。

在本发明的一种实施方式中，所述paps再生系统含有：3’-磷酸腺苷-5’-磷酸(pap)、3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸(paps)和酰基硫酸转移酶(astiv)。

在本发明的一种实施方式中，所述paps再生系统的体系为：20-100mmtris-hcl(ph为7.0)，1-100mmpap，1-300mmpnps，0.1-10mlastiv粗酶液。

本发明的一种实施方式中，所述生产硫酸软骨素c的方法具体为：在20-100mm的ph为7.0的tris-hcl溶液中，加入1-100mmpap，1-300mmpnps，0.1-10mlastiv粗酶液，0.1-5mlc6st粗酶液，20-70℃反应20-60h。

本发明还提供所述的重组菌在制药领域的应用。

本发明有益效果

本发明采用不同质粒与载体表达软骨素6-硫酸转移酶，构建得到四株重组菌b.subtilis168-pht101-mbp-c6st和e.colibl21-pet22a-mbp-c6st、e.colibl21-pet20b-mbp-c6st、e.colibl21-ptrchisa-mbp-c6st，实现了软骨素6-硫酸转移酶的高效表达，最终酶活分别达到了36.3u/ml、40.2u/ml、38.4u/ml、51.6u/ml。以该酶为催化剂，软骨素为底物一步催化合成硫酸软骨素c，最终转化效率达到了80％。本发明方法在工业上用于硫酸软骨素c的合成具有潜在且非常广泛的价值。

附图说明

图1：重组表达软骨素6-硫酸转移酶的酶活比较图。1：菌株b.subtilis168-pht101-mbp-c6st，2：菌株e.colibl21-pet22a-mbp-c6st，3：菌株e.colibl21-pet20b-mbp-c6st，4：菌株e.colibl21-ptrchisa-mbp-c6st；

图2：csc的反应液经软骨素酶abc酶解后的高效液相色谱图。

具体实施方式

序列表中相关核苷酸序列信息：

(1)seqidno.1序列为来源于动物的软骨素6-硫酸转移酶的氨基酸序列；

(2)seqidno.2序列为寡肽连接子gggs的氨基酸序列；

(3)seqidno.3序列为来源于大肠杆菌的麦芽糖融合蛋白的核苷酸序列；

(4)seqidno.4序列信息为来源于动物的软骨素6-硫酸转移酶的核苷酸序列；

(5)seqidno.5序列信息为来源于动物细胞的硫磺基转移酶的核苷酸序列；

实施例1：重组表达载体的构建

(1)融合蛋白mbp-c6st基因片段的获得

为了使动物细胞来源的c6st基因能够在微生物细胞中高效表达，需要在该酶的n端融合来源于大肠杆菌的麦芽糖标签蛋白(maltosebindingprotein，mbp)。

以人工合成的核苷酸序列如seqidno.3所示的mbp基因为模板，利用引物mbp-s和rh-mbp-c6st-a扩增得到mbp基因，同时以人工合成的核苷酸序列如seqidno.4所示的c6st基因为模板，利用引物rh-mbp-c6st-s和c6st-a扩增得到c6st基因，然后采用融合pcr技术对mbp基因和c6st基因进行融合，最后利用引物mbp-s和c6st-a扩增得到融合蛋白mbp-c6st基因。

(2)pht101-mbp-c6st的构建

以步骤(1)得到的mbp-c6st基因为模板，利用引物pht-101-s和pht-101-a，扩增得到mbp-c6st基因，然后利用一步同源重组试剂盒将mbp-c6st基因整合至pht101质粒上，得到重组载体pht101-mbp-c6st。

(3)pet22a-mbp-c6st的构建

以步骤(1)得到的mbp-c6st基因为模板，利用引物pet22a-s和pet22a-a，扩增得到mbp-c6st基因，利用一步同源重组试剂盒将mbp-c6st基因整合至pet22a质粒上，得到重组载体pet22a-mbp-c6st。

(3)pet20b-mbp-c6st的构建

以步骤(1)得到的mbp-c6st基因为模板，利用引物pet20b-s和pet20b-a，扩增得到mbp-c6st基因，利用一步同源重组试剂盒将mbp-c6st基因整合至pet20b质粒上，得到重组载体pet20b-mbp-c6st。

(4)ptrchisa-mbp-c6st的构建

以步骤(1)得到的mbp-c6st基因为模板，利用引物ptrchisa-s和ptrchisa-a，扩增得到mbp-c6st基因，利用一步同源重组试剂盒将mbp-c6st基因整合至ptrchisa质粒上，得到重组载体ptrchisa-mbp-c6st。

表1引物序列表

实施例2：工程菌株的构建

(1)重组枯草芽孢杆菌的构建

挑取b.subtilis168单菌落接种于含有5mlgmi溶液的试管中，置于30℃200rpm摇床培养16h，得到第一次种子液。取第一次种子液2ml转接到18ml新鲜的gmi溶液中，在37℃200rpm条件下培养3.5h，得到第二次种子液。取第二次种子液10ml转接到90mlgmii溶液中，在37℃200rpm条件下培养90min后，在4℃下以5,000g离心10min收集菌体，去除上清液但保留10ml液体用于悬浮菌体，悬浮后的菌体即为感受态细胞可以直接用来热击转化(45℃，90s)。在b.subtilis168感受态细胞中加入适量重组质粒pht101-mbp-c6st，置于37℃200rpm培养90min后，涂布加有chl抗性的lb培养基，将验证正确的工程菌株命名为b.subtilis168-pht101-mbp-c6st。

(2)重组大肠杆菌的构建

挑取e.colibl21单菌落接种于含有25mllb液体培养基的三角瓶中，置于37℃200rpm条件下培养8h后进行转接，接种量为2％。当菌体浓度达到0.48左右时开始制备感受态细胞。在4℃下以6000rpm离心5min收集菌体，去除上清液。分别用10％甘油洗涤菌体三次后进行电击转化，分别加入适量的重组质粒pet22a-mbp-c6st、pet20b-mbp-c6st和ptrchisa-mbp-c6st。置于37℃200rpm培养60min后，分别涂布相应抗性(kan、amp)筛选培养基，验证正确的工程菌株命名为e.colibl21-pet22a-mbp-c6st、e.colibl21-pet20b-mbp-c6st和e.colibl21-ptrchisa-mbp-c6st。

实施例3：3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸paps再生系统的构建

在c6st反应体系中，需要硫酸根的供体3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸paps，因此，可根据文献(yuh-shyongyang,proteinexpressionandpurification,1996,8:423–429)中记载的方法，表达得到酰基硫酸转移酶astiv，并以此构建3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸paps再生系统。以下给出具体的操作步骤：

(1)酰基硫酸转移酶astiv的表达

本发明所用的酰基硫酸转移酶基因astiv来源于动物小鼠。以质粒ptrchisa为表达载体，核苷酸序列如seqidno.5所示的人工合成基因片段astiv为目的片段，通过酶切连接的方法构建表达载体ptrchisa-astiv。将表达载体ptrchisa-astiv转入e.colibl21中得到重组菌e.colibl21-ptrchisa-astiv。

挑取重组菌株e.colibl21-ptrchisa-astiv的单菌落接种至lb液体培养基中，37℃，200r/min中培养10小时后进行转接，转接量为5％，当od600为0.8左右时，采用0.4mm的iptg进行诱导，诱导时间为8h。摇瓶培养结束后收集菌体，超声破碎，离心所得上清液即为astiv的粗酶液。

表2引物序列表

(2)3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(paps)再生系统的构建

paps再生系统包括：50mmtris-hcl(ph为7.0)，1mmpap，5mm3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(pnps)，0.3mlastiv粗酶液，37℃反应24h。

实施例4：c6st的表达与酶活测定

(1)重组枯草芽孢杆菌中c6st的表达

基础发酵培养基配方：基础发酵培养基(g/l)：葡萄糖10，酵母浸膏15，na2hpo4·12h2o1，mgso41，nacl8，ph7.0。

裂解缓冲液(mm/l)：nacl100，nah2po450，na2hpo450，ph7.5。

挑取工程菌株b.subtilis168-pht101-mbp-c6st接种于添加chl的lb培养基中过夜培养，37℃，200rpm条件下培养12～14h，待其od值达到0.6～0.8时，按3％的接种量接种到基础发酵培养基中，37℃，200rpm条件下继续培养16～20h，将获得的菌液低温离心(4℃，8000rpm，4～5min)，弃去上清收集沉淀菌体。在裂解缓冲液中加入溶菌酶至终浓度2mg/ml，洗涤重悬上一步收集到的菌体。将菌体重悬液进行超声波破碎15min(功率200w，超声1s，间歇2s)。将细胞破碎液进行低温离心(4℃，10000rpm，20min)，所得上清液即为c6st粗酶液。

(2)重组大肠杆菌中c6st的表达

挑取工程菌株e.colibl21-pet22a-mbp-c6st、e.colibl21-pet20b-mbp-c6st和e.colibl21-ptrchisa-mbp-c6st单菌落分别接种于添加抗生素的lb液体培养基中过夜培养。随后转接至装有100ml的lb培养基中，转接量为2％，当菌体浓度达到0.48时，采用iptg进行诱导，诱导温度为25℃，诱导时间为8h。诱导结束后，在4℃，8000rpm的条件下离心5min，利用pbs缓冲液洗涤菌体数次，超声破碎菌体15min(功率400w，超声2s，间歇3s)，离心后收集得到的上清液即为c6st粗酶液。

(3)c6st的酶活测定

软骨素6-硫酸转移酶的酶活测定方法为：1-10mg/ml软骨素，1-300mmpnps，1-100mmpap，0.1-10mlastiv粗酶液，0.1-5mlc6st粗酶液，50mm的ph为7.0的tris-hcl溶液。反应条件为：20-70℃，反应20-60h后，煮沸10min结束反应。反应液离心后收集上清液，在波长为400nm下测定对硝基苯酚的吸光值。1uc6st定义为每小时产生1μm/ml对硝基苯酚所需要的酶量。

以软骨素为底物，进行催化实验一步合成硫酸软骨素c。反应体系为：10mg/ml软骨素，15mmpnps，5mmpap，0.3mlastiv粗酶液，0.2mlc6st粗酶液，50mm的ph为7.0的tris-hcl溶液中。反应条件为：37℃条件下，反应24h后，煮沸10min结束反应。反应液离心后收集上清液，在波长为400nm下测定对硝基苯酚的吸光值。根据对c6st的酶活测定，结果如图1所示，以e.colibl21为表达宿主，ptrchisa为表达载体时c6st的酶活力最高，达到了51.6u/ml。

表3不同表达系统表达得到的c6st的酶活

实施例5：不同来源的c6st的酶活测定

参考实施例2中e.colibl21-ptrchisa-mbp-c6st的构建方法，将c6st序列的来源由musmusculus(mouse)(seqidno:1)更换为oryctolaguscuniculus(rabbit)(ncbi登录号100009563)和xenopuslaevis(africanclawedfrog)(ncbi登录号108715239)来源，构建得到重组菌株e.colibl21-ptrchisa-mbp-c6st(rabbit)和e.colibl21-ptrchisa-mbp-c6st(frog)，并按照实施例4的方法，分别表达和测定c6st的酶活，结果如表4所示，分别达到了48.3和45.6u/ml。

表4异源表达不同来源的c6st的酶活

实施例6：利用重组菌e.colibl21-pet22a-mbp-c6st生产硫酸软骨素c

csc的制备方法：以软骨素为底物构建酶催化反应体系合成csc。反应体系包括：在50mm的ph为7.0的tris-hcl溶液中，加入5mmpap，15mmpnps，0.3mlastiv粗酶液，0.2mlc6st粗酶液(实施例4步骤(1)得到的e.colibl21-pet22a-mbp-c6st生产的粗酶液)，10mg/ml软骨素，混匀后置于37℃水浴中反应24h后煮沸10min结束反应。

csc的检测方法：取上述csc制备反应液离心，加入硫酸软骨素abc酶液(其可以将csc分解成4-硫酸化二糖，4s)，混匀后置于37℃水浴中反应1h后煮沸10min结束反应。离心取上清液，0.45μm的滤膜过滤，取滤液作为样品利用高效液相色谱检测二糖成分。

csc酶解反应液用高效液相色谱法进行测定，色谱条件为：色谱柱hypersilsaxcolumn(250mm×4.6mm，5μm)，检测波长为232nm，流动相a为去离子水，流动相b为2m/l的氯化钠溶液，流速为1ml/min。

对csc制备液进行检测发现(如图2所示)，硫酸软骨素c的二糖组成单元之一的4-硫酸化二糖(4s)能够稳定存在，说明利用软骨素为底物，酶法合成硫酸软骨素c已经取得成功，并且催化效率达到了80％以上。

c6st的催化效率为：y＝[18.68*(a1-a0)+0.15]*n*10^-3。a0为对照吸光值，a1为c6st酶活测定时的吸光值，n为稀释倍数。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

sequencelisting

<110>江南大学

无锡宸明生物技术有限公司

<120>一种表达软骨素6-硫酸转移酶基因的重组菌及其应用

<160>19

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>478

<212>prt

<213>人工合成

<400>1

metalaproproleuprometglulysglyleualaleuproglnasp

151015

pheargaspleuvalhisserleulysileargglyargtyrvalleu

202530

pheleualaphevalvalilevalpheilepheileglulysgluasn

354045

lysileileserargvalserasplysleulysglnileprohisphe

505560

valalaaspalaasnserthraspproalaleuleuleusergluasn

65707580

alaserleuleuserleusergluleuaspserthrpheserhisleu

859095

argserargleuhisasnleuserleuglnleuglyvalgluproala

100105110

metgluserglnglualaglyalaglulysproserglnglnalagly

115120125

alaglythrargarghisvalleuleumetalathrthrargthrgly

130135140

serserphevalglygluphepheasnglnglnglyasnilephetyr

145150155160

leuphegluproleutrphisilegluargthrvalphepheglngln

165170175

argglyalaseralaalaglyseralaleuvaltyrargaspvalleu

180185190

lysglnleuleuleucysaspleutyrvalleuglupropheileser

195200205

proproprogluasphisleuthrglnpheleupheargargglyser

210215220

serargserleucysgluaspprovalcysthrprophevallyslys

225230235240

valpheglulystyrhiscysargasnargargcysglyproleuasn

245250255

valthrleualaglyglualacysargarglysasphisvalalaleu

260265270

lysalavalargileargglnleuglupheleuglnproleuvalglu

275280285

aspproargleuaspleuargvalileglnleuvalargaspproarg

290295300

alavalleualaserargilevalalaphealaglylystyrgluasn

305310315320

trplyslystrpleusergluglyglnaspglnleusergluaspglu

325330335

valglnargleuargglyasncysgluserileargleuseralaglu

340345350

leuglyleuargglnproalatrpleuargglyargtyrmetleuval

355360365

argtyrgluaspvalalaargargproleuglnlysalaargglumet

370375380

tyrserphealaglyileproleuthrproglnvalgluasptrpile

385390395400

glnlysasnthrglnalathrargaspserseraspvaltyrserthr

405410415

glnlysasnsersergluglnpheglulystrpargphesermetpro

420425430

phelysleualaglnvalvalglnalaalacysglyprothrmethis

435440445

leupheglytyrlysleualaargaspalaalaserleuthrasnarg

450455460

serileserleuleuglugluargglythrphetrpvalthr

465470475

<210>2

<211>12

<212>prt

<213>人工合成

<400>2

glyglythrglyglythrglyglythrthrcysthr

1510

<210>3

<211>1191

<212>dna

<213>人工合成

<400>3

atgaaaataaaaacaggtgcacgcatcctcgcattatccgcattaacgacgatgatgttt60

tccgcctcggctctcgccaaaatcgaagaaggtaaactggtaatctggattaacggcgat120

aaaggctataacggtctcgctgaagtcggtaagaaattcgagaaagataccggaattaaa180

gtcaccgttgagcatccggataaactggaagagaaattcccacaggttgcggcaactggc240

gatggccctgacattatcttctgggcacacgaccgctttggtggctacgctcaatctggc300

ctgttggctgaaatcaccccggacaaagcgttccaggacaagctgtatccgtttacctgg360

gatgccgtacgttacaacggcaagctgattgcttacccgatcgctgttgaagcgttatcg420

ctgatttataacaaagatctgctgccgaacccgccaaaaacctgggaagagatcccggcg480

ctggataaagaactgaaagcgaaaggtaagagcgcgctgatgttcaacctgcaagaaccg540

tacttcacctggccgctgattgctgctgacgggggttatgcgttcaagtatgaaaacggc600

aagtacgacattaaagacgtgggcgtggataacgctggcgcgaaagcgggtctgaccttc660

ctggttgacctgattaaaaacaaacacatgaatgcagacaccgattactccatcgcagaa720

gctgcctttaataaaggcgaaacagcgatgaccatcaacggcccgtgggcatggtccaac780

atcgacaccagcaaagtgaattatggtgtaacggtactgccgaccttcaagggtcaacca840

tccaaaccgttcgttggcgtgctgagcgcaggtattaacgccgccagtccgaacaaagag900

ctggcgaaagagttcctcgaaaactatctgctgactgatgaaggtctggaagcggttaat960

aaagacaaaccgctgggtgccgtagcgctgaagtcttacgaggaagagttggcgaaagat1020

ccacgtattgccgccaccatggaaaacgcccagaaaggtgaaatcatgccgaacatcccg1080

cagatgtccgctttctggtatgccgtgcgtactgcggtgatcaacgccgccagcggtcgt1140

cagactgtcgatgaagccctgaaagacgcgcagactcgtatcaccaagtaa1191

<210>4

<211>1437

<212>dna

<213>人工合成

<400>4

atggcgccccctctccccatggagaaaggactcgctttgcctcaggatttccgggacctt60

gtacacagcctaaagattcgaggcagatacgtcttgttcctggcatttgtggtcatagtt120

tttatcttcattgaaaaggaaaataaaatcatatccagggtctccgacaagctgaagcag180

atccctcattttgtggcagatgccaacagcactgacccagccctgctcttatcggagaat240

gcatctctcttgtccctgagcgagttggattccaccttttcccatctgcggagccgcctg300

cacaacctgagcctgcagctgggcgtggagccagcaatggagagccaggaggctggggca360

gagaagccatcccagcaggctggagcagggacccggcgccacgtgcttctcatggccacc420

acccgcacgggttcctcgttcgtgggcgagttcttcaaccagcagggcaatatcttctac480

ctcttcgagccactgtggcacatcgagcgcaccgtgttcttccagcagcgaggcgccagc540

gcggctggttcagccttggtctaccgtgatgtcctcaagcagttgttgctatgcgacctg600

tatgtgctggagcccttcatcagccctccgcccgaggaccacttgactcagttcctgttc660

cgccggggatccagccgttcactctgcgaggatccggtgtgcacacccttcgtcaagaag720

gtctttgagaagtaccactgcaggaaccgtcgctgcgggccactcaacgtgaccttggcg780

ggcgaggcctgccgccgcaaggaccacgtggccctcaaggctgtgcgcatccgtcagctg840

gagttcctgcagccgctagttgaggacccgaggttggatctacgagtcattcagctggtg900

cgcgacccccgggccgtgctggcttcacgcatagtggcctttgcgggcaagtatgagaac960

tggaagaagtggctgtccgaggggcaggaccagctgagcgaggatgaggtgcagcgattg1020

cggggcaactgtgagagcatccgcctgtctgcagagctgggcttgcggcagccagcctgg1080

ctgcgcggtcgttacatgctggtgcgctatgaggatgtggcacgcaggccactgcagaag1140

gcccgagagatgtacagctttgcgggcatccccttgaccccgcaggtggaggactggatc1200

cagaagaacacgcaggcgacacgcgacagcagcgatgtctactccactcagaaaaactct1260

tctgagcagtttgagaagtggcgcttcagcatgcctttcaagctggcacaggtggtacag1320

gctgcctgtggcccgaccatgcacctctttggctacaagttggccagggatgccgcctca1380

ctcaccaaccgctccatcagcctgctggaggagcggggcaccttctgggtcacgtag1437

<210>5

<211>876

<212>dna

<213>人工合成

<400>5

atggaattcagccgtccaccgctggtgcatgtgaagggcatcccgctgatcaagtacttt60

gcggagacgatcggcccgctgcagaattttaccgcgtggccggatgatctgctgatcagc120

acctacccgaagagcggtacgacgtggatgagtgagattctggacatgatctatcaaggc180

ggcaagctcgagaaatgcggtcgcgccccaatctatgcccgcgttccgtttctggaattc240

aagtgcccgggcgtgccgagcggtctggaaacgctggaagaaaccccagcgccacgtctg300

ctgaaaacgcatctgccactcagtctgctgccgcagagtctgctggatcagaaggtgaaa360

gtgatctacatcgcccgcaacgccaaagacgtggtggttagctactacaatttttacaac420

atggccaagctccacccagatccgggcacgtgggacagctttctggagaatttcatggac480

ggcgaggttagctacggtagctggtaccagcacgtgaaagaatggtgggaactgcgccat540

acgcatccggtgctgtatctgttctacgaggacatcaaggagaacccgaagcgcgagatc600

aaaaagattctggagttcctcggtcgcagtctgccggaggagacggttgatagcatcgtg660

caccacacgagcttcaagaagatgaaagaaaattgcatgaccaattacaccacgatcccg720

accgaaatcatggaccacaacgtgagcccgttcatgcgtaaaggcacgaccggcgactgg780

aagaacacctttaccgttgcccagaacgaacgcttcgatgcgcactacgccaagaccatg840

accgactgcgacttcaagttccgctgcgagctgtaa876

<210>6

<211>23

<212>dna

<213>人工合成

<400>6

atgaaaataaaaacaggtgcacg23

<210>7

<211>49

<212>dna

<213>人工合成

<400>7

cgcagactcgtatcaccaagggtggtggttctatggcgccccctctccc49

<210>8

<211>49

<212>dna

<213>人工合成

<400>8

gggagagggggcgccatagaaccaccacccttggtgatacgagtctgcg49

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>人工合成

<400>9

ctacgtgacccagaaggtgc20

<210>10

<211>45

<212>dna

<213>人工合成

<400>10

caccggaattagcttggtaccatgaaaataaaaacaggtgcacgc45

<210>11

<211>46

<212>dna

<213>人工合成

<400>11

tatgttacaatagctggtaccctaatccaacttcaggtagtttggc46

<210>12

<211>45

<212>dna

<213>人工合成

<400>12

gtggtggtggtggtgctcgagatgaaaataaaaacaggtgcacgc45

<210>13

<211>46

<212>dna

<213>人工合成

<400>13

aagcttgcggccgcactcgagctaatccaacttcaggtagtttggc46

<210>14

<211>45

<212>dna

<213>人工合成

<400>14

gtggtggtggtggtgctcgagatgaaaataaaaacaggtgcacgc45

<210>15

<211>46

<212>dna

<213>人工合成

<400>15

aagcttgcggccgcactcgagctaatccaacttcaggtagtttggc46

<210>16

<211>45

<212>dna

<213>人工合成

<400>16

cgatggggatccgagctcgagatgaaaataaaaacaggtgcacgc45

<210>17

<211>46

<212>dna

<213>人工合成

<400>17

gtaccagctgcagatctcgagctaatccaacttcaggtagtttggc46

<210>18

<211>26

<212>dna

<213>人工合成

<400>18

cgcggatccatggagttctcccgtcc26

<210>19

<211>31

<212>dna

<213>人工合成

<400>19

ccgctcgagtcatagttcacaacgaaacttg31