本发明属于医药技术领域，特别涉及一种通气悬浮培养细胞生产积药草黄酮的方法。
背景技术：
积药草为檀香科植物百蕊草thesiumchinenseturcz.的别名.又名百乳草(《本草图经》)，地石榴(《贵州民间方药集》)，小草(《全展选编内科》)等。积药草为檀香科多年生半寄生草本植物，春、夏季采集晒干全草入药，为我国民间常用中草药。味苦涩,性温，具有显著抗炎、解暑、镇痛和广谱抗菌作用，被称为“植物抗生素”。积药草植株较小，种子小、种壳坚硬，在自然条件下萌发困难，繁殖能力差；野生资源较少，为目前急缺的广谱抗菌中草药。积药草黄酮是积药草的主要成分之一，传统积药草黄酮的提取方法是用积药草植株的茎、叶等植物体提取所得，由于资源所限，现有的野生资源及从中提取黄酮类成分已难以满足市场的需求，因此寻找一条资源供给的新兴途径，已经变得非常必要。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种细胞培养周期短，产品收率高，工艺简单稳定，适合工业化生产的通气悬浮培养细胞生产积药草黄酮的方法。
本发明的一种通气悬浮培养细胞生产积药草黄酮的方法，包括以下步骤:
（1）种子细胞制备
取积药草嫩枝或嫩叶作为外植体在改良ms固体培养基上进行植物组织培养，待愈伤组织长出后，选择色泽鲜艳、活力旺盛的愈伤组织块，按照每4g组织块加入100ml的浓度为50-100mg/l果胶酶溶液，采用酶解法分离制备种子细胞，用100-300目微孔滤器过滤，滤液经1000rpm/min离心机分离，收集沉淀下的种子细胞；
（2）种子细胞系培养
将收集到的种子细胞接种到含有改良ms液体培养基a的摇瓶中，鲜细胞接种量为28±2g/l，ph值为5.8±0.2，培养温度为20-28℃，培养时间为1-15天，光照时间为10-24h，光强度为2000-40001ux，摇床震荡培养，当细胞密度达到7000-10000个/ml，即可放大培养；
（3）细胞放大培养
将种子细胞系培养好的种子细胞系接种于含有改良ms液体培养基b的气升式搅拌发酵罐中，培养温度为20-28℃，培养时间为15-25天，光照时间为10-24h，光照强度为2000-10000lux，气升搅拌悬浮培养调节通气速率和搅拌速率维持溶氧在30%，调节ph值为5.8±0.2；当细胞密度达到60000-100000个/ml停止培养，采用1000rpm/min低速离心或过滤法收集细胞和滤液；
（4）提取积药草黄酮
取10g细胞,加入体积浓度为60%的乙醇溶液100ml,提取温度为80℃，提取时间为2.5h，得积药草细胞黄酮粗提物；将滤液浓缩至原体积的1/10后加入乙醇至乙醇体积浓度达60%后，室温浸提12h,减压回收乙醇，过滤,滤液在温度为40℃、压力为10o-13opa下干燥24-48小时后得到褐色干提取物为积药草培养液黄酮粗提物；合并积药草细胞黄酮粗提物和积药草培养液黄酮粗提物即得积药草总黄酮粗提物；
（5）纯化:将总黄酮粗提物用径高比1:10聚酰胺柱，洗脱溶剂为70%乙醇溶液，洗脱溶剂量为2倍柱体积，分离纯化即得。
上述的一种通气悬浮培养细胞生产积药草黄酮的方法，其中：改良ms固体培养基是在ms基本培养基中加入6-苄氨基嘌呤0.1-1mg/l.萘乙酸1.0-5.0mg/l,2，4-二氯苯氧乙酸0.1-1.0mg/l,果胶酶50-100mg/l，蔗糖30g/l,琼脂5g/l。
上述的一种通气悬浮培养细胞生产积药草黄酮的方法，其中：改良ms液体培养基a是在ms培养基中加入萘乙酸1.0-5.0mg/l,6-苄氨基嘌呤1.0-5.0mg/l，蔗糖20-30g/l。
上述的一种通气悬浮培养细胞生产积药草黄酮的方法，其中：改良ms液体培养基b是在培养基为ms基本培养基加入萘乙酸1.0-5.0mg/l,6-苄氨基嘌呤1.0-5.0mg/l,果胶酶50-100mg/l,蔗糖20-30g/l，硝酸银10-40mm。
本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知：本发明利用ms液体培养基中添加植物生长调节剂和生物酶制剂促进细胞生长，通过添加浓度为10-40mm的硝酸银，以及通气调整溶氧在30%，选择适合的光照强度和温度调控和促进目的产物表达;在收获细胞之后,利用培养细胞和培养液获取积药草黄酮。本发明利用气升搅拌罐悬浮培养积药草细胞生产积药草黄酮,是采用了通气（氧气）和光照相结合进行悬浮培养细胞生产积药草黄酮,在放大培养中培养基中添加植物生长调节剂和生物酶制剂促进细胞生长并防止细胞聚集结块，为了促进目标产物的生成,添加浓度为10-40mm的硝酸银，从而使本发明细胞培养周期短，产品收率高，工艺简单稳定，适合工业化生产。
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实施例1：
一种通气悬浮培养细胞生产积药草黄酮的方法，包括以下步骤:
（1）种子细胞制备
取积药草嫩枝或嫩叶作为外植体在改良ms固体培养基上(ms培养基中加入6-苄氨基嘌呤（6-ba）0.1mg/l,萘乙酸（naa）5mg/l,2，4-二氯苯氧乙酸（2,4-d）0.1mg/l,蔗糖30g/l,琼脂5g/l)进行植物组织培养，待愈伤组织长出后，选择色泽鲜艳、活力旺盛的愈伤组织块，按照每4g组织块加入100ml的浓度为100mg/l果胶酶溶液，采用酶解法分离制备种子细胞，用(100-300目)微孔滤器过滤，滤液经1000rpm/min低速离心机分离，收集沉淀下的种子细胞；
（2）种子细胞系培养
将收集到的种子细胞接种到含有改良ms液体培养基a（在ms培养基中加入naa1.0mg/l,6-ba5.0mg/l,蔗糖20g/l,）的摇瓶中，鲜细胞接种量为28±2g/l，ph值为5.8±0.2，培养温度为20-28℃，培养时间为10天，光照时间为10h，光强度为2000-40001ux，摇床震荡培养，当细胞密度达到7000-10000个/ml，即可放大培养；
（3）细胞放大培养
将培养好的种子细胞系接种于含有改良ms液体培养基b（在ms基本培养基加入naa1.0mg/l,6-ba5.0mg/l,果胶酶100mg/l,蔗糖20g/l，硝酸银10mm，）的气升式搅拌发酵罐中，培养温度为28℃，培养时间为15天，光照时间为10h，光照强度为2000-10000lux，气升搅拌悬浮培养调节通气速率和搅拌速率维持溶氧在30%，调节ph值为5.8±0.2，当细胞密度达到60000-100000个/ml即可停止培养，采用1000rpm/min低速离心或过滤法收集积药草细胞和滤液，滤液和细胞均用于提取积药草黄酮。
（4）提取积药草黄酮
取10g细胞,加入浓度为60%的乙醇溶液100ml,提取温度为60℃，提取时间为3h，得积药草细胞黄酮粗提物；将滤液浓缩至原体积的1/10后加入乙醇至乙醇体积浓度达60%后，室温浸提12h,减压回收乙醇，过滤,滤液在温度为40℃、压力为10opa下干燥24小时后得到褐色干提取物，得积药草培养液黄酮粗提物，合并积药草细胞黄酮粗提物和积药草培养液黄酮粗提物即得积药草细胞悬浮培养总黄酮粗提物；。总黄酮含量的测定采用硝酸铝显色法测定，黄酮提取率8.1%.
纯化:分别选取聚酰胺、d101和ab-8大孔树脂对积药草细胞提取液进行静态吸附解吸实验，确定了聚酰胺树脂吸咐的效果较好，其最大静态吸咐量为0.16mg/g，解析率为90.5%。确定了聚酰胺柱分离纯化，纯化条件为径高比1:10，洗脱溶剂70%乙醇溶液，洗脱溶剂量为2倍柱体积。黄酮回收率为53%。
实施例2：
一种通气悬浮培养细胞生产积药草黄酮的方法，包括以下步骤:
（1）种子细胞制备
取积药草嫩枝或嫩叶作为外植体在改良ms固体培养基上(ms培养基中加入6-苄氨基嘌呤（6-ba）1.0mg/l萘乙酸（naa）1.0/l,2，4-二氯苯氧乙酸（2,4-d）1.0mg/l,蔗糖30g/l,琼脂5g/l进行植物组织培养，待愈伤组织长出后，选择色泽鲜艳、活力旺盛的愈伤组织块，按照每4g组织块加入100ml的浓度为50mg/l果胶酶溶液，采用酶解法分离制备种子细胞，用微孔滤器（100-300目）过滤，滤液经1000rpm/min低速离心机分离，收集沉淀下的种子细胞；
（2）种子细胞系培养
将收集到的种子细胞接种到含有改良ms液体培养基a（在ms培养基中加入naa5.0mg/l,6-ba1.0mg/l,蔗糖30g/l,）的摇瓶中，鲜细胞接种量为28±2g/l，ph值为5.8±0.2，培养温度为20-28℃，培养时间为15天，光照时间为24h，光强度为2000-40001ux，摇床震荡培养，当细胞密度达到7000-10000个/ml，即可放大培养；
（3）细胞放大培养
将培养好的种子细胞系接种于含有改良ms液体培养基b（在ms基本培养基加入naa5.0mg/l,6-ba1.0mg/l,果胶酶50mg/l,蔗糖30g/l，硝酸银40mm，）的气升式搅拌发酵罐中，培养温度为20-28℃，培养时间为25天，光照时间为24h，光照强度为2000-10000lux，气升搅拌悬浮培养调节通气速率和搅拌速率维持溶氧在30%，调节ph值为5.8±0.2，当细胞密度达到60000-100000个/ml即可停止培养，采用1000rpm/min低速离心或过滤法收集积药草细胞和滤液，滤液和细胞均用于提取积药草黄酮。
（5）提取积药草黄酮
取10g细胞,加入浓度为60%的乙醇溶液100ml,提取温度为80℃，提取时间为2.5h，得积药草细胞黄酮粗提物；将滤液浓缩至原体积的1/10后加入乙醇至乙醇体积浓度达60%后，室温浸提12h,减压回收乙醇，过滤,滤液在温度为40℃、压力为13opa下干燥48小时后得到褐色干提取物，得积药草培养液黄酮粗提物，合并积药草细胞黄酮粗提物和积药草培养液黄酮粗提物即得积药草细胞悬浮培养总黄酮粗提物；。总黄酮含量的测定采用硝酸铝显色法测定，黄酮提取率8.5%.
纯化:选取聚酰胺、d101和ab-8大孔树脂对积药草细胞提取液进行静态吸附解吸实验，确定了聚酰胺树脂吸咐的效果较好，其最大静态吸咐量为0.16mg/g，解析率为90.5%。确定了聚酰胺柱分离纯化，纯化条件为径高比1:10，洗脱溶剂70%乙醇溶液，洗脱溶剂量为2倍柱体积。黄酮回收率为53%。
实施例3：
对比实施例
取生长4个月的积药草苗,洗干净,80℃干燥至衡重,磨成粉,取10g选择同实施例2积药草细胞黄酮相同的浸提条件：60%的乙醇溶液,提取温度为80℃，料液比为1:10（g/ml），提取时间为2.5h，此方法制备积药草细胞黄酮粗提物,总黄酮含量的测定采用硝酸铝显色法测定，黄酮提取率8.3%.
以上实施实例及对比实例结果表明，悬浮培养细胞生产积药草黄酮15-25天收获的积药草黄酮含量接近或超过生长4个月积药草苗。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
请认真核对以下各实施例是否体现了发明内容部分技术方案的所有内容，参数两端值。