一种食品中绵羊源成分快速检测方法及试剂盒与流程

本发明涉及生物物种鉴定技术领域，具体的说涉及一种检测食品中绵羊源成分的环介导等温扩增技术(lamp)结合胶体金核酸试纸条检测的快速检测试剂盒。

背景技术：

随着经济的高速发展，人民生活水平的提高，我国居民对肉类食品的需求逐年增加。尽管许多国家明确规定要求食品标签真实明确地标出肉的种类、来源，禁止掺假行为，但是市场上仍有很多肉类掺假的事件发生，例如为了降低成本，驴肉火烧中掺入了猪肉，羊肉中掺入牛肉或猪肉，香肠中掺杂其他肉类等等行为。目前，对于食品掺假的检测方法主要是pcr方法。pcr方法需要依靠特殊仪器，且最终结果的判断需要琼脂糖凝胶电泳完成，整个过程耗时较长。因此，本发明目的是提供一种食品中绵羊源成分的快速灵敏检测试剂盒。

目前，内标准基因已被广泛地用于鉴别食品掺假，但如何筛选出合适的内标准基因显得尤为重要。目前国内外的肉制品掺假检测技术多是针对线粒体上的基因设计特异引物来进行实时荧光定量pcr扩增，由于线粒体基因为多拷贝基因，其检测灵敏度高，但同时在区分由于销售、运输等过程所产生的无意识交叉污染与有意识的非法添加时存在困扰。另外，高拷贝数线粒体dna的浓度无法和基因组dna的浓度相对应，因此无法对样品进行精确定量分析，同时由于线粒体基因同源性极高，难以通过普通pcr实现定性检测。因此，该方法只能借助荧光定量pcr实现肉类掺假的筛选鉴别。若要鉴别低浓度的无意交叉污染和有意非法添加并明确掺假比例实现快速筛查，则要选择染色体上的低拷贝基因作为肉类内标准基因。

环介导等温核酸扩增技术(loop-mediatedisothermamplification,lamp)是由notomi于2000年开发的一种新型的恒温核酸扩增方法，其原理是利用一种链置换dna聚合酶(bstdnapolymerase)和两对特殊的引物,特异地识别靶序列上的6个独立区域，在等温条件下(65℃左右)保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应。

胶体金核酸试纸条是依靠抗原与抗体的特异性结合，因此其具有极高的灵敏度。本发明将lamp技术同胶体金核酸试纸条检测结合起来，提供一种食品中绵羊源成分的快速灵敏检测试剂盒。本发明无需复杂的仪器，时间短，操作简单，灵敏度高，完全可以满足现场检测的需求。

技术实现要素：

本发明的目的是提供用于检测食品中绵羊源成分的绵羊源通用内标准基因。

本发明另一目的在于提供一种具有高灵敏度、高特异性、操作简单的检测食品中绵羊源成分的lamp结合胶体金核酸试纸条检测的快速检测试剂盒。

一种用于检测食品中绵羊源成分的基因，其为内标准基因calponin，具有seqidno.1所示的序列。

本发明提供了上述内标准基因calponin在检测绵羊源成分中的应用。

本发明提供了上述内标准基因calponin在食品中绵羊源成分鉴定中的应用。

本发明提供了一种用于检测上述内标准基因calponin的特异性lamp引物组合，包括以下4条引物：

f3：5’-ctcactcctctgacagtcct-3’(seqidno.2)；

b3：5’-cctggggcaacagaatgg-3’(seqidno.3)；

fip：5’-gctaacctccaggcctcagtttggtgggtactgttaccgtca-3’(seqidno.4)；

bip：5’-agctgaaccctggaaatcaggcactgaggctcagagaaggt-3’(seqidno.5)。

其中内引物fip的5’端标记生物素(biotin)，bip的5’端标记荧光素(cy5)。

本发明提供了上述特异性lamp引物组合在绵羊源成分鉴定中的应用。

本发明提供了上述特异性lamp引物组合在制备绵羊源成分检测试剂盒或检测试剂中的应用。

进一步地，本发明提供一种含有上述特异性lamp引物组合的检测绵羊源成分的快速检测试剂盒。

本发明提供一种检测食品中绵羊源成分的方法，包括以下步骤：

(1)待测样品提取dna；

(2)以提取dna为模板，采用权利要求3所述特异性lamp引物组合进行lamp检测；

(3)结果判断：采用胶体金核酸试纸条进行结果判断，检测t线和质控c线均有红色条带，含有目的基因；质控c线有红色条带，而检测t线无条带，不含有目的基因。

上述方法中，步骤(2)所述lamp检测，其25μllamp检测体系的具体配置为：1×thermopolbuffer，0.4mmdntp，3mmmgso4，1.0m甜菜碱，1.6μm引物fip，1.6μm引物bip，0.2μm引物f3，0.2μm引物b3，8ubstdna聚合酶大片段。

上述方法中，lamp检测反应条件为：60-65℃恒温20min，85℃5min，然后终止反应。

上述方法中，步骤(3)所述的胶体金核酸试纸条包含胶体金核酸试纸条测试线与质控线，测试线标记有cy5抗体，质控线标记有生物素二抗，结合垫有胶体金-生物素抗体标记物。

本发明首次在染色体上筛选出绵羊源内标准基因。本发明用多个品种绵羊验证内标准基因，证明该内标准基因稳定，不存在等位基因变异。内标准基因的选择一般要求拷贝数低且稳定，一般动物内标准基因常选择在线粒体上，这样的内参基因拷贝数多，不易于定量。本发明选择染色体上的基因做为内标准基因，其拷贝数低，易于定量，相比于线粒体上的基因，突变率更低。

图1为环介导等温扩增与胶体金核酸试纸条检测方法原理图。本发明利用lamp反应，设计4条引物针对绵羊特异性内标准基因靶序列6个特异区域来进行等温扩增。在lamp的内引物fip与bip分别标记生物素(biotin)与荧光素(cy5)。通过lamp反应即可产生大量的带有生物素与荧光素的双链dna靶物质。然后用胶体金核酸试纸条检测lamp反应产物。胶体金核酸试纸条测试线(tl)与质控线(cl)分别标记有cy5抗体和生物素二抗，结合垫有胶体金-生物素抗体标记物。当lamp反应产物滴加到试纸条样品垫时，由于毛细管作用，产物会依次经过结合垫、检测线(tl)、质控线(cl)，由于“抗原-抗体”的特异性结合作用和胶体金聚沉作用，lamp反应产物为阳性时，测试线(tl)与质控线(cl)均有红色条带；反应产物为阴性时，则只有质控线(cl)有红色条带。

胶体金核酸试纸条是依靠抗原与抗体的特异性结合，因此其具有极高的灵敏度。本发明通过将绵羊肉肉末与非绵羊肉肉末进行5倍梯度等质量的混合，通过lamp反应结合胶体金核酸试纸条检测以探究本检测方法的灵敏性。结果显示，本发明检测试剂盒的检测极限为0.16％(w/w)。

基于本发明确定的用于检测食品中绵羊源成分的内标准基因calponin，本发明设计了用于检测该基因的lamp引物组合，应用lamp反应结合胶体金核酸试纸条可检测待测样品中是否有绵羊源成分，此反应快速，费时少，特异性好，灵敏度高，操作简单，不需要专业人员操作，结果易于观察，非常适于基层食品监督检验使用。

附图说明

图1为环介导等温扩增与胶体金核酸试纸条检测的快速检测试剂盒的原理；

图2为绵羊特异性内标准基因在16种动物中的lamp扩增，泳道1为绵羊的lamp产物，1：绵羊；2：牛；3：猪；4：山羊：5：鸡；6：鸭；7：鹅：8：马；9：驴；10：鹿；11：牦牛；12：水牛；13：貂；14：骆驼；15：鱼；16：大鼠；m:makerdl2000；

图3为绵羊源lamp产物胶体金核酸试纸条检测中阳性与阴性结果的判断，样品1的测试线(tl)与质控线(cl)均有红色条带则证明为阳性样品，样品2只有质控线(cl)有红色条带则为阴性样品；

图4为lamp-胶体金核酸试纸条的检测灵敏度试验，1：混合梯度0倍，即为原始质量的100％；2：混合梯度5倍，即为原始质量的20％；3：混合梯度25倍，即为原始质量4％；4：混合梯度125倍，即为原始质量0.8％；5：混合梯度625倍，即为原始质量0.16％；6：阴性。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

猪(susscrofa)，牛(bostaurus)，羊(ovisaries)，普通家鸡(gallusgallus)，野鸡(phasianuscolchicus)，火鸡(meleagrisgallopavo)，乌鸡(gallusdomesticusbrisson)，鸭(anasplatyrhynchos)，鹅(goosecalicivirus)，狗(canislupusfamiliaris)，兔(oryctolaguscuniculus)，牦牛(bosmutus)，黄鱼(pseudosciaenapolyactis)为超市购买。马(equuscaballus)，驴(equusasinus)为北京农贸市场购买。老鼠(musmusculus)由中国农业大学食品安全与分子生物学实验室提供。水牛(bubalusbubalis)，貂(marteszibellina)，骆驼(camelusferus)，鹿(cervus)由天津出入境检验局的李宗梦博士提供。

实施例1绵羊源通用内标准基因calponin的筛选

通过搜索genbank中关于绵羊的基因信息，将目标基因组从ncbi下载，并保存为“.fasta”格式。针对绵羊的全基因组信息进行分析，利用blast和dnamanversion4.0软件进行同源性分析，筛选出calponin基因，该基因位于染色体上，编码钙调理蛋白基因。将20种肉类(分别是普通家鸡(gallusgallus)，野鸡(phasianuscolchicus)，火鸡(meleagrisgallopavo)，乌鸡(gallusdomesticusbrisson)，猪(susscrofa)，牛(bostaurus)，羊(ovisaries)，鸭(anasplatyrhynchos)，鹅(goosecalicivirus)，狗(canislupusfamiliaris)，兔(oryctolaguscuniculus)，牦牛(bosmutus)，黄鱼(pseudosciaenapolyactis)，马(equuscaballus)，驴(equusasinus)，老鼠(musmusculus)，水牛(bubalusbubalis)，貂(marteszibellina)，骆驼(camelusferus)，鹿(cervus))的calponin基因导入dnamanversion4.0，进行多序列特异性分析，序列比对结果保存为“.seq”格式。选择特异性高的片段再进行blast分析，查找数据库中序列同源性及特异性。最后通过对序列进行整合，确定最终的特异性目标基因calponin基因可以作为内标准基因。该calponin片段的核苷酸序列如seqidno.1所示。

实施例2绵羊源成分lamp检测方法的建立

利用日本荣岩株式会社环介导引物在线设计软件lampprimerdesigningsoftwareprimerexplorerv5.0(http://primerexplorer.jp/elamp5.0.0/index.html)针对实施例1确定的calponin基因设计lamp引物，包括2条外引物f3、b3和2条内引物fip、bip，见表1。内引物fip的5’端标记生物素(biotin)，bip的5’端标记荧光素(cy5)。

表1lamp引物序列

利用lamp快速检测绵羊样品，反应体系25μl，包括1×thermopolbuffer，0.4mmdntp，3mmmgso4，1.0m甜菜碱，1.6μm引物fip，1.6μm引物bip，0.2μm引物f3，0.2μm引物b3，8ubstdna聚合酶大片段。反应程序为65℃恒温1h，85℃5min。扩增结束后，利用2％琼脂糖凝胶电泳进行产物判定，出现阶梯状条带证明扩增成功，含有目的基因。结果如图2所示，绵羊特异性内标准基因在16种动物中的lamp扩增，泳道1为绵羊的lamp产物，1：绵羊；2：牛；3：猪；4：山羊：5：鸡；6：鸭；7：鹅：8：马；9：驴；10：鹿；11：牦牛；12：水牛；13：貂；14：骆驼；15：鱼；16：大鼠；m:makerdl2000。只有绵羊样品出现明亮条带，表明calponin基因以及相应的lamp体系能用于绵羊种类的快速检测。

实施例3绵羊源成分lamp产物胶体金核酸试纸条检测方法的建立

胶体金标记抗体的制备采用柠檬酸三钠改良法制备胶体金，并用高速离心法纯化金标抗体，将制备好的金标抗体于4℃下储存备用。

分别将cy5抗体用缓冲液稀释至最佳浓度。测试线(tl)与质控线(cl)间的距离为4.5mm，按1.0μl/cm分别喷涂在nc膜上。将已喷好的nc膜37℃烘干过夜后备用。试纸条切成3.8mm宽。

将lamp反应产物与缓冲液充分混合后滴加在胶体金核酸试纸条的样品垫上，此时混合液在毛细管动力下经过结合垫与nc膜，并继续向吸水垫方向移动，3min后即可观察检测结果。如图3所示，样品1的测试线(tl)与质控线(cl)均有红色条带则证明为阳性样品，样品2只有质控线(cl)有红色条带则为阴性样品。

胶体金核酸试纸条是依靠抗原与抗体的特异性结合，因此其具有极高的灵敏度。用浓度为3％的bsa溶液对胶体金核酸试纸条进行预封闭，以在不影响其正常阳性显色的前提下避免假阳性的出现。通过将绵羊肉肉末与非绵羊肉肉末(牛、猪、老鼠等混合肉末)进行5倍梯度等质量的混合，进行lamp反应，再与胶体金核酸试纸条相结合以探究胶体金核酸试纸条检测方法的灵敏性。结果如图4所示，1：混合梯度0倍，即为原始质量的100％；2：混合梯度5倍，即为原始质量的20％；3：混合梯度25倍，即为原始质量4％；4：混合梯度125倍，即为原始质量0.8％；5：混合梯度625倍，即为原始质量0.16％；6：阴性。当混合梯度为625倍(混合肉末质量为绵羊肉肉末质量的625倍)即为初始质量的0.16％时，检测t线特别浅，几乎与阴性对照相似，故本发明检测试剂盒的检测限为0.16％(w/w)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中国农业大学

<120>一种食品中绵羊源成分快速检测方法及试剂盒

<130>mp1907457z

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>422

<212>dna

<213>绵羊calponin(ovisariescalponin)

<400>1

aggtatggccctttcctcgcctgggtcttgctgatgagctgtggttgaggagggcaccct60

ggtccctgcaggctttggtgggttggagcgggtacagaatatgtggtctttaggaaaccc120

tatgcttagcattttcggtaccttaactcactcctctgacagtcctagggggtgggtact180

gttaccgtcatgccctttatacagatgggaaaactgaggcctggaggttagcacacttgc240

taggattgctcaggtgatgagtagctgaaccctggaaatcaggccacttagcagtcatgt300

gacacaccttctctgagcctcagtttccattctgttgccccaggggggtggaaacagggc360

ctcattagagggccatgtgactgctgacatcagtagtgtctggtcgctttcggtgggatc420

ct422

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ctcactcctctgacagtcct20

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cctggggcaacagaatgg18

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gctaacctccaggcctcagtttggtgggtactgttaccgtca42

<210>5

<211>41

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

agctgaaccctggaaatcaggcactgaggctcagagaaggt41