一种快速鉴定食品中猪源成分的试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及生物物种鉴定技术领域，具体的说涉及一种检测食品中猪源成分的非对称pcr-dna银纳米簇快速检测试剂盒。

背景技术：

随着经济的高速发展，人民生活水平的提高，我国居民对肉类食品的需求逐年增加。尽管许多国家明确规定要求食品标签真实明确地标出肉的种类、来源，禁止掺假行为，但是市场上仍有很多肉类掺假的事件发生，例如为了降低成本，驴肉火烧中掺入了猪肉，羊肉中掺入牛肉或猪肉，香肠中掺杂其他肉类等等行为。目前，对于食品掺假的检测方法主要是pcr加琼脂糖凝胶电泳的方法，最终结果的判断需要借助凝胶成像系统等大型仪器来完成，过程比较繁琐且耗时较长。因此，本发明目的是提供一种食品中猪源成分的快速灵敏检测试剂盒。

目前，内标准基因已被广泛地用于鉴别食品掺假，但如何筛选出合适的内标准基因显得尤为重要。目前国内外的肉制品掺假检测技术多是针对线粒体上的基因设计特异引物来进行实时荧光定量pcr扩增，由于线粒体基因为多拷贝基因，其检测灵敏度高，但同时在区分由于销售、运输等过程所产生的无意识交叉污染与有意识的非法添加时存在困扰。另外，高拷贝数线粒体dna的浓度无法和基因组dna的浓度相对应，因此无法对样品进行精确定量分析，同时由于线粒体基因同源性极高，难以通过普通pcr实现定性检测。因此，该方法只能借助荧光定量pcr实现肉类掺假的筛选鉴别。若要鉴别低浓度的无意交叉污染和有意非法添加并明确掺假比例实现快速筛查，则要选择染色体上的低拷贝基因作为肉类内标准基因。

非对称pcr是以双链dna为模板，通过在体系中加入不等量的一对引物，经过循环扩增产生大量单链dna(single-stranddna，ssdna)的技术。该技术是获取单链靶标dna的重要方法。银纳米簇合成模板包括有机模板和无机模板两类，有机模板主要有dna和多肽等。以dna为模板的银纳米簇是通过胞嘧啶与银离子(ag+)在高结合力下形成dna-ag+复合物，然后利用硼氢化钠还原银离子，从而形成的具有高量子产率且激发波长可调的小分子荧光探针。银纳米簇探针与传统的荧光探针相比较，最大的特点是无需荧光基团标记，而且对dna成核序列有特异性的结合作用，在分子生物学领域具有巨大应用潜能。

本发明将非对称pcr与dna银纳米簇相结合，利用非对称pcr扩增出筛选出的特异性内标准基因特异序列，然后设计与单链靶标特异性互补的dna银纳米簇探针，获得在紫外(365nm)条件下可视的荧光产物，以检测物种成分和鉴定物种来源。本发明操作简单，无需凝胶电泳等繁琐的检测，灵敏度高，完全满足食品中猪源成分快速检测的需求。

技术实现要素：

本发明的目的是提供用于检测食品中猪源成分的猪源通用内标准基因。

本发明另一目的在于提供一种具有高灵敏度、高特异性、操作简单的检测食品中猪源成分的非对称pcr-dna银纳米簇快速检测试剂盒。

一种用于检测食品中猪源成分的基因，其为内标基因actb，具有seqidno.1所示的序列。

本发明提供了上述内标准基因actb在检测猪源成分中的应用。

本发明提供了上述内标准基因actb在食品中猪源成分鉴定中的应用。

本发明提供了一种用于检测上述内标准基因actb的特异性非对称pcr引物组合，包括以下两条引物，f为非限制引物，r+polyc为限制引物r的5’端连接dna-银纳米簇激发序列polyg的反向互补序列polyc：

f：agacaatcccggaggca(seqidno.2)；

r+polyc：ccccaccccaccccaccccctgaggcgatgttacactta(seqidno.3)。

本发明提供了上述特异性非对称pcr引物的最佳浓度比，非限制性引物(f)与限制性引物(r+polyc)的最佳浓度为10:1。

本发明提供了上述特异性非对称pcr引物组合f和r+polyc在猪源成分鉴定中的应用。

本发明提供了上述特异性非对称pcr引物组合f和r+polyc在制备猪源成分检测试剂盒或检测试剂中的应用。

进一步地，本发明提供一种含有上述特异性非对称pcr引物组合f和r+polyc的检测猪源成分的快速检测试剂盒。

本发明提供了一种dna-银纳米簇探针，包括dna成核序列、银离子(ag+)和硼氢化钠(nabh4)，dna成核序列是：cccccttaatccccc(seqidno.4)；dna探针序列是r：cctgaggcgatgttacactta(seqidno.5)。

上述的dna-银纳米簇探针中，dna银纳米簇中最佳dna成核序列初始浓度为400μm。

上述的dna银纳米簇探针中，dna成核序列与银离子和硼氢化钠的最佳比例(dna:ag+:nabh4)为1:25:25。

本发明提供一种检测食品中猪源成分的方法，包括以下步骤：

(1)待测样品提取dna；

(2)以提取dna为模板，采用所述特异性非对称pcr引物组合非限制引物f和限制引物r+polyc进行pcr扩增；

(3)非对称pcr产物与dna银纳米簇探针杂交；

(4)结果判断：特异性单链靶标会与探针特异性碱基互补结合并激发探针，其在紫外(365nm)下会产生黄色荧光，样品承阳性。

上述方法中，步骤(2)所述非对称pcr检测，其25μl检测体系的具体配置为：1×pcrbuffer，0.4mmdntp，0.8μm引物f，0.08μm引物r+polyc，1.5urtaqdnapolymerase。

上述方法中，非对称pcr检测反应条件为：95℃预变性5min；45个循环：95℃30min，53℃30s，72℃30s；72℃延伸10min。

本发明首次在染色体上筛选出猪源内标准基因。本发明用多个品种猪验证内标准基因，证明该内标准基因稳定，不存在等位基因变异。内标准基因的选择一般要求拷贝数低且稳定，一般动物内标准基因常选择在线粒体上，这样的内参基因拷贝数多，不易于定量。本发明选择第8染色体上的基因做为内标准基因，其拷贝数低，易于定量，相比于线粒体上的基因，突变率更低。

图1为银纳米簇荧光可视传感器的原理。首先提取物种的基因组(步骤1)。本发明选取c5-c5型dna成核序列，该成核序列形成的dna-银纳米簇在激发序列polyg激发下会在紫外(365nm)条件下产生黄色荧光。非对称pcr中非限制引物浓度远大于限制性引物浓度，在反应的前10-15循环过程中，非对称pcr与普通定性pcr相同，产生dna双链。当体系中限制性引物消耗完后，非限制性引物以前10-15循环中产生的dna双链为模板产生大量的dna单链。通过在非对称pcr实验中限制引物r的5’端连接dna-银纳米簇激发序列polyg的反向互补序列polyc，利用非对称pcr实验(步骤2)可产生大量3’末端为下游引物r反向互补序列r’与激发序列polyg的单链靶标。步骤3为非对称pcr产物与dna-银纳米簇探针杂交过程。将dna-银纳米簇探针的杂交链设计为与下游引物r相同的序列，如果样品为阳性，则经过步骤2产生的特异性单链靶标会与探针特异性碱基互补结合并激发探针，使其在紫外(365nm)下会产生黄色荧光。

本发明将猪肉肉末与非猪肉肉末进行等质量的混合，检测非对称pcr-dna银纳米簇方法的灵敏性。结果显示，当混合梯度为25倍(混合肉末质量为猪肉肉末质量的25倍)即为初始质量的4％时，颜色为浅红色，故本发明dna银纳米簇通用荧光试剂盒的检测限为4％(w/w)。

基于本发明确定的用于检测食品中猪源成分的内标准基因actb，本发明设计了用于检测该基因的非对称pcr引物组合，应用非特异pcr反应结合dna银纳米簇可检测待测样品中是否有猪源成分，此反应快速，费时少，特异性好，灵敏度高，操作简单，不需要专业人员操作，结果易于观察，非常适于基层食品监督检验使用。

附图说明

图1为银纳米簇荧光可视传感器的原理；

图2为非对称pcr引物特异性验证；猪扩增产物长度为181bp，1：猪；2：牛；3：绵羊；4：山羊：5：鸡；6：鸭；7：鹅：8：马；9：驴；10：鹿；11：牦牛；12：水牛；13：貂；14：骆驼；15：鱼；16：大鼠；17：阴性；m:makerdl2000；

图3为猪非对称pcr引物最佳浓度比例的探究；1：猪原始非对称pcr扩增产物163bp；2：猪限制性引物r+polyc扩增产物181bp；3、5：(f:r+polyc)比例5:1实验组；4：比例5:1阴性；6-7：比例:10:1实验组；8：比例10:1阴性；9-10：比例20:1实验组；11：比例20:1阴性；12-13：比例40:1实验组；14：比例40:1阴性；15-16：比例80:1实验组；17：比例80:1阴性；m:makerdl2000；

图4为dna成核序列浓度优化结果；1-3为dna成核序列浓度100μm组，1：阳性；2：实验；3：阴性；4-6为浓度200μm组，4：阳性；5：实验；6：阴性；7-9为浓度300μm组，7：阳性；8：实验；9：阴性；10-12为浓度400μm组，10：阳性；11：实验；12：阴性；13-15为浓度500μm组，13：阳性；14：实验；15：阴性；16-18为浓度600μm组，16：阳性；17：实验；18：阴性；

图5为dna成核序列与银离子和硼氢化钠比例优化结果；

图6为dna银纳米簇通用荧光可视传感器的特异性探究；1：阳性；2：猪；3：牛；4：绵羊；5：山羊：6：鸡；7：鸭；8：鹅：9：马；10：驴；11：鹿；12：牦牛；13：水牛；14：貂；15：骆驼；16：鱼；17：大鼠；18：阴性；

图7为dna银纳米簇通用荧光可视传感器的灵敏性探究；1：混合梯度0倍，即为原始质量的100％；2：混合梯度5倍，即为原始质量的20％；3：混合梯度25倍，即为原始质量的4％；4：混合梯度125倍，即为原始质量的0.8％；5：混合梯度625倍，即为原始质量的0.16％；6：阴性。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

猪(susscrofa)，牛(bostaurus)，羊(ovisaries)，普通家鸡(gallusgallus)，野鸡(phasianuscolchicus)，火鸡(meleagrisgallopavo)，乌鸡(gallusdomesticusbrisson)，鸭(anasplatyrhynchos)，鹅(goosecalicivirus)，狗(canislupusfamiliaris)，兔(oryctolaguscuniculus)，牦牛(bosmutus)，黄鱼(pseudosciaenapolyactis)为超市购买。马(equuscaballus)，驴(equusasinus)为北京农贸市场购买。老鼠(musmusculus)由中国农业大学食品安全与分子生物学实验室提供。水牛(bubalusbubalis)，貂(marteszibellina)，骆驼(camelusferus)，鹿(cervus)由天津出入境检验局的李宗梦博士提供。

实施例1猪源通用内标准基因actb的筛选

通过搜索genbank中关于猪的基因信息，将目标基因组从ncbi下载，并保存为“.fasta”格式。针对猪的全基因组信息进行分析，利用blast和dnamanversion4.0软件进行同源性分析，筛选出actb基因，该基因位于第8染色体染色体上，是细胞骨架肌动蛋白之一。将20种肉类(分别是普通家鸡(gallusgallus)，野鸡(phasianuscolchicus)，火鸡(meleagrisgallopavo)，乌鸡(gallusdomesticusbrisson)，猪(susscrofa)，牛(bostaurus)，羊(ovisaries)，鸭(anasplatyrhynchos)，鹅(goosecalicivirus)，狗(canislupusfamiliaris)，兔(oryctolaguscuniculus)，牦牛(bosmutus)，黄鱼(pseudosciaenapolyactis)，马(equuscaballus)，驴(equusasinus)，老鼠(musmusculus)，水牛(bubalusbubalis)，貂(marteszibellina)，骆驼(camelusferus)，鹿(cervus))的actb基因导入dnamanversion4.0，进行多序列特异性分析，序列比对结果保存为“.seq”格式。选择特异性高的片段再进行blast分析，查找数据库中序列同源性及特异性。最后通过对序列进行整合，确定最终的特异性目标基因β-actin(actb)基因可以作为内标准基因。该actb片段的核苷酸序列如seqidno.1所示。

实施例2猪源成分非对称pcr检测方法的建立

利用primerpremier5.0软件针对实施例1确定的actb基因设计非对称pcr引物，包括两条引物，f为非限制引物，r+polyc为限制引物r的5’端连接dna-银纳米簇激发序列polyg的反向互补序列polyc，见表1。

表1非对称pcr引物序列

利用非对称pcr反应快速检测猪样品，反应体系25μl，包括1xpcrbuffer，0.4mmdntp，0.8μm引物f，0.08μm引物r+polyc，1.5urtaqdnapolymerase。反应程序为：95℃预变性5min；45个循环：95℃30min，53℃30s，72℃30s；72℃延伸10min。扩增结束后，利用2％琼脂糖凝胶电泳进行产物判定，出现181bp特异性条带证明扩增成功，含有目的基因。结果如图2所示，猪特异性内标准基因在16种动物中的非对称pcr扩增，1：猪；2：牛；3：绵羊；4：山羊：5：鸡；6：鸭；7：鹅：8：马；9：驴；10：鹿；11：牦牛；12：水牛；13：貂；14：骆驼；15：鱼；16：大鼠；17：阴性；m:makerdl2000。只有猪样品出现明亮条带，其余物种无目的条带，证明所设计的非对称pcr引物具有高特异性。

实施例3猪源成分非对称pcr-dna银纳米簇检测方法的建立

非对称pcr能够产生大量单链靶标基础是非限制性引物与限制性引物有一个适当的浓度比例，本发明以下游引物r为限制性引物，选取的浓度比例为(f:r+polyc)5:1、10:1、20:1、40:1和80:1。经2％琼脂糖凝胶电泳验证，当f与r的比例为10:1时，有较亮的单链条带，故选择f：r＝10:1为猪非对称pcr的最佳浓度比例。而当(f:r+polyc)比例为20:1、40:1和80:1时，有很多非特异性扩增大产物片段，这是因为非限制性引物(f)特异性较差，当限制性引物(r+polyc)浓度很低时，在当前45循环条件下可产生大量非特异性扩增现象。此现象可通过进一步的提升退火tm温度、重新设计引物等方法来解决。具体结果见图3。

为了提高本发明的灵敏度和降低实验成本，需要对dna成核序列与银离子和硼氢化钠的比例(dna:ag+:nabh4)和dna成核序列的浓度进行系统优化。

从图4可得，当dna成核序列浓度为400μm时，实验组与阴性组可较好的区分，即可分辨非对称pcr组与阴性组。当dna成核序列为100μm时，阳性组、实验组与阴性组颜色差别很小，此时可能是由于dna成核序列浓度较低，无法和激发序列有效的杂交结合；而当dna成核序列浓度升高时，尤其是在500μm和600μm两个浓度下，实验组与阴性组不可区分，此时可能是由于dna成核序列浓度过高，而与激发序列的比例较悬殊，导致dna银纳米簇背景值较高，无法区分实验组与阴性组。

本发明选取的dna成核序列与银离子和硼氢化钠的比例(dna:ag+:nabh4)有5种，分别为1:6:6、1:12:6、1:12:12、1:17:17和1:25:25。阳性对照实验组的激发序列摩尔浓度与dna成核序列一致。比例1:6:6、1:12:12阳性对照、实验组、阴性对照均无法区分；比例1:12:6、1:17:17实验组与阴性对照无法区分；1:25:25可较好的区分实验组与阴性，但阳性对照与实验组差别不大，故发明选取1:25:25为dna:ag+:nabh4的最优比例。具体如图5。

本发明用16种动物物种对发明构建的dna银纳米簇通用荧光可视试剂盒的特异性进行验证。结果显示，只有阳性样本和阳性实验组(物种猪)有明亮的红黄色，其余15种样本颜色与阴性颜色相似，显示了本发明具有极佳的特异性。具体结果见图6。

本发明通过将猪肉肉末与非猪肉肉末(牛、绵羊、老鼠等混合肉末)进行5倍梯度等质量的混合，以探究其灵敏性。结果显示，当混合梯度为25倍(混合肉末质量为猪肉肉末质量的25倍)即为初始质量的4％时，颜色为浅红色；而当混合梯度为125倍即为初始质量的0.8％时，颜色与阴性颜色相近。故本发明构提供的dna银纳米簇通用荧光可视试剂盒检测限为4％(w/w)。具体结果见图7。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中国农业大学

<120>一种快速鉴定食品中猪源成分的试剂盒及其应用

<130>mp1907450z

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>163

<212>dna

<213>猪(susscrofa)

<400>1

agacaatcccggaggcagctcggagcgcagcgcccagctgtgcccagctgtgcccagccg60

tgcgccataagattcgcgcccagggcccagcggtgcgccgccgacgccaactcaccccag120

ctccggttgcaccacccgaatgtaagtgtaacatcgcctcagg163

<210>2

<211>17

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

agacaatcccggaggca17

<210>3

<211>39

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ccccaccccaccccaccccctgaggcgatgttacactta39

<210>4

<211>15

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

cccccttaatccccc15

<210>5

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

cctgaggcgatgttacactta21