一种水稻弱势早衰相关基因、蛋白质、分子标记及应用的制作方法

本发明涉及植物基因工程领域，特别是涉及一种水稻弱势早衰相关基因、蛋白质、分子标记及应用。

背景技术：

世界上有一半以上的人以大米作为主食，水稻无疑是最重要的粮食作物之一。水稻的异常生长现象，如弱势和早衰，对水稻的农业生产有很大影响。水稻植株生长矮小、组织和器官较小等不良发育会导致水稻的产量降低。其次，过早的叶片衰老会导致光合速率降低，以及生殖器官中光合同化物的积累率降低，最终也会导致水稻的产量降低。这两个影响产量的因素受遗传调控，并且通常由环境压力引发。因此，了解水稻生长弱势和叶片衰老的分子机制将有利于水稻的育种和生产。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种能影响水稻植株生长和叶片衰老的蛋白质及其基因，利用该基因可以研究水稻生长弱势和叶片衰老的分子机制，找到延缓水稻叶片衰老的方法。

为解决上述技术问题，本发明主要是利用图位克隆技术来获得所述蛋白质和基因。

一、突变体wls5的分离和遗传分析：

在本发明中，通过ems(甲基磺酸乙酯)诱变籼稻品种93-11获得了一个弱势早衰突变体(如图1所示)，暂时将其命名为wls5(weaknessandleafsenescence5)。通过将wls5与粳稻品种nipponbare杂交产生作图群体，所有f1植株均具有与野生型相同的正常表型。f1自交获得了1088株f2分离群体，其中821株表现出野生型的正常表型，267株表现出与wls5相同的早衰表型，符合典型的分离比3：1(χ2＝0.12<χ20.05＝3.84)。该结果表明wls5受单个隐性核基因控制。

二、wls5的图位克隆和鉴定：

把f2分离群体中具有wls5表型的21株用于初步定位，并且发现wls5位于标记m1和m2之间的5号染色体的短臂上(图2a)。为了进一步缩小区间，我们在m1和m2之间开发了许多indel标记，最终wls5被定位到分别具有2个和1个交换单株的m6和m7标记之间的29kb区域内(图2b)。在29kb的候选区域内，基于水稻基因组注释网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)预测了4个基因(图2c)。其中，loc_os05g04890、loc_os05g04900和loc_os05g04914编码表达蛋白，loc_os05g04930编码转移酶家族蛋白。通过测序，把这4个基因在野生型和wls5的dna之间进行序列比对，仅loc_os05g04900在wls5的编码区有3个碱基缺失，这导致该表达蛋白中的赖氨酸(lys)缺失(图2d)。于是，我们通过crispr/cas9基因组编辑技术，在nipponbare遗传背景下获得了一个纯合突变体株系#20，其在loc_os05g04900中具有18bp缺失(图2e)。与其野生型(npb)相比，经过基因编辑的突变体植株表现出明显的叶片早衰现象(图2f)，表明loc_os05g04900就是wls5的候选基因。

三、wls5基因的功能分析：

水稻植株生长矮小、组织和器官较小等不良发育会导致水稻的产量降低。其次，过早的叶片衰老会导致光合速率降低，以及生殖器官中光合同化物的积累率降低，最终也会导致水稻的产量降低。因此，该基因的克隆和应用不仅有利于了解水稻生长弱势和叶片衰老的分子机制，还可应用于水稻的育种和生产。

基于上述研究结果，本发明开发了其相应的应用。

一方面，本发明提供了一种蛋白质在控制水稻弱势早衰中的应用，所述蛋白质由位于水稻第5染色体短臂的基因loc_os05g04900编码。

进一步地，所述蛋白质如(a)或(b)所示的序列：(a)seqidno：2所示的氨基酸序列；(b)在(a)所限定的氨基酸序列中添加和/或取代和/或缺失一个或几个氨基酸且具有相同功能的由(a)衍生的蛋白质。

另一方面，本发明提供了一种编码上述蛋白质的基因在控制水稻弱势早衰中应用。

进一步地，编码所述蛋白质的基因如(a)或(b)所示的序列：(a)seqidno：1所示的基因组核苷酸序列；(b)在(a)所示的核苷酸序列的中添加和/或取代和/或缺失一个或几个核苷酸而生成的可编码具有控制水稻弱势早衰功能的蛋白质的突变基因、等位基因或衍生物。

进一步地，所述应用为：利用所述基因转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株，来改良水稻弱势早衰。如图3所示的pcambia1300-wls5，该载体可以表达有上述基因序列编码的多肽或其同源类似物。

进一步地，所述应用为：对编码所述蛋白质的基因进行处理使水稻突变，引起水稻弱势早衰突变，用于水稻早衰标记育种。

进一步地，通过crispr/cas9基因组编辑技术对所述因进行基因敲除处理使水稻突变。

进一步地，对编码所述蛋白质的基因进行处理使水稻突变后的突变基因序列为：在seqidno：1所示的基因组核苷酸序列中缺失第190-192位的三个碱基aag。

再一方面，本发明还提供了一种与水稻弱势早衰基因紧密连锁的分子标记，所述分子标记为indel标记m6和/或indel标记m7；

所述各分子标记对应的引物序列分别为：

m6f:5’-tcgggaccatagcaagtc-3’

m6r:5’-gctgtcttgcgatgactc-3’；

m7f:5’-tgaaatgtcagtttagccgg-3’

m7r:5’-ggccgtttgaagagtacaata-3’。

再一方面，上述与水稻弱势早衰基因紧密连锁的分子标记在分子标记辅助选择育种中的应用为：辅助选择与水稻弱势早衰相关性状。

综上所述，本发明利用水稻弱势早衰突变体wls5，通过图位克隆技术首次在水稻中克隆到了wls5基因。通过对wls5基因的功能解读，进一步阐明了植物特别是禾本科植物叶片衰老和植物生长遗传机制及其作用机理。叶片衰老和植物生长过程可能受相同的遗传因子的调节，因此，wls5将是研究该领域的理想材料。

附图说明

上述仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，以下结合附图与具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。

图1是野生型(93-11)wt和突变体wls5的表型对比图；其中：(a)分蘖期，野生型(93-11)和wls5的植物表型。bar＝10cm。(b)野生型和wls5的叶片表型。bar＝2cm。(c)不同阶段，野生型(93-11)和wls5的叶片表型。bar＝2cm。

图2是wls5的候选基因分析过程图；其中：(a)wls5在水稻5号染色体上的位置。(b)wls5的初步连锁图谱。markers-用于图位克隆的标记。rec.-交换单株的数量。(c)wls5的候选基因。(d)loc_os05g04900在野生型和wls5中的结构和序列变异。前、后的箭头分别表示突变位点和敲除的靶位点，bar＝50bp。(e)在nipponbare(npb)品种中敲除loc_os05g04900，导致loc_os05g04900中有18bp缺失。(f)npb和#20的表型。bar＝25cm(左)和bar＝12.5cm(右)。

图3是pcambia1300-wls5载体图谱；

图4是wls5基因序列图；其中，阴影标注为基因的外显子序列。

具体实施方式

实施例1：

1、水稻材料：

水稻(oryzasatival.)弱势早衰突变体wls5(weaknessandleafsenescence5)的原始野生型为籼稻品种93-11。

水稻(oryzasatival.)弱势早衰突变体wls5的获得过程具体如下：

籼稻品种93-11的种子经过ems诱变后，种植于大田，收取种子继续种植，从m2代中分离出来的一个水稻弱势早衰突变体，暂时将其命名为wls5(weaknessandleafsenescence5)。将该突变体进行多代自交，获得能稳定遗传的突变体植株(如图1所示)。

将突变体材料wls5和野生型材料93-11进行杂交，获得的f1代植株均表现为野生型性状，说明控制该性状的基因受隐性核基因控制。f1代植株自交获得f2群体，表现出野生型表型的单株与突变体表型的单株的遗传分离比符合3:1，说明该表型是由一对隐性核基因控制的。

2、分析和定位群体：

纯合的wls5突变体和粳稻品种nipponbare进行杂交，f1代自交，得到1088株f2群体；并从1088株f2群体中选出267株具有wls5突变体表型的个体(即表现为弱势早衰)作为定位群体。在苗期取全部突变体表型的幼苗的叶片，用来提取总dna。

3、ssr和indel标记定位wls5基因

采用ctab法提取用于基因定位的水稻叶片基因组dna。取大约0.2g水稻叶片置于2mlep管内，直接加入ctab和钢珠，利用植物组织研磨器将组织破碎，氯仿抽提，乙醇沉淀，ddh2o2溶解，最后获得基因组dna。每一个pcr反应用3μldna样品，体系为10ul。

wls5基因的初步定位：从wls5与nipponbare杂交组合的f2群体267株隐性单株中随机选取21株隐性单株，组成混池，利用已公布的234对近似均匀分布于各条染色体上的b套引物，获得连锁位置，利用混池定位确定的连锁且具有多态性的引物，根据已知的反应条件进行pcr扩增，具体如下：

与目标基因连锁的str引物为：

m1f：ttgtaaccaccagcagcaggg

m1r：agcaatggtacaaatagccaagc

pcr反应体系为：水稻基因组dna3ul,2×pcrmix5ul，10umf/r引物各1ul，总体系10ul。

pcr扩增条件具体为：94℃预变性4分钟；94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃补齐10分钟；

经4％琼脂糖凝胶电泳分离，检测pcr产物的多态性，将wls5初步定位在标记m1和m2之间的5号染色体的短臂上(图2a)。

wls5基因的精细定位：利用wls5与nipponbare杂交组合的f2群体中267株隐性个体，在初定位的基础上继续设计indel标记，最终将wls5精确定位于m6和m7标记之间的29kb区域内(图2b)。

indel标记引物序列为：

m6f:5’-tcgggaccatagcaagtc-3’

m6r:5’-gctgtcttgcgatgactc-3’；

m7f:5’-tgaaatgtcagtttagccgg-3’

m7r:5’-ggccgtttgaagagtacaata-3’.

pcr反应体系为：水稻基因组dna3ul，2×pcrmix5ul，10umf/r引物各1ul，总体系10ul。

pcr扩增条件具体为：94℃预变性4分钟；94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃补齐10分钟。

产物检测：在4.0％的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并拍照记录结果。

4、基因预测和比较分析：

在29kb的候选区域内，基于水稻基因组注释网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)预测了4个基因(图2c)。其中，loc_os05g04890、loc_os05g04900和loc_os05g04914编码表达蛋白，loc_os05g04930编码转移酶家族蛋白。通过测序，把这4个基因在野生型和wls5的dna之间进行序列比对，仅loc_os05g04900在wls5的编码区有3个碱基缺失，这导致该表达蛋白中的赖氨酸(lys)缺失(图2d)。

目标基因测序引物的序列：

900-f:ccttaaaaaggctagcgaca

900-r:tcccactggtcaaattgaga

pcr扩增体系:水稻基因组dna5ul，2×kodbuffer25ul，2mmdntp10ul，10umf/r引物各3.0ul,kodfxdna聚合酶1ul，ddh2o3ul，总体系50ul。

pcr扩增条件:94℃预变性4分钟；98℃变性1分钟，56℃退火30秒，68℃延伸1分钟，32个循环；68℃补齐10分钟。

于是，我们通过crispr/cas9基因组编辑技术，在nipponbare遗传背景下获得了一个纯合突变体株系#20，其在loc_os05g04900中具有18bp缺失(图2e)。与其野生型(npb)相比，经过基因编辑的突变体植株表现出明显的叶片早衰现象(图2f)，表明loc_os05g04900就是wls5的候选基因,其在9311中对应的序列如图4所示。

实施例2：

植物转化：

在wls5的外显子上设计要敲除的靶序列，将靶序列退火后连接到aari酶切的sk-grna上，然后将连接有靶序列的sk-grna用kpni和bglii进行酶切获得含有靶序列的片段，pc1300-cas9载体用kpni和bamhi进行酶切，将含有靶序列的片段连接到pc1300-cas9载体上。通过电击的方法将质粒转入农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)株系eha105中，然后通过农杆菌介导转化水稻愈伤。我们利用突变体幼胚诱导的愈伤组织，经过诱导培养基培养3周后，挑选生长旺盛的愈伤用作转化的受体。用含有双元质粒载体的eha105菌株侵染水稻愈伤，在黑暗、25℃条件下共培养3天后，在含有40mg/lhygromycin的筛选培养基上培养。筛选抗性愈伤在含有50mg/l预分化培养基上培养10天左右。将预分化的愈伤转至分化培养基上，在光照条件下培养。一个月左右得到抗性转基因植株。

综上所述，在本发明中，我们发现了一个新的叶片早衰突变体wls5(weaknessandleafsenescence5)，同时它长势较弱且叶片衰老。利用图位克隆技术，我们将wls5精细定位到5号染色体的短臂上。通过测序，我们推断loc_os05g04900是wls5/wls5的候选基因，并利用转基因敲除试验鉴定了该基因的功能。

以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。有必要指出，本发明不局限于以上实施例，对于本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110>中国水稻研究所

<120>一种水稻弱势早衰相关基因、蛋白质、分子标记及应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>445

<212>dna

<213>稻属水稻(oryzasativa)

<400>1

atggattcatctgctgcggatggtgagacgaaggaggagtcgtcgaaagtgaagatgttg60

ctgccggaagatttcctcaacaccgtcctcctctgcactgctttcttgtacaaggcgatg120

aataccatcggcacgctggccaccatctgggcgaccgtcgtcctgctcggtggattctcc180

accctcatcaagaaggaggacttttggtacgtcaccgtcatcgccttcgtccaatccatc240

gggtaagcaccctaagatcctaagttaataggagcgaatttcagattgggttatttaacg300

gctaagtccctagttggatatagaggccgggtaaaaaaaacccttctcttaaaaaaagta360

taattaattaagtacatcctcctccggagtattagcttgaataaaccaactttaatttcg420

gtttagaatactggttaagcagtaa445

<210>2

<211>86

<212>prt

<213>稻属水稻(oryzasativa)

<400>2

metaspserseralaalaaspglygluthrlysglugluserserlys

151015

vallysmetleuleuprogluasppheleuasnthrvalleuleucys

202530

thralapheleutyrlysalametasnthrileglythrleualathr

354045

iletrpalathrvalvalleuleuglyglypheserthrleuilelys

505560

lysgluaspphetrptyrvalthrvalilealaphevalglnserile

65707580

glyileleuvallysgln

85

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>稻属水稻(oryzasativa)

<400>3

tcgggaccatagcaagtc18

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>稻属水稻(oryzasativa)

<400>4

gctgtcttgcgatgactc18

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>稻属水稻(oryzasativa)

<400>5

tgaaatgtcagtttagccgg20

<210>6

<211>21

<212>dna

<213>稻属水稻(oryzasativa)

<400>6

ggccgtttgaagagtacaata21