一种利用过表达氮代谢调控蛋白基因的工程菌制备生物絮凝剂的方法与流程

本发明属于生物絮凝剂制备技术领域，具体涉及一种利用过表达氮代谢调控蛋白基因的工程菌制备生物絮凝剂的方法。

背景技术：

氮代谢调控蛋白nrgb是pii调节蛋白家族的成员之一(microbiology，2003，149，3289-3297)，转化nh⁴⁺和谷氨酸之间的主要氮代谢通量(microbialcellfactories，2017，16(1)：22)，主要起到控制氮代谢流的作用。nrgb是铵盐代谢的正向调控蛋白，最佳氮源谷氨酰胺/谷氨酸不存在时，nrgb感知胞外铵盐的浓度，通过激活谷氨酰胺合成酶(glna)调节谷氨酸的合成(proteomics，2006，6(16)：4565-4585)，将胞内主要氮源由直接利用谷氨酸转向同化吸收铵盐。

nrgb在调节氮通量的同时，能够调节絮凝活性物质γ-pga的合成。谷氨酸是b.1icheniformis属菌株最佳的生长氮源，葡萄糖的存在会抑制nrgb的表达，导致菌体消耗产生的谷氨酸(proteomics，2007，7(3)：413-423)，而当没有葡萄糖存在时，nrgb表达正常，它是铵盐代谢的正向调控蛋白，可以激活谷氨酰胺合成酶将主要氮源由直接利用谷氨酸转向同化吸收铵盐，最终促进γ-pga的合成。

生物絮凝剂是一种新型絮凝剂，由真菌和细菌等微生物产生，与传统絮凝剂相比，易被生物降解，无毒，无二次污染。组成的絮凝物质主要是多糖，多肽，蛋白质，脂类和核酸(appliedmicrobiologyandbiotechnology，1998，50(6)：682-691)。其中，多糖和多肽(γ-pga)是目前研究报告中最常见的两种微生物絮凝物质(carbohydratepolymers，2011，84(1)：454-458)。γ-pga作为絮凝活性物质在食品、发酵、水处理、制糖工业和微藻收集等领域具有广阔的应用前景(molecularmicrobiology，2005，57(3)：717-726；biotechnologyadvances，2018，36，1424-1433)。多糖絮凝剂也广泛应用于去除工业废水中的色素、悬浮物和重金属离子(pb²⁺，cd²⁺，zn²⁺)(colloidsandsurfacesb-biointerfaces，2005，44(4)：179-186.；bioresourcetechnology，2007，98(2)：361-367.)以及对高岭土溶液(biotechnologyletters，1996，18(12)：1459-1464；bioresourcetechnology，2018，255，171-179)和微观小球藻(scienceofthetotalenvironment，2018，634：488-496)的絮凝。然而，低产率，低絮凝活性和高价格等因素限制了生物絮凝剂的规模和产业化，以往，大部分关于生物絮凝剂的报道多指向培养基、生长条件的优化和应用领域(processbiochemistry，2014，49(4：576-582)，关于地衣芽孢杆菌的遗传和代谢途径对絮凝剂合成的调控的报道比较少。对于芽孢杆菌在合成多糖和γ-pga两种絮凝活性物质的代谢途径的了解不够深入(biotechnologyadvances，2018，36，1424-1433)，不利于对该菌的代谢进行调控，因此，通过基因工程改造得到高产优良菌株提高，进一步提高生物絮凝剂活性，同时为絮凝活性物质成分代谢的研究奠定基础，具有重要的经济价值及社会意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种利用工程菌制备生物絮凝剂的方法。

本发明的原理如下：本发明中的氮代谢调控蛋白nrgb是pii调节蛋白家族的成员之一，转化nh⁴⁺和谷氨酸之间的主要氮代谢通量，主要起到控制氮代谢流的作用。nrgb是铵盐代谢的正向调控蛋白，最佳氮源谷氨酰胺/谷氨酸不存在时，nrgb感知胞外铵盐的浓度，通过激活谷氨酰胺合成酶(glna)调节谷氨酸的合成，将胞内主要氮源由直接利用谷氨酸转向同化吸收铵盐。nrgb在调节氮通量的同时，能够调节絮凝活性物质γ-pga的合成。谷氨酸是b.licheniformis属菌株最佳的生长氮源，葡萄糖的存在会抑制nrgb的表达，导致菌体消耗产生的谷氨酸，而当没有葡萄糖存在时，nrgb表达正常，它是铵盐代谢的正向调控蛋白，可以激活谷氨酰胺合成酶将主要氮源由直接利用谷氨酸转向同化吸收铵盐，最终促进γ-pga的合成。

本发明的技术方案如下：

一种利用过表达氮代谢调控蛋白基因的工程菌制备生物絮凝剂的方法，该工程菌为过表达氮代谢调控蛋白nrgb基因的地衣芽孢杆菌，其中含有负载了如seqidno：01所示的氮代谢调控蛋白nrgb基因的表达载体phy300plk-pamyl-ttamyl，该地衣芽孢杆菌已于2009年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为cgmccno.2876。

在本发明的一个优选实施方案中，包括如下步骤：

(1)通过如seqidno：02所示的正向引物和如seqidno：03所示的反向引物pcr扩增所述氮代谢调控蛋白nrgb基因，将其插入到表达载体phy300plk-pamyl-ttamyl的组成型启动子pamyl下游的多克隆位点，获得phy300-nrgb过表达质粒；

(2)将足够的上述phy300-nrgb过表达质粒通过电转化导入所述地衣芽孢杆菌中，获得所述工程菌；

(3)将上述工程菌的单菌落接种于液体种子培养基中，35-37℃并200rpm的条件下培养12-16h，获得种子培养液；

(4)将上述种子培养基以3-5％的体积比接种于发酵培养基中，30-40℃并150-300rpm条件下培养50-60h，获得发酵液；

(5)将上述发酵液进行离心，获得上清液；

(6)将上述上清液通过乙醇沉淀后，离心获得沉淀；

(7)将上述沉淀溶解于超纯水中，进行真空冷冻干燥，即得所述生物絮凝剂。

在本发明的一个优选实施方案中，所述种子培养基由以下配比的原料组成，单位为g/l：葡萄糖7-12，酵母膏0.3-0.6，尿素0.3-0.6，kh2po40.1-0.3，k2hpo40.1-0.3，nacl0.1-0.3，mgso4·7h2o0.2-0.5，蒸馏水，ph7.2-8.0。

在本发明的一个优选实施方案中，所述发酵培养基由以下配比原料组成，单位为g/l：葡萄糖13-16，酵母膏0.5-1，尿素1-3，kh2po44-6，k2hpo41-3，nacl1-3，mgso4·7h2o0.01-0.1，蒸馏水，ph7.2-8.0。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(6)中，乙醇沉淀具体为：在所述上清液中加入3-5倍体积的无水乙醇，于3-5℃静置10-13h。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(6)中，离心的速度为5000-7000rpm，离心的时间为12-16min，离心的温度为3-5℃。

本发明的有益效果是：本发明将氮代谢调控蛋白nrgb基因(nrgb)克隆构建重组表达载体，通过电转化的方法将重组质粒导入到地衣芽孢杆菌，构建了工程菌，该工程菌在发酵过程中，絮凝活性提高了98.04％，该工程菌可用于多糖絮凝剂的工业化生产，能够提高絮凝效率并降低成本。

附图说明

图1为本发明中的重组表达质粒phy300-nrgb的pcr和酶切验证结果图，其中泳道1：重组质粒phy300-nrgb；泳道2：kpni单酶切重组质粒phy300-nrgb；泳道3：kpni和xhoi双酶切重组质粒phy300-nrgb。marker：takaradl5000dnamarker。

图2为本发明中的地衣芽孢杆菌cgmcc2876及其过表达氮代谢调控蛋白nrgb基因工程菌hn301-7生物絮凝剂絮凝活性比较图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1：重组表达载体phy300-nrgb的构建

设计pcr引物，用于扩增nrgb基因片段。

上下游引物分别为：

正向引物：cggctcgagttataaagcgtcagg(seqidno：02，下划线为xhoi酶切位点)

反向引物：ggggtaccatgagcggtcaaatgtataag(seqidno：03，下划线为kpni酶切位点)

以bacilluslicheniformiscgmcc2876基因组dna为模板，进行如下pcr程序：(1)94℃，5min；(2)94℃，30s；(3)63℃，30s(4)72℃，1min，(2)-(4)步重复35个循环；(5)72℃，10min，4℃保存。

pcr反应体系如下表：

将pcr产物和表达载体phy300plk-pamyl-ttamyl(peizeliu，zhenchen，lijieyang，qingbiaoliandninghe.increasingthebiofocculantproductionandidentifyingtheefectofoverexpressingepsbonthesynthesisofpolysaccharideandγ-pgainbacilluslicheniformis.liuetal.microbcellfact(2017)16：163)分别用限制性内切酶kpni和xhoi双酶切，回收后，将pcr产物和表达载体以3∶1的比例用t4dna连接酶在4℃连接12h构建重组表达载体phy300-nrgb(负载了如seqidno：01所示的氮代谢调控蛋白nrgb基因)。

实施例2：地衣芽孢杆菌基因工程菌hn301-7的构建

将phy300-nrgb过表达质粒经提取及浓缩后，电击转入地衣芽孢杆菌(已于2009年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为cgmccno.2876，请见cn101503709a)，37℃复苏5h后，涂布四环素抗性平板，再在37℃培养12h，筛选转化子。转化子经质粒提取后，利用菌落pcr及双酶切进行验证(如图1所示)。从而获得过表达氮代谢调控蛋白nrgb基因nrgb的地衣芽孢杆菌工程菌hn301-7。

电转化具体步骤如下：

地衣芽孢杆菌感受态的制备：

(1)在50mllb培养基中接种一环b.licheniformis，37℃，200rpm过夜培养12h；

(2)取过夜培养液1ml接入50ml生长培养基中，于37℃，200rpm培养至对数中后期，直到细胞od600达到0.85-0.95；

(3)细胞冰浴30min，停止生长后，(取预先预冷的50ml干净离心管，加入40ml停止生长的培养液)再于4℃以6000rpm离心收获细胞；

(4)用冰冷(0℃冰水浴)的ep缓冲液40ml悬浮细胞四次(每次都在0℃冰水浴中晃动，使沉淀悬浮，可用枪轻轻吹吸)，并最终将细胞悬浮于1mlep缓冲液中，使细胞浓度达到1～1.3×10¹⁰cfuml^-1；

(5)将感受态细胞分装于1.5ml离心管(预冷过的)中，每管100μl，再直接进行下一步实验或-70℃保存感受态；

地衣芽孢杆菌的电转：

(1)将感受态细胞和1～5ug质粒混合物转移到冰上预冷的0.1cm间隙的电击池中；

(2)以1800v、5ms脉冲转化；

(3)迅速往电击池中加入1ml复苏培养基，将菌悬液回收到2ml离心管中，于37℃，200rpm培养5h；

(4)将菌液涂布于四环素抗性平板上，于37℃培养直到平板上出现菌落，获得地衣芽孢杆菌基因工程菌hn301-7。

实施例3：利用地衣芽孢杆菌及其基因工程菌发酵制备生物絮凝剂

将地衣芽孢杆菌cgmcc2876出发菌株和实施例2所得的地衣芽孢杆菌基因工程菌hn301-7接种于液体种子培养基(由以下配比的原料组成，单位为g/l：葡萄糖7-12，酵母膏0.3-0.6，尿素0.3-0.6，kh2po40.1-0.3，k2hpo40.1-0.3，nacl0.1-0.3，mgso4·7h2o0.2-0.5，蒸馏水，ph7.2-8.0)中，37℃，200rpm培养16h，制备种子培养液，以4％(v/v)的接种量接种于发酵培养基(由以下配比原料组成，单位为g/l：葡萄糖13-16，酵母膏0.5-1，尿素1-3，kh2po44-6，k2hpo41-3，nacl1-3，mgso4·7h2o0.01-0.1，蒸馏水，ph7.2-8.0)中，37℃，200rpm培养，进行发酵产多糖絮凝剂实验。56h后测定发酵液絮凝活性(如图2)。nrgb基因过表达重组基因工程菌发酵液的最终絮凝活性为5989.364uml^-1，比原菌株发酵液最终絮凝活性3024.28uml^-1提高98.04％。

生物絮凝剂的絮凝活性可采用以下方法测定：

称取高岭土粉末0.2g与50ml刻度试管中，依次加入2.5mlcacl2溶液(10gl^-1)和1ml待测液，蒸馏水加至与刻度线平齐。充分混合后，迅速置于比色皿中，静置5min后，用紫外可见分光光度计在波长550nm下测定吸光度。以蒸馏水做空白测定。计算公式如下：

絮凝活性(uml^-1)＝(b-a)/b×100×d

式中，a：待测样品的od550值，b：空白培养基的od550值，d：发酵液稀释倍数。

生物絮凝剂的提取纯化方法：

(1)取10ml发酵液8000rpm离心5min，除菌体，收集上清液，重复操作两次。

(2)上清液中加入3倍体积的无水乙醇，4℃条件下静置12h。

(3)8000rpm离心10min，弃上清液，加10ml去离子水溶解。上清液中加入3倍体积的无水乙醇，4℃条件下静置12h后，离心弃上清液。

(4)冷冻真空干燥。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

序列表

<110>厦门大学

<120>一种利用过表达氮代谢调控蛋白基因的工程菌制备生物絮凝剂的方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>351

<212>dna

<213>bacilluslicheniformis

<400>1

atgagcggtcaaatgtataaggtggaaattgtaactcgtcctacaaactttgaaaagctg60

aaaacggagctggccaaaatcggggtaacgtccattacgttttacaatgtacacggatgc120

ggcctgcaaaaagggcatacagagctttaccgcggggtcaaacgcgaaagcaatgtatat180

gaaaggttaaaagtcgaaatcgtcgtcagcaaagtgcctgtcgaaaaggtggccgagacg240

gcgcaaaacgtcctgaaaaccggggaacccggtgacggcaagatcttcatatacgaaatt300

aaaaacaccatcaacatccgcacaggcgaggaaggtcctgacgctttataa351

<210>2

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificalsequence)

<400>2

cggctcgagttataaagcgtcagg24

<210>3

<211>29

<212>dna

<213>人工序列(artificalsequence)

<400>3

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