银杏内生真菌代谢产物及在制备抗氧化剂中的应用的制作方法

本发明涉及一种对dpph自由基具有较强清除能力的抗氧化剂剂，具体涉及一种内生真菌代谢产物及在制备抗氧化药物的应用。

(二)

背景技术：

银杏(学名：ginkgobilobal.)是裸子植物银杏科，属于落叶乔木，种子具长柄，下垂，通常椭圆形，倒卵形，卵球形或近圆形。肉质外种皮，白色到粉红色，肉质外种皮，成熟时黄色或橙色。银杏种子甜而苦，与医药、食品同源，含有多种活性底物，如黄酮类、萜内酯、银杏酸、苯丙酮类、酚类等。因此，它具有促进唾液分泌、止渴祛痘、改善脑功能、增强记忆、治疗阿尔茨海默病、扩张微血管、促进血液循环、平滑血管、治疗脑供血等多种保健功能。内生植物在各种植物中普遍存在。许多内生植物可以产生与宿主植物相同或相似的代谢产物，因此，利用植物内生菌筛选生物活性成分或先导化合物已成为寻找天然药物的又一重要途径，也是当前植物内生菌研究的热点。癌症、衰老或其它疾病大都与过量自由基的产生有关联。研究抗氧化可以有效克服其所带来的危害，所以抗氧化被保健品、化妆品企业列为主要的研发方向之一，也是市场最重要的功能性诉求之一。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是提供一种银杏内生真菌代谢产物及在制备抗氧化剂中的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种银杏内生真菌代谢产物，所述代谢产物按如下方法制备：(1)将黄盖小脆柄菇(psathyrellacandolleana)gb.py-f1发酵液经超声破碎后抽滤，滤液用微滤膜过滤后用乙酸乙酯萃取，取有机相浓缩至恒重，获得代谢粗产物；所述黄盖小脆柄菇(psathyrellacandolleana)gb.py-f1保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctccno：m2019125，保藏日期为2019年3月6日，保藏地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072；(2)将步骤(1)代谢粗产物用乙酸乙酯溶解后进行硅胶柱层析，以体积比100-0:0-100的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，收集体积比50:50石油醚-乙酸乙酯的流出液，浓缩至干，记为组分gf.6；(3)将步骤(2)组分gf.6用乙酸乙酯溶解后再次进行硅胶柱层析，以体积比75:15石油醚-丙酮为流动相洗脱，收集第7个柱体积的流出液，浓缩至干，记为组分gf.6-7；(4)组分gf.6-7以体积比1:1的甲醇-三氯甲烷为洗脱剂进行凝胶sephadexlh-20柱分离，收集rf值为0.6的流出液，浓缩至干，记为组分gf.6-7-23；(5)步骤(4)组分gf.6-7-23经甲醇溶解重结晶，获得晶体；将晶体用甲醇溶解后，以体积比10:5:5的丙酮：甲苯：氯仿为展开剂进行薄层层析，收集rf为0.6的组分，获得银杏内生真菌代谢产物。

进一步，所述步骤(1)所述发酵液按如下方法制备：将黄盖小脆柄菇gb.py-f1接种于发酵培养基中，28℃，180r/min培养7d，获得发酵液；所述发酵培养基组成：硝酸钠3g/l，磷酸氢二钾1g/l，硫酸镁0.5g/l，氯化钾0.5g/l，硫酸亚铁0.01g/l，蔗糖30g/l，溶剂为蒸馏水，ph7.0～7.2。

进一步，所述步骤(1)所述代谢粗产物按如下方法制备：在405w条件下，每工作3s，间歇4s，进行300次循环对发酵液进超声破壁处理后抽滤，取滤液经0.45μm微孔滤膜过滤后浓缩至原体积的1/3，用乙酸乙酯萃取，有机相浓缩至恒重，获得代谢粗产物。

进一步，所述步骤(2)操作条件为：将步骤(1)代谢粗产物用乙酸乙酯溶解，加入硅胶，研磨均匀后，真空干燥，即为吸附样品的硅胶；将吸附样品的硅胶上样于硅胶色谱柱中，采用体积比100-0:0-100的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，收集体积比50:50石油醚-乙酸乙酯的流出液，浓缩至干，记为组分gf.6；所述硅胶与发酵粗产物质量比为1.5：1。

进一步，所述步骤(2)石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱体积比依次为100:0、90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100。

进一步，所述步骤(3)操作条件为：将步骤(2)组分gf.6用乙酸乙酯溶解，加入硅胶，研磨均匀后，真空干燥，即为吸附组分gf.6的硅胶；将吸附组分gf.6的硅胶上样于硅胶色谱柱中，以体积比75:15石油醚-丙酮为流动相洗脱，收集第7个柱体积的流出液，浓缩至干，记为组分gf.6-7；所述硅胶与组分gf.6质量比为1.5：1。

进一步，所述步骤(4)操作条件为：组分gf.6-7以体积比1:1的甲醇-三氯甲烷为洗脱剂进行凝胶sephadexlh-20柱分离，流速为1drop/s，收集rf值为0.6的流出液，浓缩至干，记为组分gf.6-7-23。

更进一步，本发明所述银杏内生真菌代谢产物按如下方法制备：(1)将黄盖小脆柄菇gb.py-f1接种于发酵培养基中，28℃，180r/min培养7d，获得发酵液；将发酵液超声破碎后抽滤，取滤液经微孔滤膜过滤后浓缩至原体积的1/3，用1倍体积乙酸乙酯萃取(优选萃取至乙酸乙酯相肉眼观察无明显颜色变化，合并乙酸乙酯萃取相)，有机相浓缩至恒重，获得代谢粗产物；(2)将步骤(1)代谢粗产物用微量乙酸乙酯溶解，加入硅胶(200～300目)，研磨均匀后，置于减压真空干燥器中干燥，即为吸附样品的硅胶，所述硅胶与发酵粗产物质量比为1.5：1；将吸附样品的硅胶上样于硅胶色谱柱(优选6cm*60cm)中，装柱量3/4，采用体积比100-0:0-100的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，收集体积比50:50石油醚-乙酸乙酯的流出液，浓缩至干，记为组分gf.6；(3)将步骤(2)组分gf.6用乙酸乙酯溶解，加入硅胶，研磨均匀后，真空干燥，即为吸附组分gf.6的硅胶；将吸附组分gf.6的硅胶上样于硅胶色谱柱中，以石油醚-丙酮(v:v＝75:15)为流动相洗脱，收集第7个柱体积的流出液，浓缩制备，记为组分gf.6-7；所述硅胶与组分gf.6质量比为1.5：1；(4)将步骤(3)组分gf.6-7用凝胶sephadexlh-20以甲醇-三氯甲烷(v:v＝1:1)为洗脱剂进行柱分离，流速为1drop/s，收集rf值为0.6(展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝6:1)的流出液，浓缩至干，记为组分gf.6-7-23；(5)步骤(4)组分gf.6-7-23经甲醇溶解重结晶，得到晶体；将晶体用甲醇溶解后，以丙酮：甲苯：氯仿＝10:5:5(v/v/v)为展开剂进行薄层层析，收集rf为0.6的组分，获得银杏内生真菌代谢产物，记为代谢产物gf.6-7-23。

本发明所述黄盖小脆柄菇gb.py-f1，菌落呈白色放射状，干燥，产大量肉眼可见黄色色素，菌落老化后成浅黄棕色。

本发明还提供一种所述银杏内生真菌代谢产物在制备抗氧化剂中的应用。

本发明还提供一种所述银杏内生真菌代谢产物在制备抗氧化药物或化妆品中应用。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：银杏内生真菌代谢产物gf.6-7-23的cl50＝14.538μg/mg，阳性对照vc的cl50＝15.261μg/ml，gf.6-7-23对dpph的清除能力与抗坏血酸效果几乎同等，而本发明通过微生物发酵的方法可制备得到，在一定程度上避免了植被的破坏，环保。

(四)附图说明

图1为gb.py-f1系统发育树。

图2为银杏内生真菌代谢产物对dpph的清除能力。

图3为银杏内生真菌代谢产物的¹h-nmr图谱。

图4为银杏内生真菌代谢产物的¹³c-nmr图谱。

图5为银杏内生真菌代谢产物的ms图谱。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明所述银杏(学名：ginkgobilobal.)，为银杏科、银杏属落叶乔木。银杏树的种子俗称白果，因此银杏又名白果树。

本发明所述超纯水是指电阻率达到18mω*cm(25℃)的水。水中除了水分子外，几乎没有什么杂质，更没有细菌、病毒、含氯二噁英等有机物，也没有人体所需的矿物质微量元素。

实施例1：黄盖小脆柄菇gb.py-f1的分离

1.植物样本采集：新鲜健康的银杏果采于江苏省无锡市惠山大道，银杏果用自来水清洗10分钟，然后用体积浓度75％乙醇水溶液漂洗一次。用质量浓度2％次氯酸钠水溶液浸泡10分钟后，用无菌水反复洗涤种子，再用体积浓度75％乙醇水溶液浸泡15分钟，然后用无菌水漂洗三次，收集漂洗液，用干燥的无菌吸收纸干燥，获得表面消毒后的银杏果。在超净工作台中，分别放置无菌pda培养基平板作为空白对照1，用于检查超净工作台的洁净程度；将最终的漂洗液分别接种于无菌pda培养基平板作为空白对照2，用于漂洗液的检查；将表面消毒后的银杏果，置于pda培养基的无菌平板中滚一圈后取出，作为空白对照3，用于植物组织印迹法筛选无菌的组织块。

2.内生真菌的筛选以及分离纯化：于无菌超净工作台，将步骤1中消毒后的银杏果从中间切成薄片，作为无菌组织，然后接种在pda培养基中，在30℃倒置培养，待出现内菌丝沿着组织切口向外生长时，与空白对照1、2以及3进行比较，采用尖端菌丝挑选的方法，将不同形态的菌落划线接种于pda培养基中，待长出单菌落后，将单菌落再次划线接种于无菌pda培养基中，反复多次接种，直到菌落形态一致且只有一种真菌生长时说明纯化完成，得到3株真菌菌株，1号菌株为菌落呈白色放射状，干燥，产大量肉眼可见黄色色素，菌落老化后成浅黄棕色，无肉眼可见孢子，菌落背面为深黄色；2号菌株为白色疏松绒毛状，有大量黄绿色孢子，菌落背面成点状，代谢物无明显颜色；3号菌株为灰粉色絮状，水波纹放射状，菌落背面为黑色；1号菌株记为菌株gb.py-f1。pda培养基组成：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000ml，自然ph。

3.总dna的提取：将菌株gb.py-f1接种于pda培养基中，于30℃恒温培养箱中倒置培养5d，采用真菌基因组dna快速抽提试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司，产品编号：b518229)以及相关操作说明提取基因组dna：①取50-100mg新鲜真菌或20mg干燥子实体或菌丝，液氮中充分研磨成粉末后放入到1.5ml离心管中，依次加入400μlbufferdigestion和4μlβ-巯基乙醇，震荡混匀。65℃水浴1h至细胞完全裂解。②加入200μlbufferpf，充分颠倒混匀，-20℃冰箱放置5min。③室温10000rpm离心5min，将上清液(500～550μl)转移到新的1.5ml离心管中。④加入等体积的异丙醇，颠倒5～8次使之充分混匀，室温放置2～3min。室温10000rpm离心5min，弃上清。⑤加入1ml75％乙醇，颠倒漂洗1～3min，10,000rpm离心2min，弃上清。⑥重复步骤⑤一次。⑦开盖室温倒置5～10min至残留的乙醇完全挥发。⑧得到的dna用50-100μltebuffer溶解。提取的dna可立即进行下一步实验或-20℃保存。

4.菌株gb.py-f1的its序列扩增：采用真菌扩增通用引物its1(5’-tccgtaggtgaacctgcgc-3’)和its4(5’-tcctccgcttattgatatgc-3’)扩增内部转录区间序列，反应体系如下：

dna模板1μl、上游引物1μl、下游引物1μl、pcrmix12.5μl、ddh2o9.5μl。

pcr扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min，4℃低温保存。

5.pcr反应产物确认：取5μlpcr产物与1μldangreen染料混合后点样于1.2％琼脂糖凝胶，110v条件下电泳15分钟，于凝胶成像系统中观察条带，如出现500bp左右条带，则初步判断扩增成功。

6.pcr反应产物测序：将pcr产物送样生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，菌株gb.py-f1的its序列见seqidno.1所示。

7.数据分析：用blast比对将菌株gb.py-f1的序列与genbank中的序列进行同源性比对，blast检索表明，菌株gb.py-f1的its序列与psathyrellacandolleana(黄盖小脆柄菇)(genbank登录号ab470877.1)的序列相似度为99％，绘制系统发育树见图1所示，由图1可知支持率为97％，根据基因亲缘性对比，确定菌株gb.py-f1为psathyrella属，命名为黄盖小脆柄菇(psathyrellacandolleana)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctccno：m2019125，保藏日期为2019年3月6日。

实施例2：银杏果内生菌代谢产物的分离

1、菌株复苏活化：将保存在4℃冰箱中的黄盖小脆柄菇gb.py-f1接种于pda培养基中，置于28℃恒温培养箱中培养7d；

2、银杏果内生菌代谢产物的制备：在超净工作台中，用无菌打孔器将步骤1的gb.py-f1菌株沿着菌落边缘打直径为5mm的菌饼，接种于含200ml发酵培养基的500ml锥形瓶中，28℃，180r/min培养7d，以未接种菌饼的发酵培养基为空白对照。取发酵完成的发酵液，采用jy92-iidn型超声波细胞粉碎机在405w条件下，每工作3s，间歇4s，进行300次循环对发酵液进超声破壁处理，然后抽滤得滤液，经孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤后利用旋转蒸发仪将其浓缩至原体积的1/3，用1倍体积乙酸乙酯对浓缩液进行多次萃取，直至乙酸乙酯相肉眼观察无明显颜色变化，合并乙酸乙酯萃取相，再次利用旋转蒸发仪浓缩干燥至恒重，获得银杏果内生菌代谢粗产物(简称：gb-1ea)32.264g，于-20℃保存。

所述发酵培养基组成：硝酸钠3g/l，磷酸氢二钾1g/l，硫酸镁(mgso4·7h2o)0.5g/l，氯化钾0.5g/l，硫酸亚铁0.01g/l，蔗糖30g/l，溶剂为蒸馏水，ph7.0～7.2；利用高压蒸汽灭菌锅对其进行灭菌，条件为121℃，20分钟。

3、分离纯化代谢粗产物：(1)称取10克gb-1ea，用10-15ml乙酸乙酯溶解，加入15克硅胶(200～300目)，研磨均匀后，置于减压真空干燥器中干燥，即为吸附样品的硅胶。将吸附样品的硅胶上样于硅胶色谱柱(6cm*60cm)中，装柱量3/4，采用石油醚-乙酸乙酯(100:0、90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100，v/v)梯度洗脱，分别得到gf.1～11个组分。收集体积比50:50石油醚-乙酸乙酯的流出液，浓缩至干，记为组分gf.6；(3)将步骤(2)组分gf.6用乙酸乙酯溶解，加入硅胶，研磨均匀后，真空干燥，即为吸附组分gf.6的硅胶；将吸附组分gf.6的硅胶上样于硅胶色谱柱中，以体积比75:15石油醚-丙酮为流动相洗脱，收集第7个柱体积的流出液，浓缩至干，记为组分gf.6-7；(4)组分gf.6-7用凝胶sephadexlh-20以甲醇-三氯甲烷(v:v＝1:1)为洗脱剂进行柱分离，流速为1drop/s，每100ml收集一份，相邻组分颜色相同进行合并浓缩，颜色不同者浓缩后点样于点样于薄层硅胶板进行层析(展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝6:1，v/v)，结果于相邻组分对比，具有相同rf值的组分再次合并，收集得到23-25份均为黄色，层析后具有相似的rf值，将rf值为0.6的3份合并，浓缩至干，记为组分gf.6-7-23；(5)步骤(4)组分gf.6-7-23经甲醇溶解重结晶得到黄色固体。将黄色固体用甲醇溶解后，点样于薄层硅胶板(型号：gf245)上，分别以丙酮：甲苯：氯仿＝10:5:5(v/v/v)；甲苯：甲酸甲脂：甲酸＝10:8:1(v/v/v)；乙酸丁酯：正己烷：甲醇：甲酸＝10:2:2:1(v/v/v/v)为展开剂进行薄层层析，用碘显色观察均为一个点，rf为0.6，获得28.04mg银杏内生真菌代谢产物，记为代谢产物gf.6-7-23。将样品溶于氘代氯仿中，进行核磁波普以及质谱分析，波普数据见于图3-5，主要组成为含有2-苯基色原酮结构的黄酮类化合物。

实施例3：银杏内生菌代谢产物dpph清除能力的测定

1.称取10mg实施例2方法制备的银杏内生真菌代谢产物gf.6-7-23，溶于1mldmso中，配置10mg/ml的样品储备液，取200μl置于96孔板中d2以及e2孔，用无水乙醇半倍稀释为不同浓度(5，2.5，1.25，0.625，0.3125，0.1562，0.0781，0.0391，0.0195mg/ml)分别置于d3-d11，e3-e11孔，d1、d12和e1、e12孔空白；

2.称取10mg抗坏血酸，1mldmso中，配置10mg/ml的阳性供试储备液，取200μl置于96孔板中f2以g2孔，用无水乙醇半倍稀释为不同浓度(5，2.5，1.25，0.625，0.3125，0.1562，0.0781，0.0391，0.0195mg/ml)分别置于f3-f11，g3-g11孔，f1、f12和g1、g12孔空白；

3.取200μldmso置于96孔板中b2以c2孔，用无水乙醇半倍稀释为不同浓度(5，2.5，1.25，0.625，0.3125，0.1562，0.0781，0.0391，0.0195mg/ml)分别置于b3-b11，c3-c11孔，b1、b12和c1、c12孔空白；

4.准确称取dpph3.5mg，用无水乙醇溶解转入10ml容量瓶中定容，配置成0.35mg/ml的dpph溶液；

5.0.35mg/ml的dpph溶液20μl加入b2-b11，d2-d11以及f2-f11孔中，c2-c11，e2-e11以及g2-g11中加入20μl无水乙醇为空白对照，轻微震荡后置于黑暗环境反应30min；

6.30min后将96孔板置于517nm工作波长下的酶标仪进行检测，重复三次测量，根据公式计算清除率。

式1，a0是对照反应在517nm处的吸光度(包括除样品之外的所有试剂)，而as是样品在517nm处的吸光度。测量重复三次，选择vc作为阳性对照。

结果：gf.6-7-23的cl50＝14.538μg/mg，阳性对照vc的cl50＝15.261μg/ml，gf.6-7-23对dpph的清除能力与抗坏血酸效果几乎同等。

序列表

<110>浙江工业大学

<120>银杏内生真菌代谢产物及在制备抗氧化剂中的应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>679

<212>dna

<213>黄盖小脆柄菇(psathyrellacandolleana)

<400>1

tgatatgcttaagttcagcgggtagtcctacctgatttgaggtcaaattggtcaagtaaa60

ttgtccttgcggacggttagaagcaagcatgagtccaatccacggcgtagataattatca120

caccaatagacggaagctcaatatgagctcgctaatgcatttcaggagagcagaccagca180

ctgaggcagcctgcaaaacccccacatccaagcctacacctgtctcgttacaaaactggt240

gaggttgagaatttaatgacactcaaacaggcatgctcctcggaataccaaggagcgcaa300

ggtgcgttcaaagattcgatgattcactgaattctgcaattcacattacttatcgcattt360

cgctgcgttcttcatcgatgcgagagccaagagatccgttgctgaaagttgtatagtttt420

ttataggcatgaaagcccattgactacattctaaatcattcaaatggggtgtgtaaaaga480

catagaacctggaaattcaaagagagccggcctagtcggcgcagcaatccttgcatccgc540

tttgctgccaaagcgaggggtatccaggcctacacatggttcacaggtggaaagatgata600

tgaatgacgggcgtgcacaatgctcctaggagccagctacaaccaacgccatagatattc660

gataatgatccttccgcag679