一种铜-对苯二甲酸纳米粒子、其制备方法及应用与流程

本发明属于纳米医学器件研制领域，具体涉及一种铜-对苯二甲酸纳米粒子、其制备方法及应用。

背景技术：

细胞溶酶体的异常行为与人体内许多疾病密切相关。有效的标记与追踪溶酶体对疾病诊断非常重要。溶酶体内的ph值（ph4.5~5.5）一般低于细胞质基质的ph值（ph~7.4）（analyticalchemistry，87卷，1499-1502），基于该特点制备的具有ph敏感性探针来标记细胞溶酶体的工作已被广泛报道（analyticachimicaacta，988卷，66-73）。但是，细胞核内体的ph也是酸性的，这一因素严重干扰了ph敏感性探针对溶酶体标记的准确性。溶酶体的功能与细胞内h2o2含量有关，且与细胞质基质相比，溶酶体内的h2o2含量偏高（biosensorsandbioelectronics，79卷，237-243），基于该特点制备的具有h2o2敏感性探针来标记细胞溶酶体的工作也被广泛报道（methodsinmolecularbiology，1594卷，129-139）。然而，h2o2在细胞内分布广泛，使用h2o2敏感性探针来标记细胞溶酶体时会受到很强的背景干扰。这些依赖单一因素来标记细胞溶酶体的方法准确度较低，在临床应用中往往会造成误诊。此外，目前商业化的溶酶体标记探针的荧光容易受外界因素影响而猝灭，这些探针在使用时需要避光操作，给实际应用带来很多不便。因此，开发出一种能够准确标记细胞溶酶体且操作简便的溶酶体标记探针是临床中疾病诊断急需解决的问题。

cu²⁺能够催化h2o2分解产生羟基自由基（chemicalcommunications，46卷，9220-9222）。对苯二甲酸能够被羟基自由基氧化成具有稳定荧光性能的羟基对苯二甲酸，是常用的羟基自由基捕获剂（electrochemistrycommunications，2卷，207-210）。cu²⁺能够与对苯二甲酸配位自装成具有金属有机骨架结构的材料铜-对苯二甲酸纳米粒子。铜-对苯二甲酸纳米粒子能够在酸性条件下分解，释放出cu²⁺，进而在h2o2作用下生成荧光物质。

技术实现要素：

本发明的目的在于铜-对苯二甲酸纳米粒子、其制备方法及应用。本发明制得的铜-对苯二甲酸纳米粒子能够通过细胞内吞作用进入细胞溶酶体，并在细胞溶酶体的酸性环境内分解释放cu²⁺，释放出的cu²⁺能够催化溶酶体内的h2o2产生羟基自由基，生成的羟基自由基进一步将该荧光成像探针内的对苯二甲酸氧化成具有稳定荧光性能的羟基对苯二甲酸。溶酶体内的ph比细胞质基质的ph低，h2o2含量比细胞质基质内的h2o2含量高，导致细胞溶酶体的荧光信号强度远高于细胞其他部位的荧光信号强度，从而实现对细胞溶酶体的准确标记。

基于上述目的，本发明采取如下技术方案：

一种铜-对苯二甲酸纳米粒子的制备方法，包括如下步骤:

（1）取醋酸铜分散在质量百分数为0.05~0.1%的可溶性淀粉水溶液中；

（2）将对苯二甲酸与氢氧化钠分散在蒸馏水中，然后将该溶液逐滴加入到步骤（1）的混合溶液中，搅拌，接着将溶液静置20~30h，离心，洗涤，即得到产物，其中，醋酸铜、对苯二甲酸、氢氧化钠摩尔比为（1.2~1.5）:1:（1.8~2.5）。

优选地，具体过程如下：取0.05mmol醋酸铜分散在20ml质量百分数为0.08%的可溶性淀粉水溶液中，将0.035mmol对苯二甲酸与0.07mmol氢氧化钠分散在10ml蒸馏水中，然后将该溶液逐滴加入到上述醋酸铜和淀粉的混合溶液中，搅拌10~30min，接着将溶液静置20~30h，离心、洗涤，即得到产物。

上述制备方法制得的铜-对苯二甲酸纳米粒子。

上述铜-对苯二甲酸纳米粒子作为纳米荧光成像探针的应用，荧光成像时的ph为4~5且h2o2浓度≥0.1mm。

上述铜-对苯二甲酸纳米粒子在制备荧光标记溶酶体制剂和/或荧光标记溶酶体工具中的应用，所述铜-对苯二甲酸纳米粒子能够通过细胞内吞进入细胞溶酶体，并在酸性溶酶体内分解释放出cu²⁺；在细胞溶酶体内释放的cu²⁺能够催化细胞内的h2o2分解产生羟基自由基；进而被羟基自由基氧化成发荧光的物质。所述铜-对苯二甲酸纳米粒子的荧光非常稳定，能够持续48h以上不猝灭。

上述铜-对苯二甲酸纳米粒子在制备荧光标记溶酶体制剂和/或荧光标记溶酶体工具中的应用，荧光成像时的ph为4~5且h2o2浓度≥0.1mm。

一种标记细胞溶酶体的试剂，含有上述铜-对苯二甲酸纳米粒子。

一种标记细胞溶酶体的试剂盒，含有上述铜-对苯二甲酸纳米粒子。

本发明还提供了一种标记细胞溶酶体的方法：

细胞以单层形式生长在培养皿（corningglassworks）中，在细胞密度达到50%时加入纳米荧光成像探针，然后共同培养24小时，细胞用pbs缓冲溶液洗涤，加入新制的4%多聚甲醛的pbs溶液，用荧光显微镜对细胞进行成像，细胞内荧光信号较强的地方即为溶酶体。

本发明铜-对苯二甲酸纳米粒子是一种具有金属-有机骨架结构的材料，在酸性条件下能够释放cu²⁺并能够被羟基自由基氧化生成荧光物质；吸附在所述铜-对苯二甲酸纳米粒子内的可溶性淀粉，所述可溶性淀粉能够使所述铜-对苯二甲酸纳米粒子的zeta电位在ph不同的溶液中保持稳定。本发明还提供了一种标记溶酶体的方法。本发明提供的铜-对苯二甲酸纳米粒子作为纳米荧光成像探针能够被细胞内吞，并进入溶酶体。溶酶体内的ph值比细胞质基质的低，且h2o2含量比细胞质基质的高。该纳米荧光成像探针在细胞的酸性溶酶体内能够分解并释放出cu²⁺，而cu²⁺能够进一步催化细胞溶酶体内的h2o2分解产生羟基自由基。羟基自由基将该纳米荧光成像探针中的对苯二甲酸氧化成具有荧光性质的羟基对苯二甲酸。细胞与一定浓度的铜-对苯二甲酸纳米粒子相互培养一段时间后，铜-对苯二甲酸纳米粒子通过细胞内吞作用进入细胞溶酶体，并在溶酶体内产生大量的羟基自由基，进而生成大量的荧光物质，此时进行荧光成像，细胞溶酶体的荧光成像强度明显比细胞其他部位的荧光成像强度高，进而可以实现溶酶体的标记。

与现有技术相比，本发明提供的铜-对苯二甲酸纳米粒子作为纳米荧光成像探针能够在溶酶体低ph环境和高h2o2浓度刺激下产生稳定的强荧光信号，进而无需避光操作即可实现对细胞溶酶体的准确标记。

附图说明

图1为本发明实施例制备铜-对苯二甲酸纳米粒子及其进行溶酶体标记的工作原理示意图；

图2为本发明实施例制备的铜-对苯二甲酸纳米粒子的扫描电镜图；

图3为本发明实施例制备的铜-对苯二甲酸纳米粒子的x射线衍射图；

图4为本发明实施例制备的铜-对苯二甲酸纳米粒子分散在ph不同的缓冲溶液4h后上清液的紫外-可见吸收图；

图5为本发明实施例制备的铜-对苯二甲酸纳米粒子分散在ph不同的缓冲溶液中的zeta电位；

图6为本发明实施例制备的铜-对苯二甲酸纳米粒子分散在ph不同的缓冲溶液中的荧光光谱；

图7为本发明实施例制备的铜-对苯二甲酸纳米粒子分散在ph为4的缓冲溶液中且h2o2浓度不同条件下的荧光光谱；

图8为本发明实施例制备的铜-对苯二甲酸纳米粒子在ph不同且含有不同金属离子和有机分子的缓冲溶液中的荧光强度；

图9为本发明实施例制备的铜-对苯二甲酸纳米粒子分散在ph为4的缓冲溶液中且h2o2为1mm时荧光光谱随时间的变化图；

图10为本发明实施例制备的铜-对苯二甲酸纳米粒子的细胞毒性；

图11为本发明实施例制备的铜-对苯二甲酸纳米粒子与细胞共同培养后的荧光成像图；

图12为本发明实施例制备的铜-对苯二甲酸纳米粒子与细胞培养后对溶酶体进行标记的细胞荧光成像图；

图13为本发明实施例制备的铜-对苯二甲酸纳米粒子与细胞培养后一周内的细胞荧光成像图。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，但不作为对本发明保护范围的限制。

实施例1

一种铜-对苯二甲酸纳米粒子的制备方法，具体过程如下：

制备均匀的铜-对苯二甲酸纳米粒子，取0.05mmol醋酸铜（cu(ch3coo)2）（0.009083g）分散在20ml质量百分数为0.08%的可溶性淀粉（国药集团化学试剂有限公司）水溶液中，将对苯二甲酸（c8h6o4）（0.005815g，0.035mmol）与氢氧化钠（naoh）（0.0028g，0.07mmol）分散在10ml蒸馏水中，然后将该溶液逐滴加入到上述醋酸铜和淀粉的混合溶液中，搅拌10min，接着将溶液静置24h，最后离心洗涤，即得到产物。

上述产物的电子扫描显微镜像如图2所示，由图2可以看出，产物具有良好的分散性，单个粒子的形貌类似松果状，长轴长约440nm，短轴长约260nm；产物的x射线衍射（λ=1.5418å）图（图3）显示，所有衍射峰位置分别对应于铜-对苯二甲酸的衍射面，显示产物为铜-对苯二甲酸。

实施例2

铜-对苯二甲酸纳米粒子在酸性环境下分解能力的检测

将按实施例1所述制得的样品分散在ph为7和4的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中（样品在缓冲液中的浓度均为12.5μg/ml），在37℃条件下搅拌4h，将产物离心分离后，取上清液，用uv-vis检测，根据750nm处吸收峰强度定性判定溶液中cu²⁺含量变化，结果详见图4。

由图4可知，酸性条件下铜-对苯二甲酸纳米粒子上清液中有明显的属于cu²⁺的吸收峰，而在中性条件下上清液中没有明显的属于cu²⁺的吸收峰，说明该纳米粒子在酸性条件下不稳定，易分解并释放cu²⁺，而在中性条件下很稳定。

实施例3

铜-对苯二甲酸纳米粒子在ph不同的环境下zeta电位的检测

将按实施例1所述制得的样品分散在ph为7和4的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中（样品在缓冲液中的浓度均12.5μg/ml），用zata电位仪检测该纳米粒子在不同ph条件下的zeta电位，结果详见图5。

由图5可知，纳米粒子的zeta电位比较稳定，不随所处环境的ph变化而变化。

实施例4

铜-对苯二甲酸纳米粒子在ph不同的环境下产生荧光的能力检测

将按实施例1所述制得的样品分散在h2o2浓度为1mm（h2o2在四个不同ph缓冲液中的浓度均为1mm），ph分别为4、5、6和7的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中（样品在缓冲液中的浓度均为12.5μg/ml），静置4h后，用荧光分光光度计检测溶液在波长为315nm的光的激发下，在430nm处的荧光峰强，具体结果详见图6。

由图6可知，在h2o2浓度一定条件下，该纳米粒子产生的荧光的强度随所处环境ph的降低而升高。

实施例5

铜-对苯二甲酸纳米粒子在h2o2浓度不同的环境下产生荧光的能力检测

将按实施例1所述制得的样品分散在ph均为4，h2o2浓度分别为0.05mm，0.1mm，0.5mm，1mm和1.5mm的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，样品在缓冲液中的浓度均为12.5μg/ml，静置4h后，用荧光分光光度计检测溶液在波长为315nm的光的激发下，在430nm处的荧光峰强，具体结果详见图7.

由图7可知，在ph一定条件下，该纳米粒子产生的荧光的强度随所处环境中h2o2浓度的升高而升高。

实施例6

铜-对苯二甲酸纳米粒子产生荧光的抗干扰能力检测

将按实施例1所述制得的样品分散在ph为4和7的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，样品在缓冲液中的浓度均为12.5μg/ml，分别将fe³⁺，cu²⁺，mn²⁺，zn²⁺，ca²⁺，mg²⁺，h2o2，葡萄糖或赖氨酸加入上述溶液中(除了h2o2，其他浓度均为1μm，h2o2浓度分别为0.1mm、1mm)，静置4h后，用荧光分光光度计检测溶液在波长为315nm的光的激发下，在430nm处的荧光峰强，具体结果详见图8。

图8中h2o2浓度为0.1mm，10*h2o2代表h2o2浓度为1mm，由图8可知，该纳米粒子产生的荧光的强度不受环境中存在的金属离子和有机分子的影响。

实施例7

铜-对苯二甲酸纳米粒子产生荧光的稳定性检测

将按实施例1所述制得的样品分散在ph为4，h2o2浓度为1mm的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，样品在缓冲液中的浓度均为12.5μg/ml，在分散后的不同时间点，用荧光分光光度计检测溶液在波长为315nm的光的激发下，在430nm处的荧光峰强，具体结果详见图9。

由图9可知，该纳米粒子产生的荧光的强度随分散时间的延长而增加，在分散48h后仍保持增长趋势。

实施例8

选取hela细胞，通过cck-8实验研究铜-对苯二甲酸纳米粒子的细胞毒性。hela细胞以单层形式生长在96孔板（corningglassworks）中，在细胞密度达到50%时分别加入按实施例1制备的样品共同培养（样品在新鲜培养基中的浓度依次为2.5、7.5、12.5、17.5、25μg/ml），细胞和粒子培养24小时后更换为新鲜培养基（新鲜培养基用量为100μl），并加入10μlcck-8溶液继续培养2h，最后用酶标仪（elisa）测定该衍生的cck-8溶液的光学强度（最大吸收位置为450nm），间接的反映活细胞的浓度，具体结果详见图10，图10显示根据实施例1制得的样品对hela细胞的生长抑制率随粒子在培养基中的浓度的增加而升高，说明纳米粒子被细胞内吞进入溶酶体，在溶酶体内产生自由基，从而导致细胞存活率下降。

实施例9

用荧光成像技术检测根据实施例1制得的样品进入细胞的情况。hela细胞以单层形式生长在100μl培养基中，在细胞密度达到50%时加入根据实施例1制得的样品（样品在培养基中的浓度为12.5μg/ml）共同培养24小时，细胞用pbs缓冲溶液（10mm，ph7.4）洗涤三次，加入10μl新制的质量分数为4%多聚甲醛的pbs溶液（pbs溶液浓度10mm，ph7.4）。成像实验在荧光显微镜上进行，具体结果详见图11。

图11显示成像区域位于细胞内部，说明根据实施例1制得的样品能够进入细胞。本发明制得的铜-对苯二甲酸纳米粒子进入细胞溶酶体内的工作原理如图1所示，由图1可知，本发明制得的铜-对苯二甲酸纳米粒子能够通过细胞内吞作用进入细胞溶酶体，并在细胞溶酶体的酸性环境内分解释放cu²⁺，释放出的cu²⁺能够催化溶酶体内的h2o2产生羟基自由基，生成的羟基自由基进一步将该荧光成像探针内的对苯二甲酸氧化成具有稳定荧光性能的羟基对苯二甲酸。溶酶体内的ph比细胞质基质的ph低，h2o2含量比细胞质基质内的h2o2含量高，导致细胞溶酶体的荧光信号强度远高于细胞其他部位的荧光信号强度，从而实现对细胞溶酶体的准确标记。

实施例10

用商用溶酶体探针标记溶酶体的方法检验根据实施例1制得的样品标记溶酶体的情况。hela细胞以单层形式生长在100μl培养基中，在细胞密度达到50%时加入根据实施例1制得的样品（样品在培养基中的浓度为12.5μg/ml）共同培养24小时，向培养液中加入商用溶酶体探针50μllysotrackerred继续避光培养30min，细胞用pbs缓冲溶液（10mm，ph7.4）洗涤三次。成像实验在荧光显微镜上进行，具体结果详见图12，图12中的cubdc-2代表铜-对苯二甲酸纳米粒子。

图12显示细胞内发光位置与溶酶体位置重合，说明根据实施例1制得的样品能够被细胞内吞进入细胞的溶酶体，并在溶酶体内产生荧光。

实施例11

用荧光成像技术检测根据实施例1制得的样品在细胞内进行荧光成像的稳定性。hela细胞以单层形式生长在100μl培养基中，在细胞密度达到50%时加入根据实施例1制得的样品（样品在培养基中的浓度为12.5μg/ml）共同培养24小时，细胞用pbs缓冲溶液（10mm，ph7.4）洗涤三次，加入10μl新制的质量分数为4%多聚甲醛的pbs溶液（pbs溶液浓度为10mm，ph7.4）将细胞进行固定并保存。在不避光的条件下，在一个星期内观察上述处理后的细胞的成像情况。成像实验在荧光显微镜上进行，具体结果详见图13。

图13显示细胞的荧光信号在一个星期内没有发生明显变化，说明根据实施例1制得的样品在细胞内的荧光信号稳定，不易猝灭。