一种用于他汀类药物个体化基因检测的探针组及试剂盒的制作方法

本发明涉及基因检测技术领域，具体为一种用于他汀类药物个体化基因检测的探针组及试剂盒。

背景技术：

他汀类药物是羟甲基戊二酰辅酶a(hmg-coa)还原酶抑制剂。他汀类药物能显著降低血浆胆固醇(tc)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)，治疗高脂血症外，还有抗动脉粥样硬化等，适用于原发性高胆固醇血症及混合型高脂血症，是当前防治高胆固醇血症和动脉粥样硬化疾病非常重要的药物，目前国内外常用的他汀类药物有辛伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀和瑞舒伐他汀。他汀类药物在临床中使用最大的困扰是其不良反应，特别是肌肉毒性。他汀类相关的肌肉毒性包括肌痛(无肌肉退化迹象的疼痛)、肌病(有肌肉退化迹象的疼痛)和横纹肌溶解(严重的肌肉损伤和急性肾损伤)，在《临床血脂学杂志》上发表的一项研究中，60％停止服用他汀类药物的人认为肌肉疼痛是主要原因，有许多临床因素与增加他汀类肌病的风险有关，已有许多的临床证据表明，他汀类药物使用的剂量和对药物的有效性由特异的药物代谢酶、作用靶点和转运载体决定，当这些标志基因发生遗传变异，药物的代谢和吸收就发生变化，导致药物不良反应的发生率增高，以及药物治疗的有效性改变，这些标志基因与药物的功能密切相关，通过检测这些标志基因的遗传变异，可确定个体用药的种类以及使用剂量，实现精准用药、安全用药的目的,有效提高药物治疗的有效性、预防adr的发生，过去的二十年里，人类在分析个体基因组的能力上大大提高，取得了很多显著的成果，最初分析一个单独个体的若干目标基因需要耗时几个月，费用高达上万美元，然而现在，这种检测已经变成了越来越简单的一个过程。基因组序列测定的费用越来越低，收集个体样本遗传信息的速度也越来越快，第二代高通量测序技术(next-generationsequencingtechnology)具有快速、准确、低成本的优点，可同时对多个基因的各种类型突变进行检测，已经被广泛应用于遗传缺陷的病因检测和分子遗传学诊断，然而，到目前为止，市场没有专门针对他汀类药物个体化用药基因检测的高通量探针、芯片或试剂盒，使得他汀类药物的使用大多数只能通过试错的方式进行，不但可能给患者带来痛苦，甚至会影响疾病的治疗，综上所述，开发一种高效、准确、低价的试剂盒，用于评估他汀类药物疗效及副作用的基因检测，意义非常重大。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于他汀类药物个体化基因检测的探针组及试剂盒，以解决上述背景技术中提出的问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种用于他汀类药物个体化基因检测的探针组，包括kif6、slco1b1、coq2、apoa5、apoe、abcc2、abcg2、gatm、hmgcr、abcb1等10个基因的共计12个多态性位点，所述带生物素标记的探针如下：所述探针1：ccagacatctgactcccagcatgaacggtcccaactcctctctaacaaaag，所述探针2：tctgggtcatacatgtggatatatgcgttcatgggtaatatgcttcgtgga，所述探针3：tctaccacaactttcccacaaatcaagctcacatcaatttcttgagttgct，所述探针4：gagccccaggaactggagcgaaagtaagatttgccccatgaggaaaagctg，所述探针5：ccgcgatgccgatgacctgcagaagcgcctggcagtgtaccaggccggggc，所述探针6：gtcgatgttgaattttctgatgaatagatattagtttctttagaatacctg，所述探针7：atgattcctggactgcgtctggaacaaagactcttctattaatatgattgt，所述探针8：cactctgacggtgagagaaaacttaaagttctcagcagctcttcggcttgc，所述探针9：atagcgccacccaaaccagtcctaccgttataaaagcaaatcaaagcactc，所述探针10：actacatctcaaaaaaaaattttttaaaatcctttatattacaatcatact，所述探针11：gaaagataagaaagaactagaaggtactgggaaggtgagtcaaactaaata，所述探针12：atatatatgtgcatatgtgtatacaagtaaaagtgtgtatatatgtataca。

一种用于他汀类药物个体化基因检测的试剂盒，包括所获得的探针组(300ul，30ng/ul)、封闭液(800ul)、杂交缓冲液(800ul)、结合缓冲液(3.2ml)、漂洗缓冲液(9ml)、洗脱缓冲液和pcr反应液(580ul)，所述封闭液(每20ul)为人cot-1dna(购自invitrogen)和5ul混合液，特异性封闭引物，共10ul，每种引物浓度为1nmol/ul，所述引物种类分别为：所述引物1：aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctct，所述引物2：caagcagaagacggcatacgagatcggtctcggcattcctgctgaaccgc，所述杂交缓冲液为5倍浓度的sspe，5mmedta和1％sds混合液，所述结合缓冲液为1mnacl，10mmtris-hcl(ph7.5)和1mmedta混合液，所述漂洗缓冲液为0.5倍浓度的ssc溶液和0.1％sds混合液，所述pcr反应液为2uldntps(每种10mm)，0.5ul引物1(aatgatacggcgaccaccgag，50pmol)，0.5ul引物2(caagcagaagacggcatacg*a，50pmol)，20ul5倍浓度的phusion缓冲液，1ulhotstartphusion酶(购自newenglandbiolabs)，5uldmso和51uldh2o混合液，所述洗脱缓冲液为10mmtris-hcl和1mmedta混合，调ph至8.0，水定容至500ml。

根据上述技术方案，所述20倍浓度的sspe缓冲液，购自lifetechnologies。

根据上述技术方案，所述edta溶液：0.5m，ph8.0，购自lifetechnologies。

根据上述技术方案，所述20倍浓度的ssc溶液：购自lifetechnologies。

与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：提供一种用于他汀类药物疗效及副作用的基因检测的探针组，所述探针组包含能同时特异性捕获12个目标区域的探针，这些区域为kif6、slco1b1、coq2、apoa5、apoe、abcc2、abcg2、gatm、hmgcr、abcb1等10个基因的共计12个多态性位点，另一方面，本发明提供一种用于评估他汀类药物疗效及副作用的基因检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述本发明的一种用于评估他汀类药物疗效及副作用的基因检测的探针组。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是本发明的试剂盒使用流程图；

图2是本发明的临床诊断实例表。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1-2，本发明提供一种技术方案：一种用于他汀类药物个体化基因检测的探针组，包括kif6、slco1b1、coq2、apoa5、apoe、abcc2、abcg2、gatm、hmgcr、abcb1等10个基因的共计12个多态性位点，带生物素标记的探针如下：探针1：ccagacatctgactcccagcatgaacggtcccaactcctctctaacaaaag，探针2：tctgggtcatacatgtggatatatgcgttcatgggtaatatgcttcgtgga，探针3：tctaccacaactttcccacaaatcaagctcacatcaatttcttgagttgct，探针4：gagccccaggaactggagcgaaagtaagatttgccccatgaggaaaagctg，探针5：ccgcgatgccgatgacctgcagaagcgcctggcagtgtaccaggccggggc，探针6：gtcgatgttgaattttctgatgaatagatattagtttctttagaatacctg，探针7：atgattcctggactgcgtctggaacaaagactcttctattaatatgattgt，探针8：cactctgacggtgagagaaaacttaaagttctcagcagctcttcggcttgc，探针9：atagcgccacccaaaccagtcctaccgttataaaagcaaatcaaagcactc，探针10：actacatctcaaaaaaaaattttttaaaatcctttatattacaatcatact，探针11：gaaagataagaaagaactagaaggtactgggaaggtgagtcaaactaaata，探针12：atatatatgtgcatatgtgtatacaagtaaaagtgtgtatatatgtataca。

一种用于他汀类药物个体化基因检测的试剂盒，包括所获得的探针组(300ul，30ng/ul)、封闭液(800ul)、杂交缓冲液(800ul)、结合缓冲液(3.2ml)、漂洗缓冲液(9ml)、洗脱缓冲液和pcr反应液(580ul)，封闭液(每20ul)为人cot-1dna(购自invitrogen)和5ul混合液，特异性封闭引物，共10ul，每种引物浓度为1nmol/ul，引物种类分别为：引物1：aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctct，引物2：caagcagaagacggcatacgagatcggtctcggcattcctgctgaaccgc，杂交缓冲液为5倍浓度的sspe，5mmedta和1％sds混合液，结合缓冲液为1mnacl，10mmtris-hcl(ph7.5)和1mmedta混合液，漂洗缓冲液为0.5倍浓度的ssc溶液和0.1％sds混合液，pcr反应液为2uldntps(每种10mm)，0.5ul引物1(aatgatacggcgaccaccgag，50pmol)，0.5ul引物2(caagcagaagacggcatacg*a，50pmol)，20ul5倍浓度的phusion缓冲液，1ulhotstartphusion酶(购自newenglandbiolabs)，5uldmso和51uldh2o混合液，洗脱缓冲液10mmtris-hcl和1mmedta混合，调ph至8.0，水定容至500ml。

根据上述技术方案，20倍浓度的sspe缓冲液，购自lifetechnologies。

根据上述技术方案，edta溶液：0.5m，ph8.0，购自lifetechnologies。

根据上述技术方案，20倍浓度的ssc溶液：购自lifetechnologies。

一种试剂盒的使用方法为：

1、dna提取及全基因组文库制备

使用商业试剂盒提取来自口腔拭子或血液的dna后，用文库构建试剂盒(可以是illumina官方提供试剂盒，也可以是其他厂商)建立基因组文库；

2、目标基因片段的特异性捕获及测序

1)制备以下混合体系：取250ng步骤1的构建好的全基因组文库，加入10μl封闭液，2μl探针组；置于pcr仪上：95℃，7min，之后65℃，2min；

2)取16ul65℃预热的杂交缓冲液加入到混合液中,然后于pcr仪上65℃杂交22小时，得到杂交体系混合物；

3)将myonec1链霉亲和素磁珠(购自lifetechnologies)涡旋震荡使磁珠充分悬浮，取30ulmyonec1链霉亲和素磁珠到新的1.5ml的离心管；

4)将装有30ulmyonec1链霉亲和素磁珠的1.5ml离心管放入磁力架上保持静止一分钟，小心吸弃上清；

5)取下离心管，加入200ul的结合缓冲液，涡旋震荡至少5s，放入磁力架上静止一分钟，小心吸弃上清，重复三次；

6)取下离心管，加入200ul的结合缓冲液，涡旋震荡；

7)将步骤2)得到的杂交体系混合物加入到步骤6)的离心管中，旋窝震荡至少5s(不用离心)，置于旋转仪上室温旋转1小时(60转/分钟)；

8)利用漂洗缓冲液室温清洗步骤7)的磁珠三次，每次15分钟；

9)将步骤8)的磁珠用13ulh2o室温下重悬起来；

10)pcr扩增：

pcr体系：pcr反应液，25ul；重悬的磁珠，11ul，水，14ul；

pcr程序:98℃，30s；(98℃，10s,65℃，30s,72℃，30s)18个循环；72℃，5min。

11)利用agencourtampurexp核酸纯化试剂盒(购自beckmancoulter)，根据使用手册纯化pcr产物；

12)将得到的文库在测序仪(包括但不限于illuminamiseq)上进行测序。

试剂盒的使用效果验证

1)目标区域的数据质量

利用本试剂盒检测26例样本，结果证实目的标记基因的捕获率满意，目标区域的平均有效测序数据量达到4.01mb，目标区域的平均测序深度为1113×，远远高于一般的遗传信息诊断要求(一般为20x)，且12个目标区域区域覆盖率均为100％，可满足检测分析的需求。

表1目的标记基因测序数据质量

2)与传统方法的结果比较

与传统的pcr+桑格法测序比较，二者结果完全一致

3)一例本发明探针组及试剂盒的临床诊断实例，如图2。

4)利用本发明试剂盒对20例患者做出的个体化用药检测结果

注:√预测疗效正常或毒副作用低。

！用药需小心，疗效差或毒副作用风险高。

基于上述，本发明的优点在于，本发明，提供一种用于他汀类药物疗效及副作用的基因检测的探针组，所述探针组包含能同时特异性捕获12个目标区域的探针，这些区域为kif6、slco1b1、coq2、apoa5、apoe、abcc2、abcg2、gatm、hmgcr、abcb1等10个基因的共计12个多态性位点，另一方面，本发明提供一种用于评估他汀类药物疗效及副作用的基因检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述本发明的一种用于评估他汀类药物疗效及副作用的基因检测的探针组。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。