一种快速检测sh2sh2基因型甜玉米的引物及其应用的制作方法

本发明涉及甜玉米育种领域，尤其涉及一种用于快速检测sh2sh2基因型甜玉米的引物及其应用。

背景技术：

甜玉米是玉米属的一个亚种，起源于美洲大陆，是一种集粮、果、蔬、饲于一体的经济型作物。甜玉米是一种营养丰富、口感独特的鲜食玉米，深受消费者喜爱。随着人民生活水平的不断提高，人们的饮食结构也正在向营养、健康、绿色、环保的消费观念转变。在我国供给侧改革的大背景下，城乡居民对鲜食玉米的需求量越来越大。不断培育优良甜玉米品种，提供更多更好的优质鲜食玉米，以不断满足人们日益增长的消费需求，是农业科研的迫切任务之一。

甜玉米由控制胚乳碳水化合物转化的一个或多个相关基因发生隐性突变形成，是隐性胚乳突变体。美国是世界上开展甜玉米育种研究最早的国家，而我国对甜玉米的研究起步较晚。由于我国不是甜玉米的起源中心，很多材料依赖于从美国、泰国等海外引进，甜玉米的亲缘关系比较近，类型较单一，从而严重影响了我国甜玉米育种的进一步发展。如何快速的缩短甜玉米育种进程，培育新类型变得尤为重要。

目前常用的自交系选育方法有回交转育，回交转育的方法，如要把普通型玉米自交系a(sh2sh2)，转育成超甜玉米自交系a(sh2sh2)，先用自交系a(sh2sh2)与某个超甜玉米(sh2/sh2)杂交获得f1，f1再和自交系a回交。考虑到超甜玉米是隐性单基因遗传的，所以在回交后代中进行一次自交，以便分离出超甜玉米的表现型。然后再进行第二次和第三次回交。第三次回交后再行自交，分离超甜玉米表现型，即为超甜玉米自交系a。这样转育一个自交系，至少要6代。这种常规转育的方法需要时间长。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种快速检测sh2sh2基因型甜玉米的引物，其特征在于，所述引物根据sh2序列的突变位点特征设计，所述引物包括上游引物序列p1和下游引物序列p2，其中所述上游引物的核苷酸序列p1为5’ggcaaagtaataacataaatggt3’，如seqidno.1所示，所述下游引物的核苷酸序列p2为5’ggtaagaagaaaaagaagaagga3’，如seqidno.2所示。

本发明的快速检测sh2sh2基因型甜玉米的引物在普通玉米自交系转育成超甜玉米自交系的培育过程中的应用，包括以下步骤：

s1.提取甜玉米的dna；

s2.利用seqidno.1所示的上游引物和seqidno.2所示的下游引物通过pcr检测法从步骤s1提取的dna中筛选出sh2sh2基因型甜玉米作为供体亲本；

s3.辅助回交育种，利用普通玉米sh2sh2作为受体亲本与步骤s2筛选出的供体亲本进行杂交，后代与受体亲本回交，直至最后经一代自交获得bc3f2群体，在bc3f2中挑选褶皱籽粒，即得到甜玉米sh2sh2自交系。

优选的，所述步骤s1提取甜玉米dna的方法包括以下步骤：

s1-1.65℃预热ctab缓冲液；

s1-2·取甜玉米新鲜叶片0.2g置于1ml步骤s1-1预热后的ctab缓冲液中研磨，转入2ml离心管中；

s1-3.将装有研磨液的离心管置于65℃水浴锅内，加热30min，并不时轻摇离心管；

s1-4.待冷至室温后，加入与研磨液等体积氯仿与异戊醇混合液，所述混合液中氯仿与异戊醇的体积比为24∶1，轻摇试管10min；

s1-5.在10000rpm的转速下进行离心10min，之后将上清液转至另一1.5ml离心管中；

s1-6.最后在装有上清液的离心管中加入500μl乙醇，置于-20℃轻摇混匀至产生絮状沉淀，再经过离心分离，所得沉淀采用乙醇清洗、晾干后得到dna产品。

进一步优选的，所述ctab缓冲液中含有1.17mmnacl、0.0016mmedtaph＝8.0、0.835mmttis-hclph＝7.5、1.6％ctab、1％β-疏基乙醇。

优选的，所述s2中pcr检测法包括以下步骤：

s2-1.pcr扩增，将提取甜玉米dna为模板，利用如权利要求1的引物序列进行pcr扩增，反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，52℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保温；

s2-2.取10μl步骤s2-1获得的pcr扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，选取有目的条带的甜玉米作为供体亲本。

进一步优选的，步骤s2-2选取的目的条带长度为694bp。

优选的，步骤s3所述辅助回交育种包括以下步骤：

s3-1.利用普通玉米受体亲本sh2sh2与步骤s2筛选的甜玉米供体亲本sh2sh2杂交，所得f1与普通玉米受体亲本回交得到bc1f1；

s3-2.将bc1f1籽粒播种，苗期利用pcr检测法筛选含隐性sh2基因的植株；

s3-3.含隐性sh2基因的植株与普通玉米受体亲本继续回交；

s3-4.继续利用该筛选方法筛选回交世代中含隐性sh2基因的玉米直至bc3f1，最后经一代自交获得bc3f2群体，在bc3f2中挑选褶皱籽粒，即得甜玉米sh2sh2自交系。

进一步优选的，步骤s3-2所述的pcr检测法是将提取甜玉米dna为模板，利用如权利要求1的引物序列进行pcr扩增，反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，52℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保温；取10μl步骤s2-1获得的pcr扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，筛选含隐性sh2基因的植株。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果：与传统育种技术相比，本发明的快速准确选育甜玉米自交系方法通过特异性引物检测，能准确高效地筛选含有隐性基因sh2的个体，通过回交世代中的定向选择显著提高了甜玉米自交系的选育效率，解决传统育种周期长的问题。

附图说明

下面结合附图说明对本发明做进一步说明。

图1为本发明涉及到的特异性引物位点设计图；

图2为本发明涉及到的分子标记图；

图3为本发明涉及到的快速转育流程图。

具体实施方式

一种快速检测sh2sh2基因型甜玉米的引物，所述引物根据sh2序列的突变位点特征设计如图1所示，所述引物包括上游引物序列p1和下游引物序列p2，其中所述上游引物的核苷酸序列p1为5’ggcaaagtaataacataaatggt3’，如seqidno.1所示，所述下游引物的核苷酸序列p2为5’ggtaagaagaaaaagaagaagga3’，如seqidno.2所示。

如图1-3所示，一种快速准确选育甜玉米自交系方法，包括如下步骤：

s1.提取甜玉米的dna，具体步骤如下：

s1-1.65℃预热ctab缓冲液，ctab缓冲液中含有1.17mmnacl、0.0016mmedtaph＝8.0、0.835mmttis-hclph＝7.5、1.6％ctab、1％β-疏基乙醇；

s1-2.取甜玉米新鲜叶片0.2g置于1ml步骤s1-1预热后的ctab缓冲液中研磨，转入2ml离心管中；

s1-3.将装有研磨液的离心管置于65℃水浴锅内，加热30min，并不时轻摇离心管；

s1-4.待冷至室温后，加入与研磨液等体积氯仿与异戊醇混合液，所述混合液中氯仿与异戊醇的体积比为24∶1，轻摇试管10min；

s1-5.在10000rpm的转速下进行离心10min，之后将上清液转至另一1.5ml离心管中；

s1-6.最后在装有上清液的离心管中加入500μl乙醇，置于-20℃轻摇混匀至产生絮状沉淀，再经过离心分离，所得沉淀采用乙醇清洗、晾干后得到dna产品。(将晾干的dna中加入ddh2o溶解并稀释至50ng/μl，进行pcr检测，得到甜玉米的dna)

s2.利用seqidno.1所示的上游引物和seqidno.2所示的下游引物通过pcr检测法从步骤s1提取的dna中筛选出sh2sh2基因型甜玉米作为供体亲本所pcr检测包括以下步骤：

s2-1.pcr扩增，将提取甜玉米dna为模板，利用如权利要求1的引物序列进行pcr扩增，反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，52℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保温；

s2-2.取10μl步骤s2-1获得的pcr扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，选取有目的条带的甜玉米作为供体亲本(条带长度为694bp)，如图2所示。

s3.辅助回交育种，利用普通玉米sh2sh2作为受体亲本与步骤s2筛选出的供体亲本进行杂交，后代与受体亲本回交，直至最后经一代自交获得bc3f2群体，在bc3f2中挑选褶皱籽粒，即得到甜玉米sh2sh2自交系，具体步骤如下：

s3-1.利用普通玉米受体亲本sh2sh2与步骤s2筛选的甜玉米供体亲本sh2/sh2杂交，所得f1与普通玉米受体亲本回交得到bc1f1；

s3-2.将bc1f1籽粒播种，苗期利用pcr检测法筛选含隐性sh2基因的植株；

s3-3.含隐性sh2基因的植株与普通玉米受体亲本继续回交；

s3-4.继续利用该筛选方法筛选回交世代中含隐性sh2基因的玉米直至bc3f1，最后经一代自交获得bc3f2群体，在bc3f2中挑选褶皱籽粒，即得甜玉米sh2sh2自交系。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，但本发明的保护范围不限于以上实施例。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>河北农业大学

<120>一种快速检测sh2sh2基因型甜玉米的引物及其应用

<130>2019

<141>2019-06-20

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列()

<400>1

ggcaaagtaataacataaatggt23

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列()

<400>2

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