棉花耐逆基因GhCBF及其编码蛋白和应用的制作方法

本发明涉及植物学领域，具体地，涉及棉花耐逆基因ghcbf及其编码蛋白和应用。

背景技术：

植物受低温的影响，其光合能力、能量和物质合成的能力会下降，最终有可能导致死亡。但是，植物为了适应环境而提高自身在低温环境下的耐受力，具备一套复杂的低温信号传递和调控机制。

cbfs可以调节许多基因的表达，这些基因的产物参与磷酸肌醇代谢，转录，渗透物质的生物合成，ros解毒，膜运输，激素代谢，信号传导以及其他许多已知或假定具有细胞保护功能的物质的合成。

棉花包括陆地棉和海岛棉是对低温敏感的一类经济作物，在我国的大部分棉花种植区域，春季气温的不稳定及突发性的寒流使棉苗处于低温胁迫环境下，对棉花的种植和棉花的生长造成了极大的危害，导致棉花减产。

因此，本领域迫切需要开发提高植物低温耐受力的方法，并研究植物耐低温性的提高与植物(如棉花)产量和品质的相关性。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种提高植物低温耐受力的方法，并研究植物耐低温性的提高与植物(如棉花)产量和品质的相关性。

本发明第一方面提供了一种ghcbf基因或其编码蛋白的用途，用于选自下组的一种或多种用途：

(a)用于制备提高植物抗逆性的试剂或组合物；

(b)用于提高植物抗逆性。

在另一优选例中，所述抗逆性包括耐冷性。

在另一优选例中，所述耐冷性包括选自下组的一种或多种性能：

(a)增强植物对低温环境的耐受性；

(b)提高植物在低温环境下的生存能力。

在另一优选例中，所述的植物包括锦葵科植物。

在另一优选例中，所述植物包括棉属植物。

在另一优选例中，所述的植物包括棉花。

在另一优选例中，所述ghcbf基因包括ghcbf蛋白编码基因和ghcbf基因保守区序列。

在另一优选例中，所述ghcbf基因包括野生型ghcbf基因和突变型ghcbf基因。

在另一优选例中，所述的突变型包括突变后编码蛋白的功能未发生改变的突变形式(即功能与野生型编码蛋白相同或基本相同)。

在另一优选例中，所述的突变型ghcbf基因编码的多肽与野生型ghcbf基因所编码的多肽相同或基本相同。

在另一优选例中，所述的突变型ghcbf基因包括与野生型ghcbf基因相比，同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％)的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的突变型ghcbf基因包括在野生型ghcbf基因的5＇端和/或3＇端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的ghcbf基因选自下组：cdna序列、基因组序列、或其组合。

在另一优选例中，所述ghcbf蛋白的氨基酸序列选自下组：

(i)具有seqidno.:2所示氨基酸序列的多肽；

(ii)将如seqidno.:2所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有提高植物抗逆性的，由(i)衍生的多肽；或

(iii)氨基酸序列与seqidno.:2所示氨基酸序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％或≥98％)，具有所述ghcbf活性的多肽。

在另一优选例中，所述ghcbf基因的核苷酸序列选自下组：

(a)编码如seqidno.:2所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如seqidno.:1所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与seqidno.:1所示序列的同源性≥75％(较佳地≥85％，更佳地≥90％或≥95％)的多核苷酸；

(d)在seqidno.:1所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的ghcbf基因的核苷酸序列如seqidno.:1所示。

在另一优选例中，所述的ghcbf基因的编码蛋白如seqidno.:2所示。

在另一优选例中，所述的ghcbf基因来源于植物，较佳地来源于锦葵科植物，更佳地来源于棉花，最佳地来源于陆地棉。

在另一优选例中，所述的组合物包括农用组合物。

本发明第二方面提供了一种提高植物抗逆性的方法，包括步骤：

(a)将外源的构建物导入植物细胞，其中所述的构建物含有外源的ghcbf基因序列、促进ghcbf基因表达的外源核苷酸序列，从而获得导入外源构建物的植物细胞；

(b)将上一步骤获得的所述导入外源构建物的植物细胞，再生成植株：和

(c)任选地对所述再生的植株进行鉴定，从而获得提高植物抗逆性的植物。

在另一优选例中，所述外源的ghcbf基因序列还包含与orf序列操作性连接的启动子和/或终止子。

在另一优选例中，所述的启动子选自下组：组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子、和强启动子。

在另一优选例中，所述的组成性启动子包括35s启动子。

本发明第三方面提供了一种提高植物抗逆性的方法，所述方法包括以下步骤：在所述植物中，促进ghcbf基因的表达或促进ghcbf蛋白的活性。

在另一优选例中，所述方法包括给予植物ghcbf基因或其编码的多肽的促进剂。

在另一优选例中，所述方法包括向植物中导入外源的ghcbf基因。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：

(i)提供一植物或植物细胞；和

(ii)将ghcbf基因序列导入所述植物或植物细胞，从而获得转基因的植物或植物细胞。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：

(a)提供携带ghcbf基因序列的表达载体的农杆菌；

(b)将植物细胞或组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使ghcbf的基因序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(c)选择已转入ghcbf基因序列的植物细胞或组织或器官；和

(d)将步骤(c)中的植物细胞或组织或器官再生为植株。

本发明第四方面提供了一种ghcbf基因或其编码蛋白的调控剂的用途，用于调控植物的抗逆性，或用于制备调控植物抗逆性的试剂或组合物。

在另一优选例中，所述的组合物包括农用组合物。

在另一优选例中，所述的调控剂包括促进剂、抑制剂。

在另一优选例中，所述促进剂为促进ghcbf基因或其编码蛋白表达的物质。

在另一优选例中，所述抑制剂选自下组：反义核酸、抗体、小分子化合物、crispr试剂、sirna、shrna、mirna、小分子配体、或其组合。

在另一优选例中，所述的促进剂选自下组：小分子化合物、核酸分子、或其组合。

在另一优选例中，所述的调控剂为促进剂，并且所述的调控是指增强植物的抗逆性。

在另一优选例中，所述的调控剂为抑制剂，并且所述的调控是指减弱植物的抗逆性。

在另一优选例中，所述的调控剂包括小分子化合物、或核酸类物质。

在另一优选例中，所述的核酸类物质选自下组：mirna、shrna、sirna、或其组合。

在另一优选例中，所述抗逆性包括耐冷性。

本发明第五方面提供了一种筛选调控植物抗逆性的物质的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将待测物质给予某植物；

b)检测该植物中ghcbf基因或其编码蛋白的活性或表达情况；

如果与未给予待测物质的对照植物相比，所述ghcbf基因或其编码蛋白的活性或表达上调，则所述待测物质是增强植物抗逆性的候选物质；和/或

如果与未给予待测物质的对照植物相比，所述ghcbf基因或其编码蛋白的活性或表达下调，则所述待测物质是减弱植物抗逆性的候选物质。

本发明第六方面提供了一种制备基因工程的植物组织或植物细胞的方法，包括步骤：

调控植物组织或植物细胞中的ghcbf基因或其编码蛋白的表达和/或活性，从而获得基因工程的植物组织或植物细胞。

在另一优选例中，所述调控包括提高植物组织或植物细胞中的ghcbf基因或其编码蛋白的表达和/或活性；和/或降低植物组织或植物细胞中的ghcbf基因或其编码蛋白的表达和/或活性。

在另一优选例中，所述调控还包括向植物组织或植物细胞中导入ghcbf基因或其编码蛋白的促进剂或抑制剂。

在另一优选例中，所述植物组织或植物细胞中ghcbf基因或其编码蛋白的表达量或活性降低了≥50％，较佳地，≥70％，更佳地，≥90％或100％。

在另一优选例中，所述“降低”是指ghcbf基因或其编码蛋白的表达或活性降低满足以下条件：

a1/a0的比值≤80％，更佳地，≤50％，更佳地≤20％，最佳地为0-10％；其中，a1为ghcbf基因或其编码蛋白的表达或活性；a0为野生型同种类型植物组织或植物细胞中相同ghcbf基因或其编码蛋白的表达或活性。

在另一优选例中，所述的降低指与野生型ghcbf基因或其编码蛋白的表达水平e0相比，所述植物组织或植物细胞中ghcbf基因或其编码蛋白的表达水平e1为野生型的0-80％，较佳地0-60％，更佳地0-40％。

在另一优选例中，所述的降低植物组织或植物细胞中ghcbf基因或其编码蛋白的表达或活性通过选自下组的方式实现：基因突变、基因敲除、基因中断、rna干扰技术、crispr技术、zfn(锌指核酸内切酶技术)、talen(类转录激活因子效应物核酸酶)、vigs技术、或其组合。

在另一优选例中，所述方法还包括向植物组织或植物细胞中导入ghcbf基因或其编码蛋白的促进剂或抑制剂。

在另一优选例中，所述促进剂为促进ghcbf基因或其编码蛋白表达的物质。

在另一优选例中，所述的促进剂选自下组：小分子化合物、核酸分子、或其组合。

在另一优选例中，所述抑制剂选自下组：反义核酸、抗体、小分子化合物、crispr试剂、sirna、shrna、mirna、小分子配体、或其组合。

本发明第七方面提供了一种制备基因工程植物的方法，包括步骤：

将本发明第六方面所述方法制备的基因工程的植物组织或植物细胞再生为植物体，从而获得基因工程植物。

本发明第八方面提供了一种基因工程植物，所述的植物是用本发明第七方面所述的方法制备的。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为陆地棉tm-1在不同温度下的存活率分析。

图2为ghcbf基因在10℃低温诱导处理不同时间后的转录水平分析结果。

图3a为cbf基因vigs沉默后的棉花在10℃低温条件下的生长表型；图3b为cbf基因vigs沉默后的棉花在10℃低温条件下的存活率统计。

具体实施方式

经过广泛而深入的研究，本发明人发现，提高ghcbff基因或其编码蛋白的表达或活性，可显著提高植物(如棉属植物)的抗逆性(如植物耐冷性)。在此基础上，本发明人完成了本发明。

ghcbf基因

如本文所用，术语“ghcbf基因”、“耐逆基因”、“本发明基因”可以互换使用，都是指本发明的具有提高植物(如棉属植物)抗逆性，尤其是对低温耐受力的基因。

cbf蛋白c-重复序列结合因子，也被称为脱水响应元件结合蛋白属于低温胁迫诱导响应元件转录因子它可以结合到诸如cor基因启动子的顺式作用元件上，激活这些基因的表达并且表达产物参与磷酸肌醇代谢，转录，渗透物质的生物合成，ros解毒，膜运输，激素代谢，信号传导以及其他许多已知或假定具有细胞保护功能的物质的合成。

本发明从陆地棉tm-1分离克隆一个耐逆相关的基因cdna片段，通过序列分析选取该基因保守区序列构建vigs载体，通过vigs技术体系转化陆地棉后引发陆地棉内源ghcbf基因发生基因沉默，基因沉默陆地棉幼苗对低温的耐受能力与对照相比显著降低。发明人将该基因命名为ghcbf基因。

针对棉花ghcbf基因，发明人进行了如下研究：

ghcbf基因的克隆：可以采用rt-pcr扩增法、race-pcr或探针法等多种方法来获得ghcbf基因核苷酸全长序列或其部分片段。比如，基于其他物种cbf基因保守序列设计多核苷酸引物使用race-pcr方法直接从cdna或基因组中扩增出序列，将扩增得到的cdna序列连接至克隆载体并测序，得到正确的ghcbf基因。

病毒诱导的基因沉默(virus-inducedgenesilencing，vigs)是通过特异性核酸序列抑制目的基因的表达。当病毒载体携带目的基因片段进入植物体内目的基因的mrna就会被降解，植物就会表现出功能缺失症状，从而便于研究和了解基因的功能。

本发明所得重组载体可作基因工程资源用于科研、农业、商业领域，进行辅助其他基因资源发掘或培育优良农艺性状的农作物新品种。

本发明的ghcbf基因可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。本发明的dna可以是单链的或是双链的，dna可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与seqidno.1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。

如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有seqidno.2的蛋白质，但与seqidno.1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码seqidno.2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如pcr)以确定和/或分离编码棉纤维/植物细胞长度相关多肽的多聚核苷酸。

ghcbf基因编码的多肽

如本文所用，术语“ghcbf多肽”、“ghcbf蛋白”、“本发明蛋白”、“ghcbf基因编码的蛋白”可以互换使用，都是指本发明的具有提高植物抗逆性，尤其是对低温耐受力的蛋白。

在一优选例中，本发明蛋白来源于棉花(如陆地棉)。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括ghcbf多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然ghcbf多肽相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在优选例中，本发明多肽指具有调控棉纤维/植物细胞长度功能的seqidno.2序列的多肽。还包括具有与ghcbf多肽相同功能的、seqidno.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在c末端和/或n末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括ghcbf多肽的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与ghcbf多肽的dna杂交的dna所编码的蛋白、以及利用抗ghcbf多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含ghcbf多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了ghcbf多肽的可溶性片段。通常，该片段具有ghcbf多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

本发明还提供ghcbf多肽或其类似物。这些类似物与天然ghcbf多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然l-氨基酸的残基(如d-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“ghcbf多肽保守性变异多肽”指与seqidno.2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能，在c末端和/或\末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。这些保守性变异多肽最好根据下表进行氨基酸替换而产生。

棉花

棉花是锦葵目(malvales)锦葵科(malvaceae)棉属(gossypium)植物的种子纤维，原产于亚热带。植株灌木状，在热带地区栽培可长到6米高，一般为1到2米。花朵乳白色，开花后不久转成深红色然后凋谢，留下绿色小型的蒴果，称为棉铃。棉铃内有棉籽，棉籽上的茸毛从棉籽表皮长出，塞满棉铃内部。

陆地棉(gossypiumhirsutuml.)因最早在美洲大陆种植而得名，是世界上最重要的棉花栽培品种，占全球棉花种植面积的90％以上。陆地棉为异源四倍体，包括两个亚基因组，a亚组和d亚组。

重组技术和植物改良

本发明基因的全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于pcr扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cdna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次pcr扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的dna序列。然后可将该dna序列引入本领域中已知的各种现有的dna分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或本发明多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组dna技术(science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的本发明多肽。一般来说有以下步骤：

(1)用本发明的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明多核苷酸和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。所述的dna序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mrna合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(gfp)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当dna序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞(如农作物和林业植物的细胞)。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是dna的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组dna转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收dna的感受态细胞可在指数生长期后收获，用cacl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用mgcl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的dna转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得对低温胁迫性状发生变化的植物。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超滤处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的本发明多肽有多方面的用途。例如用于筛选具有提高植物对低温耐受能力的化合物、多肽或其它配体。用表达的重组本发明多肽的筛选多肽库可用于寻找有价值的能提高植物对低温耐受能力的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对本发明多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段、或嵌合抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的本发明多肽的基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。本发明的各类抗体可以利用棉纤维长度相关基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与棉纤维长度相关基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如e.coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。本发明多肽的抗体可用于检测样品中的相关多肽。

本发明还涉及定量和定位检测光信号途径相关多肽水平的测试方法。这些试验是本领域所熟知的。试验中所检测的耐逆相关多肽水平，可用于解释提高植物对低温耐受能力的功能。

一种检测样品中是否存在耐逆相关多肽的方法是利用本发明多肽的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与本发明多肽特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在相关多肽。

本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或dna芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析。用本发明多肽特异的引物进行rna-聚合酶链反应(rt-pcr)体外扩增也可检测本发明多肽的转录产物。

vigs技术

病毒诱导的基因沉默(virus-inducedgenesilencing，vigs)属于转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing，ptgs)。vigs也称反向遗传学技术是通过重组病毒来沉默植物内源基因。vigs是利用病毒携带目标基因片段侵染植物，诱导植物内源基因沉默，使植物表型发生变化的现象。

vigs的基本原理:vigs启动时连接在病毒载体上的目的基因片段先由rna引导的rna聚合酶合成大量双链rna(doublestrandedrna,dsrna)。当dsrna在植物体内大量积累就会被类似于rnase-ⅲ酶的dicer酶识别并降解成近21～24nt的小分子rna(smallinterferingrna,sirna)。sirna以单链形式与argonaute(ago)蛋白以及其他rna结合形成rna诱导的沉默复合体(rnainducedsilencingcomplex,risc)。risc对目标mrna具有识别和切割作用，能够与同源的目标mrna特异结合，从而将这些目标mrna降解,最终达到基因沉默的效果。vigs技术是近年来研究植物基因功能的重要方法，与其他鉴定基因功能的分析方法相比，vigs技术具有简单、快速、高通量、不受遗传背景影响等优点。

在本发明中，将vigs技术体系在高通量研究棉花基因功能，特别是快速验证表型明显，作用大的重要质量性状基因如与棉花生长发育、抗逆等密切相关基因以及关键代谢通路基因功能方面得到广泛应用。

本发明多肽及其编码序列的应用

本发明提供了耐逆相关多肽及其编码序列的用途，用于提高植物的抗逆性，尤其是对低温耐受能力。在本发明中，所述的耐逆相关多肽及其编码序列还可用于制备提高植物抗逆性，尤其是对低温耐受能力的组合物。本发明还涉及耐逆相关多肽及其编码序列的拮抗剂(或抑制剂)的用途。

任何可降低ghcbf蛋白的活性、降低ghcbf蛋白的表达的物质可用于本发明，作为ghcbf的抑制剂。在得知了靶序列后，制备干扰特定基因表达的干扰分子的方法是本领域人员熟知的。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明首次筛到一种耐逆相关蛋白及其编码基因。

(b)本发明首次发现，提高耐逆相关蛋白ghcbf的表达或活性，可显著提高植物(如棉属植物)的抗逆性，尤其是对低温的耐受力。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

如无特别说明，则实施例中的试剂和材料均为市售产品。

实施例1较佳低温胁迫条件的评估

将在26℃16hrlight/8hdark光周期下生长3周已发育2-3片真叶的棉苗分别在22℃、18℃、16℃、12℃、10℃及4℃进行处理72h，再移至26℃处理一周，统计幼苗存活率。随着温度的降低，棉苗的存活率逐渐下降。22℃、18℃、16℃、处理后的存活率差异不显著，但是12℃、10℃及4℃处理72小时后，棉苗萎蔫，棉叶开始出现皱缩脱水的现象，转至26℃恢复正常生长一周后，存活率较22℃、18℃、16℃显著降低。考虑到在今后的研究中能够更好的分辨不同棉花材料间的耐低温差异，采用22℃、18℃、16℃、及4℃低温胁迫可能会造成低温胁迫后表型分析差异不明显，因此，采用12-10℃作为棉苗低温胁迫的温度较为合适(如图1)。

实施例2基因沉默目的片段的克隆及序列鉴定

根据陆地棉ghcbf基因序列，选取保守区域其中一段500bp的序列设计引物，并在正向引物5’端引入ecorⅰ酶切位点，反向引物5’端引入kpnⅰ酶切位点，引物序列如下：

ghcbfvi-f：5`-ggaattcttgattctgggtcggtttct-3`(seqidno.:3)(下划线部分为ecorⅰ酶切位点)，ghcbfvi-r：5`-ggggtacccctttctccatctccgtgttt-3`(seqidno.:4)(下划线部分为kpnⅰ酶切位点)。用已构建好的ghcbf克隆质粒为模板，pcr扩增vigs片段。pcr反应体系为50μl：质粒1μl，引物各1μl，2×primstarpcrmix(大连宝生物)25μl，加ddh2o补至50μl。扩增程序：98℃预变性1min；98℃15s，56℃15s，72℃30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。pcr产物经琼脂糖凝胶电泳观察后用dna凝胶回收试剂盒回收目标片段。将目标片段连接至peasyblunt可隆载体上，转化dh5α菌株，根据质粒上携带的抗生素进行筛选阳性克隆并测序。

实施例3低温诱导的基因表达分析

待棉苗生长至3周苗龄时，将棉苗转移至10℃低温植物培养箱进行低温处理。以低温处理前的样品为对照，分别在处理3h、6h、12h、24h及48h时采样，经过总rna提取、cdna合成及实时荧光定量pcr等步骤，对候选基因受低温诱导时的基因表达情况进行分析。ghcbf基因响应低温诱导，基因表达发生不同程度的变化(图2)。ghcbf基因随着低温诱导时间的增加，在最初诱导的6小时内其表达水平逐渐增加至较高的水平，但是随着低温诱导时间的增加，其转录水平开始逐渐下调，但其表达水平仍高于对照。

实施例3目的基因的vigs载体构建

测序结果完全正确的克隆质粒用限制性内切酶ecori和kpni双酶切，与同样经过ecori和kpni酶切的pyl156载体连接，转化dh5α菌株，根据质粒上携带的抗生素进行筛选，阳性克隆用限制性内切酶ecori和kpni双酶切鉴定，重组质粒命名为trv:ghcbf。鉴定后的重组质粒冻融法转化农杆菌菌株gv3101。

实施例4利用vigs技术创制ghcbf基因沉默的陆地棉植株

(1)、接种前三天，将用甘油冷冻保存的农杆菌trv:rna1、trv:pyl156空载体、trv:ghcla1及trv:ghcbf在含有50μg/ml卡那霉素和25μg/ml庆大霉素的lb固体培养基上划线。将平板置于28℃下培养24小时。(2)、vigs侵染前两天，在每个平板上挑选单菌落接种于含有50μg/ml卡那霉素和25μg/ml庆大霉素的lb液体培养基中，置于28℃、50rpm摇床过夜培养。(3)、将含有目的载体的农杆菌在含有50μg/ml卡那霉素，25μg/ml庆大霉素，10mmems，20μm乙酰丁香酮的50mllb培养基中过夜培养，28℃、50rpm。(4)、第二天，4000rpm离心5分钟收集农杆菌细胞，弃上清，将沉淀悬浮于含有10mmmgcl2，10mmmes,200μm乙酰丁香酮的液体中，调整od600至1.5。(5)、在室温放置3小时。(6)、将trv:rna1分别和trv:pyl156空载体、trv:ghcla1及trv:ghcbf的菌悬液按照1:1的比例混合，用针头在棉花子叶下方刺破一至两个小洞，去掉针头，用注射器将菌液渗透至棉花子叶。(7)、将注射后的棉花在室温避光环境下培养过夜。(8)、将棉花转移至23℃，120μem^-2s^-1光强度的培养室，以12h光照,12h黑暗为周期。(9)、渗透7-8天后，以trv:ghcla1注射的棉花真叶表型开始出现白化现象作为参照，trv:pyl156空载体注射的棉花作为阴性对照(ck)。(10)取对照与基因沉默植株叶片，trizol法提取总rna，进行mrna转录水平的表达分析，结果如图3a所示,trv:ghcbf基因沉默植株中ghcbf基因的转录水平下降明显，表明ghcbf基因的表达收到抑制。以trv:pyl156空载体与trv:rna1共侵染的棉花作为阴性对照(ck)，观察trv:ghcbf干涉后的棉花在低温条件下(10℃)生长表型与阴性对照之间的差异，结果如图3a，3b所示，棉花中的ghcbf基因受到病毒诱导发生沉默后，在低温胁迫条件下，发生基因沉默的棉花与对照相比，表现出对低温敏感的表型，存活率低于对照。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>新疆农业科学院核技术生物技术研究所（新疆维吾尔自治区生物技术研究中心）

<120>棉花耐逆基因ghcbf及其编码蛋白和应用

<130>p2019-0856

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>624

<212>dna

<213>陆地棉(gossypiumhirsutum)

<400>1

atggttgattctgggtcggtttctgaaagtggaactgatcgtccggtgaatttttccgat60

gaatatgtgatgttagcttcgagttatccaaagaggcgagctgggaggaagaagttccgg120

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<210>2

<211>207

<212>prt

<213>陆地棉(gossypiumhirsutum)

<400>2

metvalaspserglyservalsergluserglythraspargproval

151015

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195200205

<210>3

<211>27

<212>dna

<213>人工序列()

<400>3

ggaattcttgattctgggtcggtttct27

<210>4

<211>29

<212>dna

<213>人工序列()

<400>4

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