一种灰树花CRISPR-Cas9基因编辑系统、方法及应用与流程

本发明涉及一种灰树花crispr-cas9基因编辑系统、方法及其应用，具体涉及一种无抗生素选择标记的易用型crispr/cas9系统灰树花基因编辑技术及其应用，属于食用真菌遗传育种
技术领域：
。技术背景食用菌是人类可食用的大型真菌，常见的有灵芝、香菇、草菇、双孢蘑菇、平菇、木耳、银耳、金针菇、猴头菇等。食用菌含有丰富的多糖，蛋白，甾醇，黄酮，酚类等营养成分，具有免疫增强、降血糖、抗肿瘤、抗氧化等活性。但食用真菌功能成分的生物合成途径和相关合成基因的功能不明，限制了其在菌体内的过量合成，进而影响了其规模化生产和市场的需求。因此，开展食用菌功能成分的生物合成途径分析，阐明其合成途径中的关键酶系及其功能，有目的地改造食用菌的基因组，培育高产功能活性成分的食用真菌新品种，是根本上解决食用菌功能成分产量低等难题的主要策略。近年来，灵芝、灰树花和猴头菇等食药用真菌已完成其全基因组测序，大量未知功能的基因亟待通过正/反向遗传学方法进行预测和注释。尽管已有的研究采用目的基因的异源表达纯化和体外酶活鉴定来研究基因的功能，或者过表达、rnai进行体内功能验证，但相对于原核生物，食用真菌作为多细胞的高等真核微生物，其基因组较大、遗传背景复杂、基因敲除率低等，导致基因过表达或沉默的食用真菌转化子性状差异显著，并且存在较多假阳性。基因敲除是研究基因功能最直接、最有效的方法，但其在食用真菌领域应用还不成熟，特别是由于同源重组等效率极为低下，鲜有成功案例的报道。因此，开发一种高效、简便的食用菌遗传操作系统，仍是当前亟待突破的核心技术之一。crispr/cas9(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/associatedprotein9)技术是当前研究最热门的基因编辑技术，其主要通过cas9蛋白在grna(guiderna)的引导下特异性地对靶位点进行切割，然后借助细胞的自我修复机制(nhej和hr)，在修复过程中会发生碱基的随机插入、丢失、点突变等，使目的基因功能丧失，从而实现目的基因敲除。然而，从已有的文献可知，目前食药用真菌crispr/cas9系统仍存在的技术问题主要为：(1)食用真菌中表达载体型crispr/cas9系统中cas9基因表达和sgrna转录效率极低，真正进入细胞核且发挥作用的cas9和sgrna量极少，导致目的基因编辑成功率不高；(2)对于每一个目标基因的敲除，均需要引入特定的选择标记，会存在可用选择标记有限、引入抗生素标记而产生生物安全隐患等等一些问题。因此，开发一种操作便捷、编辑效率高、生物安全性高的食用真菌基因编辑系统，将为食药用真菌的分子育种、多基因功能研究和高通量基因筛选等领域的研究提供坚实的技术支持和保障。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种易用型crispr/cas9基因编辑系统及其高效编辑食用真菌灰树花基因组中目的基因的方法。为达到上述目的，本发明公开一种灰树花crispr/cas9基因编辑系统，所述基因编辑系统包括重组gfcas9蛋白和针对目标基因片段的一个或多个sgrna；所述目标基因片段为灰树花基因组上任一片段。所述的重组gfcas9蛋白是异源表达后纯化制得。具体的，本发明以酿脓链球菌来源的cas9基因序列(seq.idno.1)为模板，在cas9的n端或者c端加上核定位序列sv40nls后，重组合成cas9基因序列(seqidno.2)，，并构建cas9蛋白的表达质粒pet30a-cas9-n-nls或pet30a-cas9-c-nls分别转化大肠杆菌e.colibl21，经iptg诱导表达，经纯化后制得重组gfcas9蛋白(gfcas9-n-nls和gfcas9-c-nls)。其中，所述的重组gfcas9蛋白的表达与纯化过程包括gfcas9蛋白经iptg诱导表达、镍柱纯化、sumo酶切去除his、透析、离子交换等纯化过程。所述sgrna的制备方法包括：根据目标dna片段，设计pcr扩增引物，在正向引物引入t7启动子序列，pcr产物纯化回收后进行grna的体外转录反应，获得用于编辑目的dna片段的sgrna；然后在得到的sgrna的3'端和5'端分别进行硫代和甲氧基修饰，获得最终所需的sgrna。所述目标基因优选为编码乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶的ura3基因片段或编码葡聚糖合成酶的gfgls基因片段。进一步的，根据本发明的一个实施例，所述的sgrna，是使用人工合成grna的方法，合成打靶同源片段序列(编码乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶的基因ura3)，使用正向引物：5'-taatacgactataggtcagcgcaagagcaaggag-3'(seqidno.3)和反向引物：5'-ttctagctctaaaacctccttgctcttgcgctg-3'(seqidno.4)扩增获得目标片段t7-ura3target-grnascaffold，其中通过正向引物引入t7启动子(seqidno.3中粗体下划线标出序列)。或使用人工合成grna的方法，合成打靶同源片段序列(编码葡聚糖合成酶的基因gfgls)，使用正向引物：5'-taatacgactatagtcagcgcggagaacagacga-3'(seqidno.6)和反向引物：5'-ttctagctctaaaactcgtctgttctccgcgct-3'(seqidno.7)扩增获得目标片段t7-gfglstarget-grnascaffold，其中通过正向引物引入t7启动子(seqidno.6中粗体下划线标出序列)。使用pcr产物纯化回收后作为转录模板，进行grna的体外转录反应，分别获得用于编辑ura3的sgrna片段ura3-sgrna(seqidno.5)和用于编辑gfgls的sgrna片段gfgls-sgrna(seqidno.8)。另外，上述体外转录sgrna也可通过商业公司按要求进行化学合成，同时，为增加sgrna在原生质体内的稳定性，在ura3-sgrna和gfgls-sgrna序列的3'端和5'端分别进行3个硫代和甲氧基修饰，修饰后的序列分别为seqidno.9和seqidno.10。同时本发明还提供灰树花基因编辑的方法，具体的，包括：将重组gfcas9蛋白和修饰的sgrna转入灰树花原生质体，对灰树花基因组上的目的基因进行编辑，将编辑后的目的基因进行pcr扩增，验证编辑效果，实现目的基因的编辑。所述的基因的编辑包括：碱基缺失、敲除或删除、插入等。进一步的，本发明将重组表达的gfcas9蛋白和修饰的ura3-sgrna或gfgls-sgrna转入灰树花原生质体，以编码乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶的ura3基因为反向筛选标记(5-氟乳清酸/5-foa筛选)或以灰树花菌体生长性状为筛选标记，对灰树花基因组上的目的基因(如编码乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶的ura3，编码葡聚糖合成酶的gfgls等)进行基因编辑，将编辑后的目的基因进行pcr扩增，验证编辑效果。其中，所述的灰树花原生质体，是通过将培养的灰树花菌丝体经0.3-0.6m甘露醇溶液洗涤后，加入0.5-4.0％溶壁酶在25-45℃条件下酶解1-5h，离心收集酶解后的不溶物，经过滤获得。所述转入灰树花原生质体的重组cas9蛋白和修饰的sgrna的摩尔用量为1:1-5；具体的是将cas9蛋白和sgrna预混后，经冰上预冷1h后，加入1×107-1×108个/ml灰树花原生质体溶液中，经电击转化法或peg转化法，将cas9蛋白和sgrna转入原生质体内。所述反向筛选标记为5-foa，具体是通过配制含有浓度为100-500μg/ml5-foa的选择性再生cym培养基平板，将cas9蛋白和ura3-sgrna预混，在冰上静止1h后加入灰树花原生质体，经peg介导转化后，涂布在再生平板上，28℃培养筛选获得ura3基因敲除的转化子。所述灰树花菌体生长性状为筛选标记，具体是将转入cas9蛋白和gfgls-sgrna的灰树花原生质体涂布在选择性再生cym培养基平板上，28℃培养，依据菌丝生长速度和菌体形态等筛选获得gfgls基因被编辑的转化子。所述目的基因的功能丧失，是通过将筛选的转化子，接种到液体cym培养基中培养5-7天，收集菌体，提取基因组，分别采用引物ura3-f/r(seqidno.11和seqidno.12)、gfgls-f/r(seqidno.13和seqidno.14)对出发菌株和转化子中基因ura3、gfgls进行pcr扩增，切胶回收测序，对比各基因序列，判断其是通过碱基删除或插入实现其功能丧失。另外，本发明还提供一种目的基因功能丧失的灰树花基因编辑系列菌株。本发明还提供灰树花crispr/cas9基因编辑系统的应用，包括基因敲除、碱基缺失、删除、插入、定点碱基改变、定点插入等。本发明的基因编辑方法无需引入特定的抗生素选择标记，操作简单方便，目的基因编辑效率高，为编辑食用真菌灰树花基因组上的目的基因提供了生物安全性高的解决策略。本发明的有益效果：本发明首次依据食用真菌灰树花目的基因序列的特性，分别采用重组表达cas9蛋白和体外转录/合成sgrna，通过电转或peg介导转化法直接将其转入灰树花原生质体内，实现目的基因的高效编辑。经基因编辑ura3的灰树花重组菌，可耐受200μg/ml以上浓度的5-foa；经基因编辑gfgls的灰树花重组菌，菌体生长显著降低，菌丝明显变细，菌体内葡聚糖含量下降90％以上，同时，经对比所测序列发现，本发明提供的crispr/cas9的基因编辑方法，是通过在靶向位点产生双链断链，并经由非同源末端连接(nhej)的方式修复切口而发生基因删除或插入，最终实现目的基因的功能丧失。本发明提供的易用型crispr/cas9的基因编辑方法无需引入特定的抗生素选择标记，无质粒残留，生物安全性高，且实验操作简单方便，目的基因编辑效率高，为编辑食用真菌灰树花基因组上的目的基因提供行之有效的解决策略和途径。附图说明图1为重组gfcas9蛋白表达质粒pet30a-cas9-n-nls质粒图谱示意图。图2为重组gfcas9蛋白表达质粒pet30a-cas9-c-nls质粒图谱示意图。图3为灰树花基因未编辑的出发菌株对5-foa的耐受考察结果。图4为灰树花ura3基因编辑后得到的重组菌在含有200μg/ml5-foa培养基上生长情况。图5为灰树花ura3基因未编辑(wt)和编辑后得到的部分基因序列；其中wt：灰树花出发菌株ura3基因部分序列，wt中下划线部分为ura3基因编辑的靶向序列；a-d：靶向序列被编辑后转化子的ura3基因序列，其中下划线部分为插入序列、“-”表示缺失的序列。图6为灰树花gfgls基因未编辑的出发菌株(wt)和编辑后得到的重组菌生长情况。图7为灰树花gfgls基因未编辑(wt)和编辑后得到的部分基因序列；其中wt：灰树花出发菌株gfgls基因部分序列，wt中下划线部分为gfgls基因编辑的靶向序列；a-e：靶向序列被编辑后得到的转化子中gfgls基因序列，其中下划线部分为插入序列、“-”表示缺失的序列。具体实施方式以下结合实例与附图对本发明的具体实施作进一步的说明，以下实施例中使用的质粒、pcr试剂、培养基等采用商业产品，具体操作按照说明书进行。但本发明的实施方式不限于此，其他未注明的实验操作和工艺参数按照常规技术进行。实施例1:重组cas9的质粒构建、表达和制备以酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)来源的cas9基因序列(genebank登录号:46806597)(seqidno.1)为模板，在其n-端或者c-端加上核定位序列sv40nls后，委托商业公司合成gfcas9基因序列(seqidno.2所示下划线位置为核定位序列sv40nls插入位置，在n-端或者c-端均可)，并与pet30a载体构建cas9蛋白的表达质粒pet30a-cas9-n-nls或pet30a-cas9-c-nls，2个质粒的图谱如图1和图2所示)。培养e.colibl21，制备感受态细胞，并电击转化质粒pet30a-cas9-n-nls或pet30a-cas9-c-nls进入该菌株，经iptg诱导表达，利用his-tag亲和标签分离纯化制得用于灰树花基因编辑的两种gfcas9蛋白(gfcas9-n-nls和gfcas9-c-nls)，并用sds-page和westernblot验证所得蛋白的分子量。seqidno.1：源自酿脓链球菌的cas9基因序列atggataagaaatactcaataggcttagatatcggcacaaatagcgtcggatgggcggtgatcactgatgaatataaggttccgtctaaaaagttcaaggttctgggaaatacagaccgccacagtatcaaaaaaaatcttataggggctcttttatttgacagtggagagacagcggaagcgactcgtctcaaacggacagctcgtagaaggtatacacgtcggaagaatcgtatttgttatctacaggagattttttcaaatgagatggcgaaagtagatgatagtttctttcatcgacttgaagagtcttttttggtggaagaagacaagaagcatgaacgtcatcctatttttggaaatatagtagatgaagttgcttatcatgagaaatatccaactatctatcatctgcgaaaaaaattggtagattctactgataaagcggatttgcgcttaatctatttggccttagcgcatatgattaagtttcgtggtcattttttgattgagggagatttaaatcctgataatagtgatgtggacaaactatttatccagttggtacaaacctacaatcaattatttgaagaaaaccctattaacgcaagtggagtagatgctaaagcgattctttctgcacgattgagtaaatcaagacgattagaaaatctcattgctcagctccccggtgagaagaaaaatggcttatttgggaatctcattgctttgtcattgggtttgacccctaattttaaatcaaattttgatttggcagaagatgctaaattacagctttcaaaagatacttacgatgatgatttagataatttattggcgcaaattggagatcaatatgctgatttgtttttggcagctaagaatttatcagatgctattttactttcagatatcctaagagtaaatactgaaataactaaggctcccctatcagcttcaatgattaaacgctacgatgaacatcatcaagacttgactcttttaaaagctttagttcgacaacaacttccagaaaagtataaagaaatcttttttgatcaatcaaaaaacggatatgcaggttatattgatgggggagctagccaagaagaattttataaatttatcaaaccaattttagaaaaaatggatggtactgaggaattattggtgaaactaaatcgtgaagatttgctgcgcaagcaacggacctttgacaacggctctattccccatcaaattcacttgggtgagctgcatgctattttgagaagacaagaagacttttatccatttttaaaagacaatcgtgagaagattgaaaaaatcttgacttttcgaattccttattatgttggtccattggcgcgtggcaatagtcgttttgcatggatgactcggaagtctgaagaaacaattaccccatggaattttgaagaagttgtcgataaaggtgcttcagctcaatcatttattgaacgcatgacaaactttgataaaaatcttccaaatgaaaaagtactaccaaaacatagtttgctttatgagtattttacggtttataacgaattgacaaaggtcaaatatgttactgaaggaatgcgaaaaccagcatttctttcaggtgaacagaagaaagccattgttgatttactcttcaaaacaaatcgaaaagtaaccgttaagcaattaaaagaagattatttcaaaaaaatagaatgttttgatagtgttgaaatttcaggagttgaagatagatttaatgcttcattaggtacctaccatgatttgctaaaaattattaaagataaagattttttggataatgaagaaaatgaagatatcttagaggatattgttttaacattgaccttatttgaagatagggagatgattgaggaaagacttaaaacatatgctcacctctttgatgataaggtgatgaaacagcttaaacgtcgccgttatactggttggggacgtttgtctcgaaaattgattaatggtattagggataagcaatctggcaaaacaatattagattttttgaaatcagatggttttgccaatcgcaattttatgcagctgatccatgatgatagtttgacatttaaagaagacattcaaaaagcacaagtgtctggacaaggcgatagtttacatgaacatattgcaaatttagctggtagccctgctattaaaaaaggtattttacagactgtaaaagttgttgatgaattggtcaaagtaatggggcggcataagccagaaaatatcgttattgaaatggcacgtgaaaatcagacaactcaaaagggccagaaaaattcgcgagagcgtatgaaacgaatcgaagaaggtatcaaagaattaggaagtcagattcttaaagagcatcctgttgaaaatactcaattgcaaaatgaaaagctctatctctattatctccaaaatggaagagacatgtatgtggaccaagaattagatattaatcgtttaagtgattatgatgtcgatcacattgttccacaaagtttccttaaagacgattcaatagacaataaggtcttaacgcgttctgataaaaatcgtggtaaatcggataacgttccaagtgaagaagtagtcaaaaagatgaaaaactattggagacaacttctaaacgccaagttaatcactcaacgtaagtttgataatttaacgaaagctgaacgtggaggtttgagtgaacttgataaagctggttttatcaaacgccaattggttgaaactcgccaaatcactaagcatgtggcacaaattttggatagtcgcatgaatactaaatacgatgaaaatgataaacttattcgagaggttaaagtgattaccttaaaatctaaattagtttctgacttccgaaaagatttccaattctataaagtacgtgagattaacaattaccatcatgcccatgatgcgtatctaaatgccgtcgttggaactgctttgattaagaaatatccaaaacttgaatcggagtttgtctatggtgattataaagtttatgatgttcgtaaaatgattgctaagtctgagcaagaaataggcaaagcaaccgcaaaatatttcttttactctaatatcatgaacttcttcaaaacagaaattacacttgcaaatggagagattcgcaaacgccctctaatcgaaactaatggggaaactggagaaattgtctgggataaagggcgagattttgccacagtgcgcaaagtattgtccatgccccaagtcaatattgtcaagaaaacagaagtacagacaggcggattctccaaggagtcaattttaccaaaaagaaattcggacaagcttattgctcgtaaaaaagactgggatccaaaaaaatatggtggttttgatagtccaacggtagcttattcagtcctagtggttgctaaggtggaaaaagggaaatcgaagaagttaaaatccgttaaagagttactagggatcacaattatggaaagaagttcctttgaaaaaaatccgattgactttttagaagctaaaggatataaggaagttaaaaaagacttaatcattaaactacctaaatatagtctttttgagttagaaaacggtcgtaaacggatgctggctagtgccggagaattacaaaaaggaaatgagctggctctgccaagcaaatatgtgaattttttatatttagctagtcattatgaaaagttgaagggtagtccagaagataacgaacaaaaacaattgtttgtggagcagcataagcattatttagatgagattattgagcaaatcagtgaattttctaagcgtgttattttagcagatgccaatttagataaagttcttagtgcatataacaaacatagagacaaaccaatacgtgaacaagcagaaaatattattcatttatttacgttgacgaatcttggagctcccgctgcttttaaatattttgatacaacaattgatcgtaaacgatatacgtctacaaaagaagttttagatgccactcttatccatcaatccatcactggtctttatgaaacacgcattgatttgagtcagctaggaggtgactgaseqidno.2：用于灰树花基因编辑的gfcas9基因序列atggctcccaagaagaagaggaaggtgggcatccacggggtgccagctgctgataaaaaatactccattggtctcgacatcggcactaactccgtcggttgggctgtcatcaccgacgaatacaaagtgcctagcaagaagttcaaagtcctcggcaacaccgatcgtcactccatcaaaaaaaatctcattggcgctctgctgttcgacagcggtgagaccgccgaggctactcgtctgaagcgcactgcccgtcgccgctacactcgccgtaagaaccgtatttgttatctccaagagattttctccaacgagatggccaaggtcgatgattccttcttccatcgtctggaagagtcctttctcgtggaagaggataaaaagcacgaacgccacccgatctttggcaacattgtcgatgaagtggcttatcacgagaagtacccgaccatctaccatctccgtaagaagctggtggattccaccgacaaggctgatctccgcctcatttatctcgctctggctcatatgattaagttccgtggtcattttctgatcgaaggcgacctcaacccggacaactccgatgtcgataagctcttcatccagctggtccagacctacaaccaactcttcgaggagaacccgatcaatgcctccggcgtcgatgctaaggccattctgagcgctcgtctgtccaaaagccgtcgcctcgagaatctcatcgcccagctcccgggcgagaaaaaaaacggtctcttcggtaatctcatcgccctctcgctcggcctcaccccgaattttaaatccaatttcgacctcgccgaggacgctaagctccaactgtccaaggacacttacgacgacgatctggacaatctgctggctcaaatcggcgatcagtatgccgacctctttctcgccgccaaaaatctctccgatgctatcctcctctccgatatcctccgcgtcaatactgagatcaccaaggcccctctctccgcctccatgattaagcgctacgacgagcaccatcaagacctcactctgctcaaagccctcgtgcgccagcaactcccggagaagtataaggagatttttttcgatcagtccaagaacggttatgctggctacattgatggtggcgcctcccaagaggaattctataagttcatcaagccgattctcgagaagatggacggcactgaagagctgctcgtgaagctgaaccgtgaggacctcctccgtaagcagcgtactttcgataacggctccatcccgcatcaaattcacctcggcgagctgcatgctattctccgtcgccaagaggatttctatccgtttctcaaagataaccgcgagaagatcgagaagatcctcacctttcgtatcccgtattacgtgggtcctctcgcccgcggtaattcccgctttgcttggatgacccgcaagagcgaagaaaccatcaccccttggaacttcgaggaagtcgtcgacaaaggtgcttccgcccaatcctttatcgagcgtatgactaactttgacaagaacctccctaatgagaaagtgctcccgaaacacagcctcctctacgagtacttcaccgtgtataacgaactcactaaggtgaagtatgtcaccgaaggtatgcgtaaaccggccttcctctccggcgaacagaaaaaagctatcgtggacctcctcttcaaaaccaatcgcaaggtcaccgtgaagcaactgaaggaggattacttcaagaagattgagtgttttgacagcgtcgagatcagcggcgtggaagaccgctttaacgctagcctcggcacttaccacgatctgctcaaaattatcaaggataaggatttcctcgacaacgaggagaatgaggacatcctcgaggacatcgtgctcactctcactctcttcgaggaccgcgagatgattgaagagcgtctcaagacctacgcccacctcttcgacgacaaggtgatgaagcagctgaagcgccgtcgttacaccggctggggccgtctctcccgtaagctgatcaacggcattcgcgataagcagagcggcaaaaccatcctcgactttctcaaaagcgacggctttgctaatcgcaacttcatgcagctgatccacgatgactcgctcacctttaaggaggacatccaaaaggcccaagtgagcggccaaggcgattccctccacgaacacattgccaatctggccggcagcccggccatcaagaagggtattctccagactgtgaaagtcgtggatgagctggtcaaagtcatgggccgtcataagccggagaacatcgtcatcgagatggcccgtgagaatcaaactactcagaagggtcagaagaattcccgcgagcgtatgaagcgtatcgaggagggcattaaggagctcggctcccagattctcaaggagcatccggtcgaaaacacccagctccagaacgagaagctgtacctctactacctccagaacggtcgcgacatgtatgtggaccaagagctcgatatcaaccgcctcagcgactacgacgtcgaccacatcgtcccgcagtccttcctcaaggacgatagcattgacaataaagtgctcactcgttccgataagaaccgtggtaagagcgacaatgtgccgagcgaagaggtggtgaagaaaatgaagaattactggcgccaactcctcaatgccaagctcattacccagcgcaagttcgacaacctcaccaaagctgaacgcggtggcctctccgaactcgataaggctggcttcatcaaacgtcagctcgtggagactcgccagattactaagcacgtggctcagattctggactcccgcatgaatactaagtacgacgaaaatgacaagctcatccgcgaggtgaaggtcatcactctcaagagcaaactggtcagcgacttccgtaaggacttccagttctacaaagtccgtgaaatcaacaactaccatcatgcccatgacgcttatctcaatgccgtcgtcggcaccgctctgatcaaaaaatacccgaagctggaatccgagttcgtctacggcgattacaaagtctacgacgtgcgcaagatgatcgctaagtccgagcaagaaatcggcaaggctaccgccaagtacttcttctactccaacatcatgaactttttcaaaaccgagatcaccctcgctaatggcgaaatccgtaagcgtcctctcatcgagaccaatggcgagaccggcgaaatcgtgtgggataagggtcgcgactttgccactgtgcgtaaagtcctcagcatgccgcaagtcaacatcgtcaagaaaaccgaggtccagactggtggcttcagcaaagagagcatcctcccgaagcgtaactccgacaagctgatcgcccgtaagaaggattgggaccctaagaagtacggtggttttgactcccctaccgtggcttactccgtgctcgtggtcgccaaggtcgaaaagggcaagagcaagaagctcaagagcgtcaaagagctgctgggcatcaccatcatggaacgtagcagcttcgagaagaacccgatcgattttctcgaggccaagggttacaaggaggtcaaaaaggatctcatcattaagctcccgaagtactcgctcttcgaactggagaatggccgtaagcgcatgctcgcttccgctggtgaactccagaagggtaatgaactggctctcccgagcaagtacgtgaatttcctctatctcgccagccattacgagaaactgaagggtagcccggaggataacgagcagaagcagctcttcgtcgaacaacacaagcactatctcgacgagatcatcgagcaaattagcgagttcagcaaacgtgtcattctcgccgacgctaacctcgacaaggtgctgtccgcctataacaaacaccgtgacaagccgattcgcgagcaagccgaaaacatcattcacctctttactctcaccaacctcggcgccccggctgcttttaagtattttgataccaccatcgaccgcaaacgctacacctccactaaggaggtgctggatgctaccctcattcaccaatccatcactggtctctacgagacccgcattgatctctcccaactcggtggcgaccccaagaagaagaggaaggtgcatcaccaccaccatcactga实施例2:针对灰树花ura3或gfgls的基因片段设计和合成sgrna利用在线公开软件chopchop(http://chopchop.cbu.uib.no/)设计sgrna引导序列，分别选择分值较高且接近ura3、gfgls基因(不局限于这两个基因)起始密码子的引导序列，记为ura3-sgrna和gfgls-sgrna。使用人工合成grna的方法，合成打靶同源片段序列(编码乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶的基因ura3)，使用正向引物：5'-taatacgactataggtcagcgcaagagcaaggag-3'(seqidno.3)和反向引物：5'-ttctagctctaaaacctccttgctcttgcgctg-3'(seqidno.4)扩增获得目标片段t7-ura3target-grnascaffold，其中通过正向引物引入t7启动子(seqidno.3中粗体下划线标出序列)。或使用人工合成grna的方法，合成打靶同源片段序列(编码葡聚糖合成酶的基因gfgls)，使用正向引物：5'-taatacgactatagtcagcgcggagaacagacga-3'(seqidno.6)和反向引物：5'-ttctagctctaaaactcgtctgttctccgcgct-3'(seqidno.7)扩增获得目标片段t7-gfglstarget-grnascaffold，其中通过正向引物引入t7启动子(seqidno.6中粗体下划线标出序列)。使用pcr产物纯化回收后作为转录模板，进行grna的体外转录反应，分别获得用于编辑ura3的sgrna片段ura3-sgrna(seqidno.5)和用于编辑gfgls的sgrna片段gfgls-sgrna(seqidno.8)。seqidno.5：rgrurcrargrcrgrcrarargrargrcrarargrgrargrgrururururargrargrcrurargrarararurargrcrarargrururararararurarargrgrcrurargrurcrcrgrururarurcrararcrururgrararararargrurgrgrcrarcrcrgrargrurcrgrgrurgrcrurururuseqidno.8：rurcrargrcrgrcrurgrargrararcrargrarcrgragrururururargrargrcrurargrarararurargrcrarargrururararararurarargrgrcrurargrurcrcrgrururarurcrararcrururgrararararargrurgrgrcrarcrcrgrargrurcrgrgrurgrcrurururu所用的sgrna可以通过上述方法合成，也可以通过生物公司合成，为使引导序列转化进入胞内稳定，本实施例所选的ura3靶向片段的ura3-sgrna和gfgls靶向片段gfgls-sgrna序列均在3'端和5'端分别进行了3个硫代和甲氧基修饰，修饰后的序列如seqidno.9和seqidno.10所示，由商业公司化学合成。seqidno.9：mg*mu*mc*rargrcrgrcrarargrargrcrarargrgrargrgrururururargrargrcrurargrarararurargrcrarargrururararararurarargrgrcrurargrurcrcrgrururarurcrararcrururgrararararargrurgrgrcrarcrcrgrargrurcrgrgrurgrcru*mu*mu*museqidno.10：mu*mc*ma*grcrgrcrurgrargrararcrargrarcrgragrururururargrargrcrurargrarararurargrcrarargrururararararurarargrgrcrurargrurcrcrgrururarurcrararcrururgrararararargrurgrgrcrarcrcrgrargrurcrgrgrurgrcru*mu*mu*mu实施例3:灰树花原生质制备灰树花种子培养基(g/l)：葡萄糖20，蛋白胨5，kh2po41.5，mgso4·7h2o0.75，ph自然。将野生型灰树花gf02(购自美国模式培养物集存库，americantypeculturecollection，60301tm)在上述种子培养基中培养7d获得种子液，经8000rpm离心15min收集菌丝，0.6m甘露醇溶液洗涤菌丝体2次，再次离心去除液体。得到的湿菌丝用质量浓度为2％的溶解酶(1％的溶壁酶+1％丝状真菌破壁酶)30℃酶解3h，离心收集不溶物；用0.6m甘露醇溶液洗涤不溶物2次，过滤去除未酶解的菌丝，得到不完全酶解的原生质体，加入0.6m甘露醇溶液得到灰树花原生质体重悬液。实施例4:分析灰树花原生质体对5-foa的敏感性，确定筛选ura3基因敲除菌株最适浓度配制不同5-foa(5-氟乳清酸，0μg/ml，10μg/ml，60μg/ml，150μg/ml、200μg/ml和300μg/ml)浓度梯度的cym平板，接种实施例3制备得到的灰树花原生质体(1×108个/ml)，将平板在28℃下进行培养，记录菌体的生长情况。如图3所示，5-foa抑制灰树花原生质体生长的最低浓度为200μg/ml。实施例5:crispr/cas9系统编辑灰树花ura3基因将实施例1中得到的重组gfcas9蛋白和实施例2中得到的经修饰的ura3-sgrna按比例1:3(mol/mol)预混后，经冰上预冷30min后，加入1×108个/ml灰树花原生质体溶液中，经peg转化法，将gfcas9蛋白和sgrna转入原生质体内后，倒入选择性再生cym培养基+5-氟乳清酸(5-foa200μg/ml)的抗性平板上，28℃条件培养。如图4所示，在含有200μg/ml5-foa的抗性平板上长出4株ura3基因被编辑的转化子(画圈内的位置)；各转化子可在5-foa抗性平板上快速生长。将5-foa抗性平板上的各转化子接种至实施例3的种子培养基中培养5天，收集菌体，提取基因组dna，根据灰树花ura3的基因序列设计引物ura3-f/r(seqidno.11和seqidno.12)，用于克隆包含ura3基因编辑位点在内的200-300bp的序列，pcr产物切胶回收后由商业公司测序。ura3-f(seqidno.11):atggcttatcgttagcaacaccura3-r(seqidno.12):gcgatgagtgggatggat对比灰树花野生型菌株和转化子中ura3基因序列，如图5所示，转化子a中插入了90bp碱基序列，转化子b中插入了32bp碱基序列，转化子c中插入了83bp碱基序列，而转化子d缺失了3bp的碱基序列。同时3株菌株中都是在靶向序列pam5’端2-5bp处发生了基因插入或者基因缺失。这样的结果的出现说明了突变菌株在grna的作用下在靶向位点产生了双链断链，从而使得灰树花菌株通过nhej(非同源重组连接途径)的方式修复切口而发生基因插入的现象。实施例6:crispr/cas9系统编辑灰树花gfgls基因本实施例是以灰树花菌体生长和葡聚糖合成关键酶gfgls为例，以说明本发明提供的crispr/cas9基因编辑系统在编辑灰树花目的基因的实施方式。但本发明所主张的crispr/cas9基因编辑技术可以实施目的基因不限于此。根据灰树花葡聚糖合成酶gfgls基因序列(数据库登录号为mk808019)，选择该基因的3156-3388bp(位于葡聚糖合成酶的催化结构域)为靶向序列，利用在线公开软件设计其sgrna引导序列，由商业公司直接合成gfgls靶向片段的gfgls-sgrna引导序列seqidno.10。将实施例1中的重组gfcas9蛋白和实施例2中得到的经修饰的gfgls-sgrna按比例1:3(mol/mol)预混后，经冰上预冷30min后，加入5×107个/ml灰树花原生质体溶液中，经peg转化将gfcas9蛋白和gfgls-sgrna转入原生质体内后，倒入选择性再生cym培养平板上，28℃条件培养获得潜在的gfgls基因敲除的转化子。如图6所示，为灰树花葡聚糖合成酶基因gfgls编辑前(wt)和编辑后得到的转化子生长情况。图中可见，经编辑后的转化子菌株其再生能力和生长速度明显变缓，菌丝纤细柔嫩，部分菌丝呈透明状，生长速率显著下降，表明对葡聚糖合成酶基因编辑影响了灰树花菌丝细胞形态和菌体生长。将上述各转化子接种至实施例3的种子培养基中培养5天，收集菌体，提取基因组dna，根据灰树花gfgls基因的序列设计引物gfgls-f/r(seqidno.13和seqidno.14)，用于克隆gfgls基因编辑位点在内的200-300bp的序列，pcr产物切胶回收后送商业公司测序验证。测序结果表明有5个转化子的gfgls基因被编辑。gfgls(seqidno.13):acaagagaacgccgaatttctagfgls(seqidno.14):tgatagcgtgattctggttgtc如图7所示，与灰树花野生型菌株的gfgls基因序列比较，转化子a插入了46bp碱基序列；转化子b插入了98bp碱基序列；c转化子插入了107bp碱基序列，而转化子d和e分别缺失了2bp和1bp的碱基。表明突变菌株在sgrna的作用下在靶向位点产生了双链断链，部分出现了基因序列删除，进而通过nhej的方式修复切口而发生基因插入。测定收集的菌丝中的葡聚糖含量，按1:10(w/v)加水在90℃条件提取2h，10000g离心收集上清液，浓缩后使用95％乙醇按体积比1:3沉淀；10000g离心收集醇沉物，经50℃真空干燥至恒重。称取50mg粗提取物，加入72％h2so4完全水解；进而加入1mg内标物肌醇、10mg盐酸羟胺及1.0ml吡啶，90℃水浴30min后，冷却至室温，加入1.0ml乙酸酐，90℃继续水浴30min，得到乙酰化衍生物，0.22μm微孔滤膜过滤后进入gc分析(美国agilent公司7890a气相色谱仪，毛细管色谱柱，fid检测器。进样口温度280℃，检测器温度300℃，柱温箱起始温度130℃，保持5min，4℃/min到240℃，保持5min，分流比40：1，进样量1μl)。根据保留时间和内标法计算粗提物中葡萄糖含量，计算葡聚糖得率。x为β-d-葡聚糖含量(％)；c为gc测定样品中葡萄糖的质量浓度(g/ml)；v为样品水解液的定容体积(v)；m为菌丝体的质量(g)；0.9为葡萄糖换算成葡聚糖的系数。由表1可以看出，经crispr/cas9系统编辑灰树花gfgls基因后，转化子中的葡聚糖含量显著下降至6％以内，表明葡聚糖合成酶的功能失活。同时也提示，灰树花还可能有其它编码葡聚糖合成酶的基因或同工酶用于合成葡聚糖。表1：crispr/cas9系统编辑灰树花gfgls基因对葡聚糖含量的影响灰树花菌株基因编辑类型葡聚糖含量(％)wt/15.6±3.7转化子a插入46bp序列1.2±0.7转化子b插入98bp序列3.4±0.5转化子c插入107bp序列2.8±0.6转化子d缺失2bp序列2.4±0.5转化子e缺失1bp序列4.8±0.6序列表<110>江苏大学<120>一种灰树花crispr-cas9基因编辑系统、方法及应用<160>10<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>4107<212>dna<213>酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)<400>1atggataagaaatactcaataggcttagatatcggcacaaatagcgtcggatgggcggtg60atcactgatgaatataaggttccgtctaaaaagttcaaggttctgggaaatacagaccgc120cacagtatcaaaaaaaatcttataggggctcttttatttgacagtggagagacagcggaa180gcgactcgtctcaaacggacagctcgtagaaggtatacacgtcggaagaatcgtatttgt240tatctacaggagattttttcaaatgagatggcgaaagtagatgatagtttctttcatcga300cttgaagagtcttttttggtggaagaagacaagaagcatgaacgtcatcctatttttgga360aatatagtagatgaagttgcttatcatgagaaatatccaactatctatcatctgcgaaaa420aaattggtagattctactgataaagcggatttgcgcttaatctatttggccttagcgcat480atgattaagtttcgtggtcattttttgattgagggagatttaaatcctgataatagtgat540gtggacaaactatttatccagttggtacaaacctacaatcaattatttgaagaaaaccct600attaacgcaagtggagtagatgctaaagcgattctttctgcacgattgagtaaatcaaga660cgattagaaaatctcattgctcagctccccggtgagaagaaaaatggcttatttgggaat720ctcattgctttgtcattgggtttgacccctaattttaaatcaaattttgatttggcagaa780gatgctaaattacagctttcaaaagatacttacgatgatgatttagataatttattggcg840caaattggagatcaatatgctgatttgtttttggcagctaagaatttatcagatgctatt900ttactttcagatatcctaagagtaaatactgaaataactaaggctcccctatcagcttca960atgattaaacgctacgatgaacatcatcaagacttgactcttttaaaagctttagttcga1020caacaacttccagaaaagtataaagaaatcttttttgatcaatcaaaaaacggatatgca1080ggttatattgatgggggagctagccaagaagaattttataaatttatcaaaccaatttta1140gaaaaaatggatggtactgaggaattattggtgaaactaaatcgtgaagatttgctgcgc1200aagcaacggacctttgacaacggctctattccccatcaaattcacttgggtgagctgcat1260gctattttgagaagacaagaagacttttatccatttttaaaagacaatcgtgagaagatt1320gaaaaaatcttgacttttcgaattccttattatgttggtccattggcgcgtggcaatagt1380cgttttgcatggatgactcggaagtctgaagaaacaattaccccatggaattttgaagaa1440gttgtcgataaaggtgcttcagctcaatcatttattgaacgcatgacaaactttgataaa1500aatcttccaaatgaaaaagtactaccaaaacatagtttgctttatgagtattttacggtt1560tataacgaattgacaaaggtcaaatatgttactgaaggaatgcgaaaaccagcatttctt1620tcaggtgaacagaagaaagccattgttgatttactcttcaaaacaaatcgaaaagtaacc1680gttaagcaattaaaagaagattatttcaaaaaaatagaatgttttgatagtgttgaaatt1740tcaggagttgaagatagatttaatgcttcattaggtacctaccatgatttgctaaaaatt1800attaaagataaagattttttggataatgaagaaaatgaagatatcttagaggatattgtt1860ttaacattgaccttatttgaagatagggagatgattgaggaaagacttaaaacatatgct1920cacctctttgatgataaggtgatgaaacagcttaaacgtcgccgttatactggttgggga1980cgtttgtctcgaaaattgattaatggtattagggataagcaatctggcaaaacaatatta2040gattttttgaaatcagatggttttgccaatcgcaattttatgcagctgatccatgatgat2100agtttgacatttaaagaagacattcaaaaagcacaagtgtctggacaaggcgatagttta2160catgaacatattgcaaatttagctggtagccctgctattaaaaaaggtattttacagact2220gtaaaagttgttgatgaattggtcaaagtaatggggcggcataagccagaaaatatcgtt2280attgaaatggcacgtgaaaatcagacaactcaaaagggccagaaaaattcgcgagagcgt2340atgaaacgaatcgaagaaggtatcaaagaattaggaagtcagattcttaaagagcatcct2400gttgaaaatactcaattgcaaaatgaaaagctctatctctattatctccaaaatggaaga2460gacatgtatgtggaccaagaattagatattaatcgtttaagtgattatgatgtcgatcac2520attgttccacaaagtttccttaaagacgattcaatagacaataaggtcttaacgcgttct2580gataaaaatcgtggtaaatcggataacgttccaagtgaagaagtagtcaaaaagatgaaa2640aactattggagacaacttctaaacgccaagttaatcactcaacgtaagtttgataattta2700acgaaagctgaacgtggaggtttgagtgaacttgataaagctggttttatcaaacgccaa2760ttggttgaaactcgccaaatcactaagcatgtggcacaaattttggatagtcgcatgaat2820actaaatacgatgaaaatgataaacttattcgagaggttaaagtgattaccttaaaatct2880aaattagtttctgacttccgaaaagatttccaattctataaagtacgtgagattaacaat2940taccatcatgcccatgatgcgtatctaaatgccgtcgttggaactgctttgattaagaaa3000tatccaaaacttgaatcggagtttgtctatggtgattataaagtttatgatgttcgtaaa3060atgattgctaagtctgagcaagaaataggcaaagcaaccgcaaaatatttcttttactct3120aatatcatgaacttcttcaaaacagaaattacacttgcaaatggagagattcgcaaacgc3180cctctaatcgaaactaatggggaaactggagaaattgtctgggataaagggcgagatttt3240gccacagtgcgcaaagtattgtccatgccccaagtcaatattgtcaagaaaacagaagta3300cagacaggcggattctccaaggagtcaattttaccaaaaagaaattcggacaagcttatt3360gctcgtaaaaaagactgggatccaaaaaaatatggtggttttgatagtccaacggtagct3420tattcagtcctagtggttgctaaggtggaaaaagggaaatcgaagaagttaaaatccgtt3480aaagagttactagggatcacaattatggaaagaagttcctttgaaaaaaatccgattgac3540tttttagaagctaaaggatataaggaagttaaaaaagacttaatcattaaactacctaaa3600tatagtctttttgagttagaaaacggtcgtaaacggatgctggctagtgccggagaatta3660caaaaaggaaatgagctggctctgccaagcaaatatgtgaattttttatatttagctagt3720cattatgaaaagttgaagggtagtccagaagataacgaacaaaaacaattgtttgtggag3780cagcataagcattatttagatgagattattgagcaaatcagtgaattttctaagcgtgtt3840attttagcagatgccaatttagataaagttcttagtgcatataacaaacatagagacaaa3900ccaatacgtgaacaagcagaaaatattattcatttatttacgttgacgaatcttggagct3960cccgctgcttttaaatattttgatacaacaattgatcgtaaacgatatacgtctacaaaa4020gaagttttagatgccactcttatccatcaatccatcactggtctttatgaaacacgcatt4080gatttgagtcagctaggaggtgactga4107<210>2<211>4194<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2atggctcccaagaagaagaggaaggtgggcatccacggggtgccagctgctgataaaaaa60tactccattggtctcgacatcggcactaactccgtcggttgggctgtcatcaccgacgaa120tacaaagtgcctagcaagaagttcaaagtcctcggcaacaccgatcgtcactccatcaaa180aaaaatctcattggcgctctgctgttcgacagcggtgagaccgccgaggctactcgtctg240aagcgcactgcccgtcgccgctacactcgccgtaagaaccgtatttgttatctccaagag300attttctccaacgagatggccaaggtcgatgattccttcttccatcgtctggaagagtcc360tttctcgtggaagaggataaaaagcacgaacgccacccgatctttggcaacattgtcgat420gaagtggcttatcacgagaagtacccgaccatctaccatctccgtaagaagctggtggat480tccaccgacaaggctgatctccgcctcatttatctcgctctggctcatatgattaagttc540cgtggtcattttctgatcgaaggcgacctcaacccggacaactccgatgtcgataagctc600ttcatccagctggtccagacctacaaccaactcttcgaggagaacccgatcaatgcctcc660ggcgtcgatgctaaggccattctgagcgctcgtctgtccaaaagccgtcgcctcgagaat720ctcatcgcccagctcccgggcgagaaaaaaaacggtctcttcggtaatctcatcgccctc780tcgctcggcctcaccccgaattttaaatccaatttcgacctcgccgaggacgctaagctc840caactgtccaaggacacttacgacgacgatctggacaatctgctggctcaaatcggcgat900cagtatgccgacctctttctcgccgccaaaaatctctccgatgctatcctcctctccgat960atcctccgcgtcaatactgagatcaccaaggcccctctctccgcctccatgattaagcgc1020tacgacgagcaccatcaagacctcactctgctcaaagccctcgtgcgccagcaactcccg1080gagaagtataaggagatttttttcgatcagtccaagaacggttatgctggctacattgat1140ggtggcgcctcccaagaggaattctataagttcatcaagccgattctcgagaagatggac1200ggcactgaagagctgctcgtgaagctgaaccgtgaggacctcctccgtaagcagcgtact1260ttcgataacggctccatcccgcatcaaattcacctcggcgagctgcatgctattctccgt1320cgccaagaggatttctatccgtttctcaaagataaccgcgagaagatcgagaagatcctc1380acctttcgtatcccgtattacgtgggtcctctcgcccgcggtaattcccgctttgcttgg1440atgacccgcaagagcgaagaaaccatcaccccttggaacttcgaggaagtcgtcgacaaa1500ggtgcttccgcccaatcctttatcgagcgtatgactaactttgacaagaacctccctaat1560gagaaagtgctcccgaaacacagcctcctctacgagtacttcaccgtgtataacgaactc1620actaaggtgaagtatgtcaccgaaggtatgcgtaaaccggccttcctctccggcgaacag1680aaaaaagctatcgtggacctcctcttcaaaaccaatcgcaaggtcaccgtgaagcaactg1740aaggaggattacttcaagaagattgagtgttttgacagcgtcgagatcagcggcgtggaa1800gaccgctttaacgctagcctcggcacttaccacgatctgctcaaaattatcaaggataag1860gatttcctcgacaacgaggagaatgaggacatcctcgaggacatcgtgctcactctcact1920ctcttcgaggaccgcgagatgattgaagagcgtctcaagacctacgcccacctcttcgac1980gacaaggtgatgaagcagctgaagcgccgtcgttacaccggctggggccgtctctcccgt2040aagctgatcaacggcattcgcgataagcagagcggcaaaaccatcctcgactttctcaaa2100agcgacggctttgctaatcgcaacttcatgcagctgatccacgatgactcgctcaccttt2160aagg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